Name: subcellular fractionation for erk activation upon mitochondrial-derived peptide treatment
Uploaded: 2017-09-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Subcellular Fractionation for ERK Activation Upon Mitochondrial-derived Peptide Treatment at JoVE.com

यह काम उंर बढ़ने अनुसंधान कार्यक्रम में SJK को एक एलिसन/अफर Postdoctoral फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था, और एक ग्लेन फाउंडेशन पुरस्कार और पीसी के लिए NIH अनुदान (1P01AG034906, 1R01GM ०९०३११, 1R01ES ०२०८१२) । सभी लेखक फिल्म में दिखाई देते हैं ।

1. कोशिकाओं को पेप्टाइड उपचार <ol> <li> प्लेट २,०००,००० श-SY5Y या HEK293 कोशिकाओं (2 x 10 6 ) एक 10 सेमी डिश में और उन्हें 2 दिनों के लिए विकसित </li> <li> (वैकल्पिक) अगले दिन, कोशिकाओं को सीरम मुक्त Dulbecco & #39; s संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) ?...

<ol>
	<li>Yen, K., Lee, C., Mehta, H., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+role+of+the+mitochondrial-derived+peptide+humanin+in+stress+resistance.">The emerging role of the mitochondrial-derived peptide humanin in stress resistance.</a> J. Mol. Endocrinol. 50 (1), 11-19 (2013).</li><li>Muzumdar, R. H., Huffman, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanin:+a+novel+central+regulator+of+peripheral+insulin+action.">Humanin: a novel central regulator of peripheral insulin action.</a> PloS one. 4 (7), 6334 (2009).</li><li>Lee, C., Yen, K., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanin:+a+harbinger+of+mitochondrial-derived+peptides.">Humanin: a harbinger of mitochondrial-derived peptides.</a> Trends Endocrinol. Metab. 24 (5), 222-228 (2013).</li><li>Kim, S. J., Guerrero, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial-derived+peptide+humanin+activates+the+ERK1/2,+AKT,+and+STAT3+signaling+pathways+and+has+age-dependent+signaling+differences+in+the+hippocampus.">The mitochondrial-derived peptide humanin activates the ERK1/2, AKT, and STAT3 signaling pathways and has age-dependent signaling differences in the hippocampus.</a> Oncotarget. 7 (30), 46899-46912 (2016).</li><li>Ying, G., Iribarren, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanin,+a+newly+identified+neuroprotective+factor,+uses+the+G+protein-coupled+formylpeptide+receptor-like-1+as+a+functional+receptor.">Humanin, a newly identified neuroprotective factor, uses the G protein-coupled formylpeptide receptor-like-1 as a functional receptor.</a> J. Immunol. 172 (11), 7078-7085 (2004).</li><li>Zhang, W., Liu, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAPK+signal+pathways+in+the+regulation+of+cell+proliferation+in+mammalian+cells.">MAPK signal pathways in the regulation of cell proliferation in mammalian cells.</a> Cell Res. 12 (1), 9-18 (2002).</li><li>Huang, C., Jacobson, K., Schaller, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAP+kinases+and+cell+migration.">MAP kinases and cell migration.</a> J. Cell Sci. 117, 4619-4628 (2004).</li><li>Cagnol, S., Chambard, J. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ERK+and+cell+death:+mechanisms+of+ERK-induced+cell+death--apoptosis,+autophagy+and+senescence.">ERK and cell death: mechanisms of ERK-induced cell death--apoptosis, autophagy and senescence.</a> FEBS J. 277 (1), 2-21 (2010).</li><li>Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+and+properties+of+MAPKs.">Differential regulation and properties of MAPKs.</a> Oncogene. 26 (22), 3100-3112 (2007).</li><li>Morrison, D. K., Davis, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+MAP+kinase+signaling+modules+by+scaffold+proteins+in+mammals.">Regulation of MAP kinase signaling modules by scaffold proteins in mammals.</a> Annu. Rev. Cell Dev. 19 (1), 91-118 (2003).</li><li>Wainstein, E., Seger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+subcellular+localization+of+ERK:+mechanisms+of+translocation+and+role+in+various+organelles.">The dynamic subcellular localization of ERK: mechanisms of translocation and role in various organelles.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 39, 15-20 (2016).