Name: subcellular fractionation for erk activation upon mitochondrial-derived peptide treatment
Uploaded: 2017-09-25T15:00:00
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Questo lavoro è stato supportato da un Ellison/AFAR Postdoctoral Fellowship nel programma di ricerca di invecchiamento di SJK, e un premio della Fondazione Glenn e NIH concede a PC (1P01AG034906, 1R01GM 090311, 1R01ES 020812). Tutti gli autori compaiono nel film.

1. peptide trattamento alle cellule <ol><li>piastra 2 milioni di SH-SY5Y o cellule HEK293 (2 x 10 6) in 10 cm piatto e coltivano per 2 giorni</li> <li>(opzionale) il prossimo giorno, lavare le cellule con Dulbecco privo di siero &#39; s Modified Eagle media Medium (DMEM) una volta e incubare con siero DMEM gratuito durante la notte se il trattamento deve essere fatto in media liberi del siero.</li>
	<li>Il giorno 3, sciogliere S14G-humanin peptidi in 0,2 µm filtrata, acqua distillata e rinvenire come soluz...

<ol>
	<li>Yen, K., Lee, C., Mehta, H., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+role+of+the+mitochondrial-derived+peptide+humanin+in+stress+resistance.">The emerging role of the mitochondrial-derived peptide humanin in stress resistance.</a> J. Mol. Endocrinol. 50 (1), 11-19 (2013).</li><li>Muzumdar, R. H., Huffman, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanin:+a+novel+central+regulator+of+peripheral+insulin+action.">Humanin: a novel central regulator of peripheral insulin action.</a> PloS one. 4 (7), 6334 (2009).</li><li>Lee, C., Yen, K., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanin:+a+harbinger+of+mitochondrial-derived+peptides.">Humanin: a harbinger of mitochondrial-derived peptides.</a> Trends Endocrinol. Metab. 24 (5), 222-228 (2013).</li><li>Kim, S. J., Guerrero, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial-derived+peptide+humanin+activates+the+ERK1/2,+AKT,+and+STAT3+signaling+pathways+and+has+age-dependent+signaling+differences+in+the+hippocampus.">The mitochondrial-derived peptide humanin activates the ERK1/2, AKT, and STAT3 signaling pathways and has age-dependent signaling differences in the hippocampus.</a> Oncotarget. 7 (30), 46899-46912 (2016).</li><li>Ying, G., Iribarren, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanin,+a+newly+identified+neuroprotective+factor,+uses+the+G+protein-coupled+formylpeptide+receptor-like-1+as+a+functional+receptor.">Humanin, a newly identified neuroprotective factor, uses the G protein-coupled formylpeptide receptor-like-1 as a functional receptor.</a> J. Immunol. 172 (11), 7078-7085 (2004).</li><li>Zhang, W., Liu, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAPK+signal+pathways+in+the+regulation+of+cell+proliferation+in+mammalian+cells.">MAPK signal pathways in the regulation of cell proliferation in mammalian cells.</a> Cell Res. 12 (1), 9-18 (2002).</li><li>Huang, C., Jacobson, K., Schaller, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAP+kinases+and+cell+migration.">MAP kinases and cell migration.</a> J. Cell Sci. 117, 4619-4628 (2004).</li><li>Cagnol, S., Chambard, J. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ERK+and+cell+death:+mechanisms+of+ERK-induced+cell+death--apoptosis,+autophagy+and+senescence.">ERK and cell death: mechanisms of ERK-induced cell death--apoptosis, autophagy and senescence.</a> FEBS J. 277 (1), 2-21 (2010).</li><li>Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+and+properties+of+MAPKs.">Differential regulation and properties of MAPKs.</a> Oncogene. 26 (22), 3100-3112 (2007).</li><li>Morrison, D. K., Davis, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+MAP+kinase+signaling+modules+by+scaffold+proteins+in+mammals.">Regulation of MAP kinase signaling modules by scaffold proteins in mammals.</a> Annu. Rev. Cell Dev. 19 (1), 91-118 (2003).</li><li>Wainstein, E., Seger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+subcellular+localization+of+ERK:+mechanisms+of+translocation+and+role+in+various+organelles.">The dynamic subcellular localization of ERK: mechanisms of translocation and role in various organelles.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 39, 15-20 (2016).