Name: subcellular fractionation for erk activation upon mitochondrial-derived peptide treatment
Uploaded: 2017-09-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Subcellular Fractionation for ERK Activation Upon Mitochondrial-derived Peptide Treatment at JoVE.com

Diese Arbeit wurde unterstützt durch eine Ellison/AFAR Postdoctoral Fellowship in Aging Research Program, SJK und ein Glenn Foundation Award und NIH vergibt an PC (1P01AG034906, 1R01GM 090311, 1R01ES 020812). Alle Autoren erscheinen im Film.

1. Peptid Behandlung Zellen <ol><li>Platte 2 Millionen SH-SY5Y oder HEK293 Zellen (2 x 10 6) in einem 10 cm-Speise- und wachsen sie für 2 Tage</li> <li>(Optional) den nächsten Tag, waschen Sie die Zellen mit serumfreien Dulbecco &#39; s geändert Medium (DMEM) Medien einmal Adler und inkubieren Sie mit Serum freie DMEM über Nacht, wenn die Behandlung im Serum freie Medien getan werden muss.</li>
	<li>Am 3. Tag, auflösen S14G-Humanin Peptide in 0,2 µm filtriert, destilliertes Wasser und rekonstruieren s...

<ol>
	<li>Yen, K., Lee, C., Mehta, H., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+role+of+the+mitochondrial-derived+peptide+humanin+in+stress+resistance.">The emerging role of the mitochondrial-derived peptide humanin in stress resistance.</a> J. Mol. Endocrinol. 50 (1), 11-19 (2013).</li><li>Muzumdar, R. H., Huffman, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanin:+a+novel+central+regulator+of+peripheral+insulin+action.">Humanin: a novel central regulator of peripheral insulin action.</a> PloS one. 4 (7), 6334 (2009).</li><li>Lee, C., Yen, K., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanin:+a+harbinger+of+mitochondrial-derived+peptides.">Humanin: a harbinger of mitochondrial-derived peptides.</a> Trends Endocrinol. Metab. 24 (5), 222-228 (2013).</li><li>Kim, S. J., Guerrero, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial-derived+peptide+humanin+activates+the+ERK1/2,+AKT,+and+STAT3+signaling+pathways+and+has+age-dependent+signaling+differences+in+the+hippocampus.">The mitochondrial-derived peptide humanin activates the ERK1/2, AKT, and STAT3 signaling pathways and has age-dependent signaling differences in the hippocampus.</a> Oncotarget. 7 (30), 46899-46912 (2016).</li><li>Ying, G., Iribarren, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanin,+a+newly+identified+neuroprotective+factor,+uses+the+G+protein-coupled+formylpeptide+receptor-like-1+as+a+functional+receptor.">Humanin, a newly identified neuroprotective factor, uses the G protein-coupled formylpeptide receptor-like-1 as a functional receptor.</a> J. Immunol. 172 (11), 7078-7085 (2004).</li><li>Zhang, W., Liu, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAPK+signal+pathways+in+the+regulation+of+cell+proliferation+in+mammalian+cells.">MAPK signal pathways in the regulation of cell proliferation in mammalian cells.</a> Cell Res. 12 (1), 9-18 (2002).</li><li>Huang, C., Jacobson, K., Schaller, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAP+kinases+and+cell+migration.">MAP kinases and cell migration.</a> J. Cell Sci. 117, 4619-4628 (2004).</li><li>Cagnol, S., Chambard, J. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ERK+and+cell+death:+mechanisms+of+ERK-induced+cell+death--apoptosis,+autophagy+and+senescence.">ERK and cell death: mechanisms of ERK-induced cell death--apoptosis, autophagy and senescence.</a> FEBS J. 277 (1), 2-21 (2010).</li><li>Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+and+properties+of+MAPKs.">Differential regulation and properties of MAPKs.</a> Oncogene. 26 (22), 3100-3112 (2007).</li><li>Morrison, D. K., Davis, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+MAP+kinase+signaling+modules+by+scaffold+proteins+in+mammals.">Regulation of MAP kinase signaling modules by scaffold proteins in mammals.</a> Annu. Rev. Cell Dev. 19 (1), 91-118 (2003).</li><li>Wainstein, E., Seger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+subcellular+localization+of+ERK:+mechanisms+of+translocation+and+role+in+various+organelles.">The dynamic subcellular localization of ERK: mechanisms of translocation and role in various organelles.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 39, 15-20 (2016).