</li><li>Zehorai, E., Yao, Z., Plotnikov, A., Seger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+subcellular+localization+of+MEK+and+ERK--a+novel+nuclear+translocation+signal+(NTS)+paves+a+way+to+the+nucleus.">The subcellular localization of MEK and ERK--a novel nuclear translocation signal (NTS) paves a way to the nucleus.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 314 (2), 213-220 (2010).</li><li>Kolch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinating+ERK/MAPK+signalling+through+scaffolds+and+inhibitors.">Coordinating ERK/MAPK signalling through scaffolds and inhibitors.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (11), 827-837 (2005).</li><li>Horbinski, C., Chu, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinase+signaling+cascades+in+the+mitochondrion:+a+matter+of+life+or+death.">Kinase signaling cascades in the mitochondrion: a matter of life or death.</a> Free Radic. Biol. Med. 38 (1), 2-11 (2005).</li><li>Aebersold, D. M., Shaul, Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+signal-regulated+kinase+1c+(ERK1c),+a+novel+42-kilodalton+ERK,+demonstrates+unique+modes+of+regulation,+localization.">Extracellular signal-regulated kinase 1c (ERK1c), a novel 42-kilodalton ERK, demonstrates unique modes of regulation, localization.</a> Mol Cell Biol. 24 (22), 10000-10015 (2004).</li><li>Zhu, J. -. H., Guo, F., Shelburne, J., Watkins, S., Chu, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+phosphorylated+ERK/MAP+kinases+to+mitochondria+and+autophagosomes+in+Lewy+body+diseases.">Localization of phosphorylated ERK/MAP kinases to mitochondria and autophagosomes in Lewy body diseases.</a> Brain Pathol. 13 (4), 473-481 (2003).</li><li>Cobb, L. J., Lee, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+occurring+mitochondrial-derived+peptides+are+age-dependent+regulators+of+apoptosis,+insulin+sensitivity,+and+inflammatory+markers.">Naturally occurring mitochondrial-derived peptides are age-dependent regulators of apoptosis, insulin sensitivity, and inflammatory markers.</a> Aging. 8 (4), 796-809 (2016).</li><li>Ihle, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Stat+family+in+cytokine+signaling.">The Stat family in cytokine signaling.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 13 (2), 211-217 (2001).</li><li>Xu, Y. S., Liang, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT3+Undergoes+Acetylation-dependent+Mitochondrial+Translocation+to+Regulate+Pyruvate+Metabolism.">STAT3 Undergoes Acetylation-dependent Mitochondrial Translocation to Regulate Pyruvate Metabolism.</a> Sci. Rep. 6 (1), 39517 (2016).</li><li>You, L., Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+STAT3+in+autophagy.">The role of STAT3 in autophagy.</a> Autophagy. 11 (5), 729-739 (2015).</li><li>Hashimoto, Y., Niikura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detailed+characterization+of+neuroprotection+by+a+rescue+factor+humanin+against+various+Alzheimer's+disease-relevant+insults.">Detailed characterization of neuroprotection by a rescue factor humanin against various Alzheimer's disease-relevant insults.</a> The J Neurosci. 21 (23), 9235-9245 (2001).</li><li>Ying, G., Iribarren, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanin,+a+newly+identified+neuroprotective+factor,+uses+the+G+protein-coupled+formylpeptide+receptor-like-1+as+a+functional+receptor.">Humanin, a newly identified neuroprotective factor, uses the G protein-coupled formylpeptide receptor-like-1 as a functional receptor.</a> J. Immunol. 172 (11), 7078-7085 (2004).</li><li>Hashimoto, Y., Kurita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanin+inhibits+apoptosis+in+pituitary+tumor+cells+through+several+signaling+pathways+including+NF-&#954;B+activation.">Humanin inhibits apoptosis in pituitary tumor cells through several signaling pathways including NF-&#954;B activation.</a> Mol. Biol. Cell. 20 (12), 2864-2873 (2009).</li></ol>

यहाँ, हम प्रदर्शन किया कि humanin पेप्टाइड-मध्यस्थता ERK1/2 सक्रियण दो भिन्न प्रकार के कक्ष में होता है, और सक्रिय ERK1/2 के उपसेलुलर स्थानीयकरण शर्तों के आधार पर भिन्न हो सकते हैं (जैसे, खुराक पेप्टाइड, समय बिंद?...

