Name: subcellular fractionation for erk activation upon mitochondrial-derived peptide treatment
Uploaded: 2017-09-25T15:00:00
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이 일 권, 노화 연구 프로그램에 엘리슨/멀리 박사 친교에 의해 지원 되었다 그리고 글렌 재단 수상 및 NIH PC에 부여 (1P01AG034906, 1R01GM 1R01ES 090311 020812). 모든 저자는 영화에 표시 됩니다.

1. 셀에 펩 티 드 치료 <ol><li>2 백만 SH-SY5Y 접시 또는 10 cm로 HEK293 세포 (2 x 10 6) 요리와 2 일 동안 그들을 성장</li> <li>(선택 사항) 다음 날, 셀 세럼 무료 Dulbecco 씻어 &#39; s 수정 매체 (DMEM) 미디어를 한 번 독수리 및 혈 청 치료 혈 청 무료 미디어에서 일을 해야 하는 경우 무료 DMEM 하룻밤 함께 품 어.</li>
	<li>3 일에 0.2 µ m 필터링, 증류수, 고 1 m m 재고 솔루션으로 그들을 다시 구성에서 S14G human...

<ol>
	<li>Yen, K., Lee, C., Mehta, H., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+role+of+the+mitochondrial-derived+peptide+humanin+in+stress+resistance.">The emerging role of the mitochondrial-derived peptide humanin in stress resistance.</a> J. Mol. Endocrinol. 50 (1), 11-19 (2013).</li><li>Muzumdar, R. H., Huffman, D. 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J., Guerrero, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial-derived+peptide+humanin+activates+the+ERK1/2,+AKT,+and+STAT3+signaling+pathways+and+has+age-dependent+signaling+differences+in+the+hippocampus.">The mitochondrial-derived peptide humanin activates the ERK1/2, AKT, and STAT3 signaling pathways and has age-dependent signaling differences in the hippocampus.</a> Oncotarget. 7 (30), 46899-46912 (2016).</li><li>Ying, G., Iribarren, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanin,+a+newly+identified+neuroprotective+factor,+uses+the+G+protein-coupled+formylpeptide+receptor-like-1+as+a+functional+receptor.">Humanin, a newly identified neuroprotective factor, uses the G protein-coupled formylpeptide receptor-like-1 as a functional receptor.</a> J. 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Cell Biol. 39, 15-20 (2016).</li><li>Zehorai, E., Yao, Z., Plotnikov, A., Seger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+subcellular+localization+of+MEK+and+ERK--a+novel+nuclear+translocation+signal+(NTS)+paves+a+way+to+the+nucleus.">The subcellular localization of MEK and ERK--a novel nuclear translocation signal (NTS) paves a way to the nucleus.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 314 (2), 213-220 (2010).</li><li>Kolch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinating+ERK/MAPK+signalling+through+scaffolds+and+inhibitors.">Coordinating ERK/MAPK signalling through scaffolds and inhibitors.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (11), 827-837 (2005).</li><li>Horbinski, C., Chu, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinase+signaling+cascades+in+the+mitochondrion:+a+matter+of+life+or+death.">Kinase signaling cascades in the mitochondrion: a matter of life or death.</a> Free Radic. Biol. Med. 38 (1), 2-11 (2005).</li><li>Aebersold, D. M., Shaul, Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+signal-regulated+kinase+1c+(ERK1c),+a+novel+42-kilodalton+ERK,+demonstrates+unique+modes+of+regulation,+localization.">Extracellular signal-regulated kinase 1c (ERK1c), a novel 42-kilodalton ERK, demonstrates unique modes of regulation, localization.</a> Mol Cell Biol. 24 (22), 10000-10015 (2004).</li><li>Zhu, J. -. H., Guo, F., Shelburne, J., Watkins, S., Chu, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+phosphorylated+ERK/MAP+kinases+to+mitochondria+and+autophagosomes+in+Lewy+body+diseases.">Localization of phosphorylated ERK/MAP kinases to mitochondria and autophagosomes in Lewy body diseases.</a> Brain Pathol. 13 (4), 473-481 (2003).</li><li>Cobb, L. J., Lee, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+occurring+mitochondrial-derived+peptides+are+age-dependent+regulators+of+apoptosis,+insulin+sensitivity,+and+inflammatory+markers.">Naturally occurring mitochondrial-derived peptides are age-dependent regulators of apoptosis, insulin sensitivity, and inflammatory markers.</a> Aging. 8 (4), 796-809 (2016).</li><li>Ihle, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Stat+family+in+cytokine+signaling.">The Stat family in cytokine signaling.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 13 (2), 211-217 (2001).</li><li>Xu, