Name: fabrication and characterization of griffithsin-modified fiber scaffolds for prevention of sexually transmitted infections
Uploaded: 2017-10-31T14:00:00
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Estamos gratos ao fundo de herança judaica por excelência para o financiamento desta pesquisa. Agradecemos o Dr. Stuart Williams II para generosamente proporcionando o uso do sistema eletrofiação. Agradecemos também o Dr. Kenneth Palmer para nos fornecer com Griffithsin. Além disso, nós agradecemos Dr. Nobuyuki Matoba e seu laboratório para treinamento que na GRFT ELISA trabalhar.

1. preparação e fabricação de andaime fibra Electrospun atenção: todo trabalho com solventes ou soluções de polímero deve ser executado em uma coifa química . Consulte a folha de dados material da segurança de cada reagente antes de iniciar o protocolo.
<ol><li>Para electrospin uma solução de polímero 3 mL 15% w/w PLGA, pesa 720 mg de 50: 50 poli (ácido lático-co-glicólico) (PLGA; 0,55 a 0,75 dL/g, 31-57 kDa) em um frasco de 10ml cintilação. O volume da soluçã...

Devido a suas estruturas porosas e grandes áreas de superfície, EFs têm encontrado uma variedade de aplicações na área da saúde, um dos quais inclui servir como veículos de entrega terapêutica. Drogas e outros agentes ativos podem ser incorporados dentro de EFs para entrega sintonizável, enquanto produtos biológicos e químicos ligantes podem ser conjugadas com a superfície da fibra para célula específica alvo52 ou biosensing53. Aqui a fabricação de GRFT sup...