उभरते अध्ययनों से पता चलता है कि mitochondrial-व्युत्पन्न पेप्टाइड्स (MDPs) cytoprotection और चयापचय में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं1,2,3. MDPs की उपस्थिति में संकेत transduction मार्ग को समझना हमें तंत्र में अंतर्दृष्टि देता है जिसके द्वारा MDPs विभिंन कार्यों को मिलाना । पहली पहचान एचडीपी, humanin, extracellular संकेत को बढ़ाने के लिए दिखाया गया है-विनियमित कळेनासे 1/2 (ERK1/2) इसके रिसेप्टर बाइंडिंग4,5के माध्यम से फास्फारिलीकरण. हालांकि, ERK1/2 सक्रियण के बहाव के प्रभाव अभी भी पता लगाया है ।
ERK1/2 झरना प्रसार, सेल प्रवास, सेलुलर चयापचय, अस्तित्व, और apoptosis6,7,8सहित सेलुलर प्रक्रियाओं की एक किस्म में एक आवश्यक मध्यस्थ के रूप में कार्य करता है । इन सभी अलग सेलुलर प्रक्रियाओं आर्केस्ट्रा, ERK1/2 के गतिविधि और सेलुलर स्थानीयकरण कसकर phosphatases और पाड़ प्रोटीन9,10द्वारा विनियमित रहे हैं । अनुवाद के बाद संशोधन के अलावा, गतिशील गढ़शंकर के ERK1/2 भी अपने संकेतन समारोह, गतिविधि, और विशिष्टता11,12को नियंत्रित करता है । ERK1/2 cytosol13में मुख्य रूप से स्थानीयकृत है । एंकरिंग और पाड़ प्रोटीन का एक सेट cytoskeletal तत्वों में ERK1/2 बनाए रखने में मदद, organelles की सतह पर, या कोशिका13में फैलाना । उत्तेजना पर, ERK1/2 phosphorylated है और अपने लंगर प्रोटीन से असंबद्ध हो जाता है, ERK1/2 के नाभिक, mitochondria, Golgi, और lysosomes सहित अंय उपसेलुलर डिब्बों को translocation की अनुमति14, 15 , 16.
हालांकि humanin ERK1/2 संकेतन मार्ग सक्रिय करने के लिए जाना जाता है, ERK1/2 के सक्रियण केवल कुल सेल lysates में मनाया जाता है । जैसा कि पहले वर्णित है, के बाद से ERK1/2 उपसेलुलर स्थानीयकरण इसके बहाव प्रभाव में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, दोनों के उपसेलुलर स्थानीयकरण और phosphorylated ERK1/2 के कुल स्तर का विश्लेषण एक व्यापक समझ प्रदान करने के लिए आवश्यक है humanin-प्रेरित ERK1/2 सक्रियण और अनुप्रवाह लक्ष्य के सक्रियकरण ।
सक्रिय ERK1/2 के लक्ष्य organelles को समझने के लिए, उपसेलुलर आंशिक phosphorylated ERK1/2 के लिए पश्चिमी सोख्ता द्वारा पीछा किया गया था । यह विधि आसानी से लागू किया जा सकता है के रूप में यह मानक प्रयोगशाला उपकरण और रिएजेंट का इस्तेमाल । पृथक उपसेलुलर डिब्बों उच्च शुद्धता के हैं, की अनुमति परिणाम स्पष्ट रूप से व्याख्या की है । ERK1/2 के Immunostaining समान परिणाम उत्पंन कर सकते हैं । हालांकि, कुछ उपसेलुलर डिब्बों को कल्पना और विशेष निर्धारण और permeabilization तरीकों की आवश्यकता के लिए अपेक्षाकृत कठिन हैं । ERK1/2 स्तर उपसेलुलर डिब्बों में बदलती हैं, और इस भिंनता झूठी सकारात्मक और झूठी नकारात्मक संकेतों के कारण जब पूरे सेल lysates देख सकता है । इसलिए, एक immunoblot पृथक उपसेलुलर डिब्बों का उपयोग कर हमें ERK1/2 स्थानीयकरण की एक बेहतर समझ देता है ।
इस विधि की बहुमुखी प्रतिभा को अंय MDPs या STAT3 जैसे अंय संकेत अणुओं के translocation सहित अंय उत्तेजक के प्रभाव की जांच करने के लिए प्रोटोकॉल के संशोधनों को सक्षम बनाता है । हाल ही में छोटे humanin की खोज की तरह पेप्टाइड्स (SHLPs) 16S rRNA क्षेत्र जहां humanin इनकोडिंग है से इनकोडिंग रहे हैं, और वे इसी तरह लेकिन अलग गुण है हेमवती17की तुलना में । उदाहरण के लिए, SHLP2 और SHLP3 सक्रिय ERK1/2 के बाद 8 ज हालांकि humanin 5 मिनट के भीतर ERK1/2 के ERK1/अलग पेप्टाइड के उत्तर में हमें इन पेप्टाइड्स के जीव विज्ञान के एक बेहतर समझ दे देंगे. उभरते सबूत से पता चला है कि संकेत अणुओं के सेलुलर स्थानीयकरण उनके बहाव के प्रभाव में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । उदाहरण के लिए, STAT3 परंपरागत रूप से कोशिकाओं को आराम में cytosol में स्थानीयकृत जाना जाता है, और फिर यह नाभिक में translocates के जवाब में जीन अभिव्यक्ति को सक्रिय करने के लिए साइटोकिंस18. STAT3 ने टीसीए चक्र और एटीपी प्रोडक्शन19को mitochondria और विनियमित करने का भी translocates । autophagy विनियमन के बारे में, STAT3 के विभिन्न उपसेलुलर स्थानीयकरण विभिन्न तरीकों से20में autophagy संग्राहक. उदाहरण के लिए, नाभिकीय STAT3 transcriptionally autophagy-संबंधी जीन को नियंत्रित करता है और एक autophagy संग्राहक के रूप में कार्य करती है । Cytoplasmic STAT3 constitutively autophagy संकेत अणुओं के साथ बातचीत से autophagy रोकता है । Mitochondrial STAT3 रोकता है और oxidative तनाव प्रेरित autophagy दबा द्वारा mitophagy रोकता है । इसलिए, इस उपसेलुलर डिब्बा अलगाव विधि अंय संकेत अणुओं की भूमिका को समझने के लिए महत्वपूर्ण है और साथ ही ERK1/