</li><li>Zehorai, E., Yao, Z., Plotnikov, A., Seger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+subcellular+localization+of+MEK+and+ERK--a+novel+nuclear+translocation+signal+(NTS)+paves+a+way+to+the+nucleus.">The subcellular localization of MEK and ERK--a novel nuclear translocation signal (NTS) paves a way to the nucleus.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 314 (2), 213-220 (2010).</li><li>Kolch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinating+ERK/MAPK+signalling+through+scaffolds+and+inhibitors.">Coordinating ERK/MAPK signalling through scaffolds and inhibitors.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (11), 827-837 (2005).</li><li>Horbinski, C., Chu, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinase+signaling+cascades+in+the+mitochondrion:+a+matter+of+life+or+death.">Kinase signaling cascades in the mitochondrion: a matter of life or death.</a> Free Radic. Biol. Med. 38 (1), 2-11 (2005).</li><li>Aebersold, D. M., Shaul, Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+signal-regulated+kinase+1c+(ERK1c),+a+novel+42-kilodalton+ERK,+demonstrates+unique+modes+of+regulation,+localization.">Extracellular signal-regulated kinase 1c (ERK1c), a novel 42-kilodalton ERK, demonstrates unique modes of regulation, localization.</a> Mol Cell Biol. 24 (22), 10000-10015 (2004).</li><li>Zhu, J. -. H., Guo, F., Shelburne, J., Watkins, S., Chu, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+phosphorylated+ERK/MAP+kinases+to+mitochondria+and+autophagosomes+in+Lewy+body+diseases.">Localization of phosphorylated ERK/MAP kinases to mitochondria and autophagosomes in Lewy body diseases.</a> Brain Pathol. 13 (4), 473-481 (2003).</li><li>Cobb, L. J., Lee, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+occurring+mitochondrial-derived+peptides+are+age-dependent+regulators+of+apoptosis,+insulin+sensitivity,+and+inflammatory+markers.">Naturally occurring mitochondrial-derived peptides are age-dependent regulators of apoptosis, insulin sensitivity, and inflammatory markers.</a> Aging. 8 (4), 796-809 (2016).</li><li>Ihle, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Stat+family+in+cytokine+signaling.">The Stat family in cytokine signaling.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 13 (2), 211-217 (2001).</li><li>Xu, Y. S., Liang, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT3+Undergoes+Acetylation-dependent+Mitochondrial+Translocation+to+Regulate+Pyruvate+Metabolism.">STAT3 Undergoes Acetylation-dependent Mitochondrial Translocation to Regulate Pyruvate Metabolism.</a> Sci. Rep. 6 (1), 39517 (2016).</li><li>You, L., Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+STAT3+in+autophagy.">The role of STAT3 in autophagy.</a> Autophagy. 11 (5), 729-739 (2015).</li><li>Hashimoto, Y., Niikura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detailed+characterization+of+neuroprotection+by+a+rescue+factor+humanin+against+various+Alzheimer's+disease-relevant+insults.">Detailed characterization of neuroprotection by a rescue factor humanin against various Alzheimer's disease-relevant insults.</a> The J Neurosci. 21 (23), 9235-9245 (2001).</li><li>Ying, G., Iribarren, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanin,+a+newly+identified+neuroprotective+factor,+uses+the+G+protein-coupled+formylpeptide+receptor-like-1+as+a+functional+receptor.">Humanin, a newly identified neuroprotective factor, uses the G protein-coupled formylpeptide receptor-like-1 as a functional receptor.</a> J. Immunol. 172 (11), 7078-7085 (2004).</li><li>Hashimoto, Y., Kurita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanin+inhibits+apoptosis+in+pituitary+tumor+cells+through+several+signaling+pathways+including+NF-&#954;B+activation.">Humanin inhibits apoptosis in pituitary tumor cells through several signaling pathways including NF-&#954;B activation.</a> Mol. Biol. Cell. 20 (12), 2864-2873 (2009).</li></ol>

Hier haben wir bewiesen, dass Humanin Peptid-vermittelten ERK1/2 Aktivierung in zwei verschiedenen Zelltypen tritt und die subzelluläre Lokalisation des aktivierten ERK1/2, je nach Bedingungen (z.B., Portion Peptid, Zeitpunkt und Zelle abweichen kann Typ). Es hat sich gezeigt, dass Humanin Signale durch zwei verschiedene Rezeptoren22,23, die die Unterschiede bei der Signalisierung zwischen den beiden Zelllinien sowie die Forderung nach verschiedenen Dos...