O uso do EFs como uma plataforma de entrega tópica tem o potencial para reduzir significativamente as DSTs. Atualmente, existem mais 36 milhões as pessoas que vivem com HIV, com mais 2 milhões de novos casos de relatado em 2015 sozinho1,2. Além disso, o vírus herpes simplex tipo 2 (HSV-2) infecção afeta centenas de milhões de pessoas em todo o mundo e foi mostrado para melhorar a aquisição do HIV por 2-5 vezes3. Devido a esta relação entre infecção por HSV-2 e aquisição do HIV, há um interesse significativo no desenvolvimento de novos agentes ativos que fornecem a proteção simultânea contra várias DSTs. Além disso, o desenvolvimento de novos veículos para melhorar a entrega destes agentes antivirais oferece o potencial para aumentar ainda mais a potência protetora e terapêutica. Para atingir esta meta, EFs têm sido investigados como uma nova plataforma de entrega para reduzir a prevalência de infecções de HIV-1 e HSV-2.
Durante as últimas duas décadas, EFs têm sido extensivamente usados nas áreas de administração de medicamentos e de engenharia de tecidos4. Muitas vezes, polímeros biocompatíveis são selecionados para traduzir facilmente para aplicações terapêuticas. Para fabricar EFs poliméricos, o polímero selecionado é dissolvido em uma solução aquosa ou solvente orgânica, dependendo do grau de polímero hidrofobicidade5. Agentes ativos de interesse são adicionados à solução aquosa ou solvente antes do processo de eletrofiação. A solução de polímero é então aspirada para a seringa e ejectada lentamente enquanto sujeito a uma corrente elétrica. Este processo normalmente resulta em fibras de polímero com folha ou macrostructures cilíndrico (Figura 1) e diâmetros de fibras que variam do micro para nano-escala6. Para aplicações mais terapêuticas, agentes ativos são incorporados dentro das fibras durante o processo de eletrofiação e são liberados da fibra via difusão e a degradação da fibra subsequentes. A taxa de degradação ou de lançamento pode ser alterada usando diferentes tipos de polímeros ou misturas de polímero para estabelecer um perfil do lançamento desejado transmitir propriedades químicas e físicas únicas7e promover o encapsulamento de praticamente qualquer composto. Como tal, EFs provaram ser benéficas para a entrega de drogas de pequenas moléculas e agentes biológicos, incluindo proteínas, peptídeos, oligonucleotides e fatores de crescimento6,8,9.
No campo da prevenção de DST, EFs têm sido recentemente utilizados para incorporar e fornecer sustentada ou inducible-liberação de agentes antivirais10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19. Em um dos primeiros estudos, pH-responsivo fibras foram desenvolvidas para liberar agentes ativos em resposta às mudanças ambientais dentro do trato reprodutivo feminino (FRT), como um método de demanda de proteção contra o HIV-111. Desde então, outros estudos têm investigado a misturas de polímero compostas de óxido de polietileno (PEO) e ácido poli-L-láctico (pilão), para avaliar a liberação sintonizável de agentes antivirais e anticoncepcionais para HIV-1 prevenção e contracepção em vitro 12. estudos adicionais demonstraram a viabilidade de EFs para fornecer o seguinte: prolongada liberação de pequenas moléculas antivirais14, forte e flexível propriedades mecânicas20, arquiteturas de entrega 3-d21 , inibição da penetração de esperma12e a capacidade de mesclar com outras tecnologias de entrega13. Finalmente, o trabalho anterior avaliou fibras poliméricas para a entrega sustentada dos agentes antivirais contra vírus co-infective comuns, o HSV-2 e o HIV-114. Neste estudo, fibras de polímero fornecido atividade complementar para entrega antiviral, mantendo a sua estrutura para até 1 mês e fornecendo uma barreira física a entrada viral. Nesses resultados, foi observado que o EFs podem ser usados para fisicamente e quimicamente impedem a infecção pelo vírus.
Enquanto propriedades de liberação sintonizável EFs poliméricos uma plataforma de entrega atraente para entrega de microbicida, EFs têm sido desenvolvidas em outras aplicações para servir como superfície-modificado andaimes7. EFs têm sido utilizados para imitar a morfologia da matriz extracelular (ECM), muitas vezes agindo como andaimes para melhorar a regeneração celular22e aumentar a sua utilidade em tecido engenharia23,24. Fibras de composto de polímeros tais como poli-ε-Caprolactona (PCL) e pilão ter sido modificado de superfície com proteínas e fatores de crescimento após eletrofiação conferir propriedades como ECM incluindo aumento celular adesão e proliferação de25 , 26. Além disso, foram avaliadas antimicrobianas EFs superfície modificada para impedir o crescimento de bactérias patogénicas específicas27,28. Devido a essa versatilidade e a capacidade de induzir efeitos biológicos, tecnologia EF continua a expandir-se através de uma variedade de campos para fornecer funcionalidade multi mecanicista. Ainda, apesar de sua utilidade em uma diversidade de aplicações, fibras de superfície modificada só recentemente foi exploradas no campo microbicida29.
Em paralelo com o desenvolvimento de novas tecnologias de entrega para prevenir e tratar as DSTs, desenvolveram-se novos terapêutica biológica. Um dos mais promissores candidatos microbicida é o adesiva lectina antiviral, GRFT30. Originalmente derivado de uma espécie de algas vermelhas, GRFT demonstrou atividade como um potente inibidor de HIV, HSV-2, SARS, assim como a hepatite C vírus31,32,33,34, 35 , 36. na verdade, entre inibidores biologicamente baseados, GRFT tem a mais potente atividade anti-HIV, inativando HIV-1 quase imediatamente em cima do contato30, mantendo estabilidade e atividade na presença de meios de cultura de vaginal micróbios para até 10 dias37. Mais recentemente, um gel GRFT 0,1% foi mostrado para proteger camundongos contra o desafio de HSV-2 intravaginal, tornando-se um candidato promissor para a primeira linha de proteção contra o HSV-2 e HIV-132, 38. para HIV especificamente, GRFT inibe infecção por fisicamente ligação gp120 ou terminal de resíduos de N-ligadas glicano manose em superfícies de envelope viral para impedir entrada38,39,40,41 ,,42. Esta inibição é altamente potente, com IC50s se aproximando a 3 ng/mL.43. Além de inibir a infecção pelo HIV, estudos também têm demonstrado que GRFT protege contra infecção por HSV-2, inibindo a propagação de célula para célula dos vírus32. Em todos os casos, GRFT tem demonstrado ser adesivo de partículas virais, enquanto demonstrando alta resistência à desnaturação. Por último, GRFT demonstrou atividade sinérgica com combinações de Tenofovir (TFV) e outros medicamentos antivirais44, tornando-o viável e provavelmente benéfico para administrar conjuntamente com o EFs. As potentes propriedades de GRFT torná-lo um excelente biologicamente baseados antiviral candidato, em que a entrega pode ser melhorada com tecnologia EF.
Utilizando esse conhecimento das propriedades antivirais adesivos e inatas de GRFT, um andaime de fibras poliméricas foi projetado, que integra essas propriedades para fornecer a primeira camada de entrada de vírus inibição29. Encontrando inspiração da forma que o muco cervicovaginal dificulta o transporte de vírus, principalmente através de interações de mucina mucoadhesive, formulamos a hipótese que usando EFs como um andaime e covalentemente, modificando a superfície com GRFT, uma elevada densidade de conjugados a superfície GRFT seria debilitar e inativar o vírus em seu entrypoint45,46,47. Aqui o EFs foram desenvolvidos como um andaime estacionário para fornecer uma base de proteína, viral adesivo-Inactive barreira plataforma. Nós procuramos combinar as propriedades antivirais potentes de GRFT com uma plataforma de polímero biocompatível, modificável e durável, para criar um novo vírus "armadilha".
Para atingir essas metas, fibras compostas de PLGA eram electrospun, e química de EDC-NHS foi usada para modificar posteriormente a superfície EF com GRFT. PLGA serviu como um polímero modelo devido ao uso extensivo em eletrofiação48, combinado com sua biocompatibilidade e custo-efetividade. Além disso, a modificação da superfície explora a grande área de superfície de EFs e fornece uma alternativa útil que pode ser combinada com encapsulamento para maximizar a utilidade de fibra49. Ao contrário dos métodos de encapsulamento tradicional onde somente uma parcela de GRFT está disponível (e apenas transitoriamente, presente no FRT), modificação da superfície pode permitir GRFT manter Bioatividade máxima durante toda a duração do tratamento. Além disso, a incorporação de compostos hidrofílicos como proteínas, pelos métodos tradicionais eletrofiação, pode resultar em menor eficiência de encapsulação e perda de proteína atividade50. Portanto, fibras de superfície-modificado GRFT podem oferecer um método promissor de entrega alternativo que pode ser usado sozinho ou em combinação com eletrofiação para aumentar a proteção contra a infecção de STI.