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>p44/42 MAPK (ERK1/2)</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>9102</td>
			<td>Dilution 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phospho-p44/42 MAPK (ERK1/2)(Thr202/Tyr204)</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>4370</td>
			<td>Dilution 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lamin B1</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>12586</td>
			<td>Nuclear Marker, Dilution 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>5174</td>
			<td>Cytoplasmic marker, Dilution 1:2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tom20</td>
			<td>Santa cruz</td>
			<td>SC-17764</td>
			<td>Mitochondria marker, Dilution 1:2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Rabbit-HRP conjugated</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>7074</td>
			<td>Dilution 1:30,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis and Extraction Buffer</td>
			<td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td>
			<td>89900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Culture Dish</td>
			<td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td>
			<td>12556002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HNG peptide</td>
			<td>Genescript</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25mm sylinge filter</td>
			<td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td>
			<td>09-719A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-512F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Scraper</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>353085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt&#8482; Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)</td>
			<td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td>
			<td>78440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thomas Pestle Tissue Grinder Assemblies with Smooth Pestles</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>3432S90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-16% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>4561104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-Blot Module</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>1658030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Transfer System</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>1704150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>1704272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clarity Western ECL Blotting Substrates</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>1705060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restore Western blot stripping buffer</td>
			<td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td>
			<td>21059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator, Medel: FB120</td>
			<td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td>
			<td>695320-07-12</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subcellular fractionation for erk activation upon mitochondrial-derived peptide treatment