Neue Studien zeigen, dass Mitochondrien-abgeleitete Peptide (MDPs) in Cytoprotection und Stoffwechsel1,2,3eine wichtige Rolle spielen. Verständnis der Signalweg Transduktion in Anwesenheit von MDPs gibt uns Einblick in den Mechanismus, durch den MDPs verschiedene Funktionen modulieren. Die erste identifizierte MDP, Humanin, wurde gezeigt, dass extrazelluläre Signal-regulierte Kinase 1/2 (ERK1/2) erhöhen Phosphorylierung durch seinen Rezeptor binden4,5. Die nachgeschaltete Wirkung von ERK1/2 Aktivierung ist jedoch immer noch unentdecktes.
Die Kaskade ERK1/2 dient als ein wesentlicher Vermittler in einer Vielzahl von zellulären Prozessen einschließlich Proliferation, Zellmigration, Zellstoffwechsel, überleben und Apoptose6,7,8. Um alle zu orchestrieren sind diese unterschiedliche zelluläre Prozesse, die Aktivität und subzelluläre Lokalisation der ERK1/2 durch Phosphatasen und Gerüst Proteine9,10streng reguliert. Neben Post-translationale Modifikation regelt dynamische pendelt von ERK1/2 auch die Signalisierung Funktion, Bewegung und Spezifität11,-12. ERK1/2 ist in erster Linie in der Zellflüssigkeit13lokalisiert. Eine Reihe von Ankern und Gerüst Proteine helfen ERK1/2 im Zellskelett Elemente auf der Oberfläche der Organellen oder diffuse im Zytoplasma13beibehalten. Nach Stimulation ERK1/2 ist phosphoryliert und wird aus seiner Verankerung Proteine dissoziiert, so dass die Translokation von ERK1/2 zu anderen subzelluläre Kompartimente, einschließlich der Zellkern, Mitochondrien, Golgi und Lysosomen14, 15 , 16.
Humanin ist zwar bekannt, die ERK1/2 Signalweg aktivieren, wird die Aktivierung von ERK1/2 nur in der Ergebniszelle Lysates beobachtet. Wie zuvor beschrieben, da ERK1/2 subzelluläre Lokalisation eine entscheidende Rolle für die nachgeschaltete Wirkung, die Analyse der subzellulären Lokalisierung und der gesamten spielt ist phosphorylierten ERK1/2 notwendig, ein umfassendes Verständnis der Humanin-induzierten ERK1/2 Aktivierung und die Aktivierung der nachgeschalteten Ziele.
Um das Ziel Organellen der aktivierten ERK1/2 zu verstehen, wurde subzellulären Fraktionierung gefolgt von westlichen beflecken für phosphorylierten ERK1/2 durchgeführt. Diese Methode kann leicht implementiert werden, da es standard Laborgeräten und Reagenzien verwendet. Die isolierten subzelluläre Kompartimente sind von hoher Reinheit, sodass die Ergebnisse unkompliziert auszulegen. Immunostaining ERK1/2 kann zu ähnliche Ergebnissen führen. Allerdings sind bestimmte subzelluläre Kompartimente relativ schwer zu visualisieren und erfordern besondere Fixierung und Permeabilisierung Methoden. ERK1/2 Ebenen subzelluläre Kompartimente sind unterschiedlich, und diese Variante könnte dazu führen, dass falsch positive und falsch negative Signale bei der Betrachtung der gesamten Zelle Lysates. Daher gibt ein Immunoblot mit isolierten subzelluläre Kompartimente uns ein besseres Verständnis der ERK1/2 Lokalisierung.
Die Vielseitigkeit der Methode ermöglicht Änderungen des Protokolls zum anderen Stimulanzien, einschließlich andere MDPs oder Translokation der andere Signalmoleküle wie STAT3 auswirkt. Vor kurzem sind entdeckten kleinen Humanin-wie Peptide (SHLPs) von 16 s rRNA Region codiert, wo Humanin codiert, und sie haben ähnliche aber unterschiedliche Eigenschaften im Vergleich zu HN17. Z. B. aktivieren SHLP2 und SHLP3 ERK1/2 nach 8 h obwohl Humanin ERK1/2 innerhalb von 5 min. Prüfungs-subzelluläre Lokalisation der ERK1/2 als Reaktion auf unterschiedliche Peptiden aktiviert uns ein besseres Verständnis für die Biologie dieser Peptide geben wird. Anzeichen dafür zeigte, dass die subzelluläre Lokalisation der Signalmoleküle in deren nachgelagerten Auswirkungen eine entscheidende Rolle spielt. Zum Beispiel STAT3 ist traditionell bekannt, vor allem in der Zellflüssigkeit in ruhende Zellen lokalisiert werden, und dann translocates es in den Zellkern, Genexpression in Reaktion auf Zytokine18zu aktivieren. STAT3 auch translocates zu Mitochondrien und regelt die TCA-Zyklus und ATP Produktion19. Zur Regelung der Autophagie moduliert verschiedene subzelluläre Lokalisation des STAT3 Autophagie in verschiedenen Weisen20. Z. B. nuklearen STAT3 transcriptionally Autophagie-Genen reguliert und fungiert als ein Autophagie-Modulator. Zytoplasmatischen STAT3 hemmt konstitutiv Autophagie durch Interaktion mit Autophagie Signalmoleküle. Mitochondriale STAT3 hemmt und verhindert Mitophagy durch oxidativen Stress induzierten Autophagie zu unterdrücken. Daher ist diese subzelluläre Fach Isolationsmethode entscheidend für das Verständnis der Rolle der anderen Signalisierung Moleküle sowie ERK1/2.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>p44/42 MAPK (ERK1/2)</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>9102</td>
			<td>Dilution 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phospho-p44/42 MAPK (ERK1/2)(Thr202/Tyr204)</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>4370</td>
			<td>Dilution 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lamin B1</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>12586</td>
			<td>Nuclear Marker, Dilution 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>5174</td>
			<td>Cytoplasmic marker, Dilution 1:2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tom20</td>
			<td>Santa cruz</td>
			<td>SC-17764</td>
			<td>Mitochondria marker, Dilution 1:2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Rabbit-HRP conjugated</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>7074</td>
			<td>Dilution 1:30,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis and Extraction Buffer</td>
			<td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td>
			<td>89900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Culture Dish</td>
			<td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td>
			<td>12556002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HNG peptide</td>
			<td>Genescript</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25mm sylinge filter</td>
			<td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td>
			<td>09-719A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-512F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Scraper</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>353085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt&#8482; Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)</td>
			<td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td>
			<td>78440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thomas Pestle Tissue Grinder Assemblies with Smooth Pestles</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>3432S90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-16% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>4561104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-Blot Module</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>1658030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Transfer System</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>1704150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>1704272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clarity Western ECL Blotting Substrates</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>1705060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restore Western blot stripping buffer</td>
			<td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td>
			<td>21059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator, Medel: FB120</td>
			<td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td>
			<td>695320-07-12</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subcellular fractionation for erk activation upon mitochondrial-derived peptide treatment

Mitochondriale-abgeleitete Peptide (MDPs) sind eine neue Klasse von Peptiden, die durch kleine offene Lesung Rahmen in anderen bekannten Genen des mitochondrialen Genoms kodiert sind. MDPs haben eine Vielzahl von biologischen Wirkungen wie Neuronen vor Apoptose zu schützen, Verbesserung der Stoffwechselmarker und schützt Zellen vor Chemotherapie. Humanin war der erste MDP, entdeckt zu werden und ist die am meisten untersuchte Peptid unter der MDP-Familie. Die Membranrezeptoren und nachgeschaltete Signalwege der Humanin wurden sorgfältig charakterisiert. Zusätzliche MDPs wie MOTS-c und SHLP1-6 haben vor kurzem entdeckt und die Signalisierung Mechanismen müssen noch geklärt werden. Hier beschreiben wir eine Zelle Kultur, die Methode, um die Funktion dieser Peptide bestimmen. Insbesondere erlauben Zelle Fraktionierung Techniken in Kombination mit westlichen beflecken für die quantitative Bestimmung der Aktivierung und Translokation von wichtiges Signalmolekül. Zwar gibt es andere Methoden der Zelle Fraktionierung, ist wie hier beschrieben eine einfache und unkomplizierte Methode. Diese Methoden können verwendet werden, den Wirkmechanismus dieser Peptide und andere Therapeutika weiter aufzuklären.

Bei der hier vorgestellten Verfahren behandelten wir HEK293 und SH-SY5Y Zellen mit 1 μm und 100 μm S14G-Humanin, ein potenter Humanin analoge21, jeweils in komplette Medien für die angegebenen Zeiträume (Abbildung 1A , Abbildung 1 B). wir dann total und phosphorylierten Form von ERK1/2 am Thr202/Tyr204 Gesamt-Protein Extrakte untersucht. S14G-Hum...

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Subcellular Fractionation for ERK Activation Upon Mitochondrial-derived Peptide Treatment

Dieses Protokoll beschreibt, wie Zellen mit mitochondrialen-abgeleitete Peptide stimulieren und die Signalisierung Kaskade und Lokalisierung von Phospho-Proteine zu beurteilen.

Subzellulären Fraktionierung für ERK-Aktivierung bei der mitochondrialen abgeleitet Peptid-Behandlung

Mitochondrial-derived peptides (MDPs) are a new class of peptides that are encoded by small open reading frames within other known genes of the ...

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