<table style="border-collapse:collapse;width:728pt" width="970">
	<colgroup>
		<col style="width:344pt" width="459" />
		<col style="width:122pt" width="163" />
		<col style="width:89pt" width="119" />
		<col style="width:172pt" width="229" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:344pt;height:15.75pt" width="459">Poly(Lactide-co-Glycolide) (PLGA) 50:50</td>
			<td class="xl21" style="width:122pt" width="163">Lactel</td>
			<td class="xl21" style="width:89pt" width="119">B6013-2P</td>
			<td class="xl21" style="width:172pt" width="229"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP)</td>
			<td class="xl21">Thermo Scientific&#160;</td>
			<td class="xl21">147541000</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Blunt Dispensing Needle 18g X 1/2</td>
			<td class="xl21">Brico Medical Supplies</td>
			<td class="xl21">BN1815</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl23" height="21" style="height:15.75pt">BD 3mL Syringe Luer-lok tip</td>
			<td class="xl21">VWR</td>
			<td class="xl24">309657</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Parafilm (plastic film)</td>
			<td class="xl21">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl21">P7793</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES Buffer)</td>
			<td class="xl21">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl21">M3671&#160;</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Sodium Chloride</td>
			<td class="xl21">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl21">S7653</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Potassium Chloride</td>
			<td class="xl21">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl21">P9333</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl22" height="21" style="height:15.75pt">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td class="xl21">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl21">S7907</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td class="xl21">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl21">P0662</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Hydroxysuccinimide (NHS)</td>
			<td class="xl21">Thermo Scientific&#160;</td>
			<td class="xl21">24500</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC)</td>
			<td class="xl21">Thermo Scientific&#160;</td>
			<td class="xl21">22980</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">2-Mercaptoethanol</td>
			<td class="xl21">Fisher</td>
			<td class="xl21">BP176</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Griffithsin (GRFT)</td>
			<td class="xl21">Kentucky Bioprocessing</td>
			<td class="xl21">NA</td>
			<td class="xl21">custom made, no product number</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td class="xl21">Milipore</td>
			<td class="xl21">317275</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Polyethylene glycol sorbitan monolaurate (Polysorbate, Tween 20)</td>
			<td class="xl21">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl21">P9416&#160;</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Tris EDTA Buffer</td>
			<td class="xl21">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl21">93283</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates</td>
			<td class="xl21">Thermo Scientific&#160;</td>
			<td class="xl21">3355</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Influenza Hemagglutinin (HA)</td>
			<td class="xl21">Kentucky Bioprocessing</td>
			<td class="xl21">NA</td>
			<td class="xl21">custom made, no product number</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Goat Anti-GRFT (Primary Antibody)</td>
			<td class="xl21">Kentucky Bioprocessing</td>
			<td class="xl21">NA</td>
			<td class="xl21">custom made, no product number</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">&#160;Donkey anti-goat IgG-HRP (Secondary Antibody)</td>
			<td class="xl21">Santa Cruz</td>
			<td class="xl21">2056</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Sure Blue TMB Microwell Peroxidase Substrate</td>
			<td class="xl21">KPL</td>
			<td class="xl21">52-00-00</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication and characterization of griffithsin-modified fiber scaffolds for prevention of sexually transmitted infections