</li><li>Zehorai, E., Yao, Z., Plotnikov, A., Seger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+subcellular+localization+of+MEK+and+ERK--a+novel+nuclear+translocation+signal+(NTS)+paves+a+way+to+the+nucleus.">The subcellular localization of MEK and ERK--a novel nuclear translocation signal (NTS) paves a way to the nucleus.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 314 (2), 213-220 (2010).</li><li>Kolch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinating+ERK/MAPK+signalling+through+scaffolds+and+inhibitors.">Coordinating ERK/MAPK signalling through scaffolds and inhibitors.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (11), 827-837 (2005).</li><li>Horbinski, C., Chu, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinase+signaling+cascades+in+the+mitochondrion:+a+matter+of+life+or+death.">Kinase signaling cascades in the mitochondrion: a matter of life or death.</a> Free Radic. Biol. Med. 38 (1), 2-11 (2005).</li><li>Aebersold, D. M., Shaul, Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+signal-regulated+kinase+1c+(ERK1c),+a+novel+42-kilodalton+ERK,+demonstrates+unique+modes+of+regulation,+localization.">Extracellular signal-regulated kinase 1c (ERK1c), a novel 42-kilodalton ERK, demonstrates unique modes of regulation, localization.</a> Mol Cell Biol. 24 (22), 10000-10015 (2004).</li><li>Zhu, J. -. H., Guo, F., Shelburne, J., Watkins, S., Chu, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+phosphorylated+ERK/MAP+kinases+to+mitochondria+and+autophagosomes+in+Lewy+body+diseases.">Localization of phosphorylated ERK/MAP kinases to mitochondria and autophagosomes in Lewy body diseases.</a> Brain Pathol. 13 (4), 473-481 (2003).</li><li>Cobb, L. J., Lee, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+occurring+mitochondrial-derived+peptides+are+age-dependent+regulators+of+apoptosis,+insulin+sensitivity,+and+inflammatory+markers.">Naturally occurring mitochondrial-derived peptides are age-dependent regulators of apoptosis, insulin sensitivity, and inflammatory markers.</a> Aging. 8 (4), 796-809 (2016).</li><li>Ihle, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Stat+family+in+cytokine+signaling.">The Stat family in cytokine signaling.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 13 (2), 211-217 (2001).</li><li>Xu, Y. S., Liang, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT3+Undergoes+Acetylation-dependent+Mitochondrial+Translocation+to+Regulate+Pyruvate+Metabolism.">STAT3 Undergoes Acetylation-dependent Mitochondrial Translocation to Regulate Pyruvate Metabolism.</a> Sci. Rep. 6 (1), 39517 (2016).</li><li>You, L., Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+STAT3+in+autophagy.">The role of STAT3 in autophagy.</a> Autophagy. 11 (5), 729-739 (2015).</li><li>Hashimoto, Y., Niikura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detailed+characterization+of+neuroprotection+by+a+rescue+factor+humanin+against+various+Alzheimer's+disease-relevant+insults.">Detailed characterization of neuroprotection by a rescue factor humanin against various Alzheimer's disease-relevant insults.</a> The J Neurosci. 21 (23), 9235-9245 (2001).</li><li>Ying, G., Iribarren, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanin,+a+newly+identified+neuroprotective+factor,+uses+the+G+protein-coupled+formylpeptide+receptor-like-1+as+a+functional+receptor.">Humanin, a newly identified neuroprotective factor, uses the G protein-coupled formylpeptide receptor-like-1 as a functional receptor.</a> J. Immunol. 172 (11), 7078-7085 (2004).</li><li>Hashimoto, Y., Kurita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanin+inhibits+apoptosis+in+pituitary+tumor+cells+through+several+signaling+pathways+including+NF-&#954;B+activation.">Humanin inhibits apoptosis in pituitary tumor cells through several signaling pathways including NF-&#954;B activation.</a> Mol. Biol. Cell. 20 (12), 2864-2873 (2009).</li></ol>

Qui, abbiamo dimostrato che humanin peptide-ha mediato l'attivazione di ERK1/2 si verifica a due diversi tipi di cellule, e la localizzazione subcellulare di attivazione di ERK1/2 può essere diversa a seconda delle condizioni (ad es., dose di peptide, punto del tempo e delle cellule tipo). È stato dimostrato che humanin segnali attraverso due diversi recettori22,23, che possono spiegare le differenze nella segnalazione tra le due linee cellulari come p...

Gli studi emergenti indicano che peptidi mitocondriali-derivati (MDPs) svolgono i ruoli importanti nel metabolismo e nella citoprotezione1,2,3. Capire la via di trasduzione del segnale in presenza di MDPs ci dà comprensione nel meccanismo da cui MDPs modulano varie funzioni. Il primo MDP identificati, humanin, ha dimostrato di aumentare la chinasi segnale-regolata extracellulare 1/2 (ERK1/2) fosforilazione attraverso suo recettore vincolante4,5. Tuttavia, l'effetto a valle dell'attivazione di ERK1/2 è ancora aggiunto.
La cascata di ERK1/2 serve come un mediatore essenziale in una varietà di processi cellulari compreso proliferazione, migrazione cellulare, il metabolismo cellulare, sopravvivenza ed apoptosi6,7,8. Ad per orchestrare tutti questi processi cellulari distinti, l'attività e la localizzazione subcellulare di ERK1/2 sono strettamente regolate da fosfatasi e impalcatura proteine9,10. Oltre a modificazione post-traduzionale, la dinamica di marcia di ERK1/2 inoltre regola la sua segnalazione funzione, attività e specificità11,12. ERK1/2 è localizzato principalmente nel citosol13. Un insieme delle proteine di ancoraggio e impalcatura aiutano a trattenere ERK1/2 in elementi del citoscheletro, sulla superficie degli organelli, o diffusa nel citoplasma13. Stimolazione, ERK1/2 è fosforilato e viene dissociato dalle sue proteine di ancoraggio, che permette la traslocazione di ERK1/2 ad altri compartimenti subcellulari, tra cui il nucleo, mitocondri, Golgi e lisosomi14, 15 , 16.
Anche se humanin è noto per attivare la via di segnalazione di ERK1/2, l'attivazione di ERK1/2 è osservata solo nei lisati cellulari totali. Come descritto in precedenza, poiché la localizzazione subcellulare di ERK1/2 svolge un ruolo cruciale nel suo effetto a valle, l'analisi della localizzazione subcellulare e i livelli totali di fosforilata ERK1/2 è necessario fornire una comprensione globale di attivazione di ERK1/2 indotta da humanin e l'attivazione di obiettivi a valle.
Per comprendere gli organelli bersaglio di attivazione di ERK1/2, è stato effettuato il frazionamento subcellulare seguito mediante western blotting per fosforilata ERK1/2. Questo metodo può essere facilmente implementato come sfrutta i reagenti e la normale attrezzatura da laboratorio. I compartimenti subcellulari isolati sono di elevata purezza, permettendo i risultati semplicemente essere interpretati. Immunostaining di ERK1/2 può produrre risultati simili. Tuttavia, alcuni compartimenti subcellulari sono relativamente difficili da visualizzare e richiedono metodi di fissazione e permeabilizzazione speciali. ERK1/2 livelli variano in compartimenti subcellulari, e questa variazione potrebbe causare falsi positivi e falsi negativi segnali quando guardando lisati di cellule intere. Pertanto, un immunoblot utilizzando compartimenti subcellulari isolati ci dà una migliore comprensione della localizzazione di ERK1/2.
La versatilità del metodo consente modifiche del protocollo per studiare gli effetti di altri stimolanti tra cui altri MDPs o la traslocazione di altre molecole di segnalazione come STAT3. Recentemente scoperti piccoli peptidi simil-humanin (SHLPs) sono codificati dalla regione di rRNA 16S dove humanin viene codificato, e hanno proprietà simili ma distinti rispetto a HN17. Ad esempio, SHLP2 e SHLP3 attiva ERK1/2 dopo 8 h sebbene humanin attiva ERK1/2 entro 5 min Examining localizzazione subcellulare di ERK1/2 in risposta a diversi peptidi ci darà una migliore comprensione della biologia di questi peptidi. La prova emergente ha mostrato che la localizzazione subcellulare delle molecole di segnalazione svolge un ruolo cruciale nei loro effetti a valle. Per esempio, STAT3, tradizionalmente, è noto per essere localizzato principalmente nel citosol nelle cellule a riposo, e quindi trasloca nel nucleo per attivare l'espressione genica in risposta a citochine18. STAT3 inoltre trasloca ai mitocondri e regola il ciclo del TCA e ATP produzione19. Per quanto riguarda il regolamento di autofagia, diversa localizzazione subcellulare di STAT3 modula l'autofagia in vari modi20. Ad esempio, STAT3 nucleare trascrizionalmente regola geni autophagy-relative e agisce come un modulatore di autofagia. STAT3 citoplasmatica inibisce costitutivamente l'autofagia interagendo con l'autofagia molecole di segnalazione. STAT3 mitocondriale inibisce e impedisce mitophagy sopprimendo l'autofagia indotto da stress ossidativo. Pertanto, questo metodo di isolamento compartimento subcellulare è cruciale per comprendere il ruolo di altre molecole di segnalazione, nonché il ERK1/2.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>p44/42 MAPK (ERK1/2)</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>9102</td>
			<td>Dilution 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phospho-p44/42 MAPK (ERK1/2)(Thr202/Tyr204)</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>4370</td>
			<td>Dilution 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lamin B1</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>12586</td>
			<td>Nuclear Marker, Dilution 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>5174</td>
			<td>Cytoplasmic marker, Dilution 1:2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tom20</td>
			<td>Santa cruz</td>
			<td>SC-17764</td>
			<td>Mitochondria marker, Dilution 1:2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Rabbit-HRP conjugated</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>7074</td>
			<td>Dilution 1:30,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis and Extraction Buffer</td>
			<td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td>
			<td>89900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Culture Dish</td>
			<td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td>
			<td>12556002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HNG peptide</td>
			<td>Genescript</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25mm sylinge filter</td>
			<td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td>
			<td>09-719A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-512F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Scraper</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>353085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt&#8482; Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)</td>
			<td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td>
			<td>78440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thomas Pestle Tissue Grinder Assemblies with Smooth Pestles</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>3432S90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-16% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>4561104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-Blot Module</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>1658030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Transfer System</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>1704150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>1704272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clarity Western ECL Blotting Substrates</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>1705060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restore Western blot stripping buffer</td>
			<td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td>
			<td>21059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator, Medel: FB120</td>
			<td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td>
			<td>695320-07-12</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subcellular fractionation for erk activation upon mitochondrial-derived peptide treatment

Peptidi mitocondriale-derivati (MDPs) sono una nuova classe di peptidi che sono codificati da piccolo open reading frame all'interno di altri noti geni del genoma mitocondriale. MDPs hanno un'ampia varietà di effetti biologici quali proteggere i neuroni dall'apoptosi, migliorare gli indicatori metabolici e proteggere le cellule da chemioterapia. Humanin era la MDP prima di essere scoperto ed è il peptide più studiato tra la famiglia MDP. I recettori di membrana e vie di segnalazione a valle di humanin sono state caratterizzate con attenzione. MDPs aggiuntive quali MOTS-c e SHLP1-6 sono stati scoperti più di recente e i meccanismi di segnalazione devono ancora essere delucidato. Qui descriviamo un metodo di coltura basata di cella per determinare la funzione di questi peptidi. In particolare, tecniche di frazionamento cellulare in combinazione con macchiarsi occidentale consentono la determinazione quantitativa dell'attivazione e spostamento della molecola di segnalazione importante. Mentre ci sono altri metodi di frazionamento cellulare, quello qui descritto è un metodo facile e semplice. Questi metodi possono essere utilizzati più ulteriormente per delucidare il meccanismo di azione di questi peptidi e altri agenti terapeutici.

Utilizzando la procedura qui presentata, abbiamo trattato le cellule HEK293 e SH-SY5Y con 1 μM e 100 μM S14G-humanin, un potente humanin analogico21, rispettivamente, a completare la media per i periodi di tempo indicato (Figura 1A e Figura 1 B). abbiamo poi esaminato la forma totale e fosforilata di ERK1/2 al Thr202/Tyr204 da estratti di proteina ...

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Subcellular Fractionation for ERK Activation Upon Mitochondrial-derived Peptide Treatment

Questo protocollo descrive come stimolare le cellule con peptidi derivati mitocondriale e valutare la cascata di segnalazione e localizzazione di fosfo-proteine.

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