Mitochondrial-व्युत्पन्न पेप्टाइड्स (MDPs) Mitochondrial जीनोम के अन्य ज्ञात जीन के भीतर छोटे खुले पढ़ने फ्रेम द्वारा इनकोडिंग रहे हैं कि पेप्टाइड्स के एक नए वर्ग के हैं. MDPs इस तरह के apoptosis से न्यूरॉन्स की रक्षा के रूप में जैविक प्रभाव की एक विस्तृत विविधता है, चयापचय मार्कर में सुधार, और कीमोथेरेपी से कोशिकाओं की रक्षा. Humanin पहले एचडीपी की खोज की थी और एचडीपी परिवार के बीच सबसे अधिक अध्ययन पेप्टाइड है । झिल्ली रिसेप्टर्स और बहाव humanin के मार्ग संकेत ध्यान से विशेषता है । अतिरिक्त MDPs जैसे MOTS-सी और SHLP1-६ का हाल ही में पता चला है और सिगनल तंत्र का अभी तक आविर्भाव हुआ है. यहाँ हम एक सेल संस्कृति आधारित विधि का वर्णन करने के लिए इन पेप्टाइड्स के समारोह का निर्धारण. विशेष रूप से, पश्चिमी सोख्ता के साथ संयोजन में सेल भिन्नीकरण तकनीक सक्रियण और महत्वपूर्ण संकेतन अणु के translocation के मात्रात्मक निर्धारण के लिए अनुमति देते हैं । जबकि वहां कोशिका अंश के अंय तरीके हैं, एक यहां वर्णित एक आसान और सरल तरीका है । इन विधियों का उपयोग इन पेप्टाइड्स और अन्य चिकित्सीय एजेंटों की कार्रवाई के तंत्र को आगे स्पष्ट करने के लिए किया जा सकता है ।

यहां प्रस्तुत प्रक्रिया का प्रयोग, हम 1 माइक्रोन और १०० माइक्रोन S14G-humanin, एक शक्तिशाली humanin अनुरूप21के साथ HEK293 और एसएच-SY5Y कोशिकाओं का इलाज किया, क्रमशः, संकेत दिया समय अवधि के लिए पूरा मीडि?...

Watch this Scientific Journal Video about Subcellular Fractionation for ERK Activation Upon Mitochondrial-derived Peptide Treatment at JoVE.com

Subcellular Fractionation for ERK Activation Upon Mitochondrial-derived Peptide Treatment

इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे mitochondrial-व्युत्पन्न पेप्टाइड्स के साथ कोशिकाओं को उत्तेजित और संकेतन झरना और phospho-प्रोटीन के स्थानीयकरण का आकलन करने के लिए.

Mitochondrial-व्युत्पन्न पेप्टाइड उपचार पर ERK सक्रियण के लिए उपसेलुलर अंश

Mitochondrial-derived peptides (MDPs) are a new class of peptides that are encoded by small open reading frames within other known genes of the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

और Xenopus laevis अंडे की तैयारी Fractionation अर्क

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

आण्विक Fractionation वजन के आधार के लिए तरल चरण रिकवरी के साथ GELFREE 8100 Fractionation प्रणाली का उपयोग

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

पक्षपाती और गैर पक्षपाती स्तनधारी कोशिकाओं की स्वस्थानी Subcellular Fractionation

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

RhoC GTPase Activation Assay

RhoC GTPase सक्रियकरण परख

RhoC GTPase has 91% homology to RhoA GTPase.  Because of its prevalence in cells, many reagents and techniques for RhoA GTPase have been developed.  ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

Mutagenesis और आयन चैनल के कार्यात्मक विश्लेषण Heterologously स्तनधारी कोशिकाओं में व्यक्त

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

तुलनात्मक प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए चयापचय लेबल और झिल्ली Fractionation<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; सस्पेंशन सेल संस्कृतियों

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करते रहते चूहों में इमेजिंग subcellular संरचनाओं के लिए intravital माइक्रोस्कोपी

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Imaging Cell Membrane Injury and Subcellular Processes Involved in Repair

इमेजिंग सेल झिल्ली चोट और मरम्मत में शामिल Subcellular प्रक्रियाओं

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

तरीके में पेशी के subcellular डिब्बों का आकलन करने के लिए<em&gt; सी. एलिगेंस</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...