Fibras de Electrospun (EFs) têm sido amplamente utilizadas em uma variedade de aplicações terapêuticas; no entanto, eles só recentemente foram aplicados como uma tecnologia para prevenir e tratar sexualmente transmissíveis (DSTs). Além disso, muitas tecnologias EF focar encapsulando o agente ativo, em relação ao utilizando a superfície para dar biofunctionality. Aqui nós descrevemos um método para fabricar e superfície-modificar poly(lactic-co-glycolic) ácido (PLGA) electrospun fibras, com a lectina antiviral potente Griffithsin (GRFT). PLGA é um polímero aprovado pela FDA que tem sido amplamente utilizado na administração de medicamentos, devido às suas excelentes propriedades químicas e biocompatíveis. GRFT é um natural, potente e segura lectina que possui ampla atividade contra numerosos vírus incluindo o vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1). Quando combinados, fibras GRFT-modificado demonstraram potente inativação do HIV-1 em vitro. Este manuscrito descreve os métodos para fabricar e caracterizar EFs GRFT-modificado. Primeiro, PLGA é electrospun para criar um andaime de fibra. As fibras são posteriormente modificado de superfície com GRFT usando 1-etil - 3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) e N-Hidroxisuccinimida (NHS) química. Microscopia eletrônica (SEM) foi usado para avaliar o tamanho e morfologia da superfície-modificado formulações. Além disso, um gp120 ou hemaglutinina (HA)-ELISA com base pode ser usado para quantificar a quantidade de GRFT conjugada com, bem como dessorção GRFT da superfície da fibra. Este protocolo pode ser aplicado mais amplamente para fabricar fibras que são modificados de superfície com uma variedade de proteínas diferentes.

Morfologia das fibras tem um efeito significativo sobre a capacidade da superfície-modificado EFs para fornecer proteção contra vírus. Embora eletrofiação é um procedimento simples e conveniente, formulações de polímero não-otimizados podem resultar na morfologia da fibra irregular (Figura 5B-C). Alterações em eletrofiação condições que resultam na formação de frisado ou amorfas morfologias semelhantes a esteira, muitas vez...

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Fabrication and Characterization of Griffithsin-modified Fiber Scaffolds for Prevention of Sexually Transmitted Infections

Fabricação e caracterização de andaimes de fibra Griffithsin-modificado para a prevenção de doenças sexualmente transmissíveis

Este manuscrito descreve o procedimento para fabricar e caracterizar as fibras de electrospun de Griffithsin-modificado poli (ácido lático-co-glicólico) que demonstram potente atividade antiviral e adesiva contra infecção por vírus da imunodeficiência humana tipo 1 em vitro. Métodos utilizados para sintetizar, modificar a superfície e caracterizar a morfologia resultante, conjugação, e dessorção de Griffithsin superfície-modificado com fibras são descritos.

Electrospun fibers (EFs) have been widely used in a variety of therapeutic applications; however, they have only recently been applied as a technology to ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Elastomeric PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

PGS elastomérico Andaimes em Engenharia de Tecidos Arterial

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and ...

Bioengenharia

Patient-specific Modeling of the Heart: Estimation of Ventricular Fiber Orientations

Paciente específico Modelagem do Coração: Estimativa de Orientações de fibra ventriculares

Patient-specific  simulations of heart (dys)function aimed at personalizing cardiac therapy are hampered  by the absence of in vivo imaging technology for ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Andaimes auto-relato para cultura de células 3-Dimensional

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Electrospun Nanofiber Scaffolds with Gradations in Fiber Organization

Electrospun nanofibras Andaimes com gradações de Organização Fiber

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible ...

Fabrication and Characterization of a Conformal Skin-like Electronic System for Quantitative, Cutaneous Wound Management

Fabricação e caracterização de um Sistema Eletrônico Conformal-pele como para a gestão quantitativa, Ferida Cutânea

Recent advances in the development of electronic technologies and biomedical devices offer opportunities for non-invasive, quantitative assessment of ...

Fabrication of Mechanically Tunable and Bioactive Metal Scaffolds for Biomedical Applications

Fabricação de Mecanicamente Tunable e Bioativos metal andaimes para aplicações biomédicas

Biometal systems have been widely used for biomedical applications, in particular, as load-bearing materials. However, major challenges are high stiffness ...

Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

Geração de células de camundongo Airway epiteliais derivados de ESC Usando descelularizado Lung Scaffolds

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

Fabrication and Characterization of Optical Tissue Phantoms Containing Macrostructure

Fabricação e caracterização de espectros ópticos de tecido contendo Macrostructure

The rapid development of new optical imaging techniques is dependent on the availability of low-cost, customizable, and easily reproducible standards. By ...

Fabrication of Decellularized Cartilage-derived Matrix Scaffolds

Fabricação de matriz de cartilagem-derivado Decellularized andaimes

Osteochondral defects lack sufficient intrinsic repair capacity to regenerate functionally sound bone and cartilage tissue. To this extent, cartilage ...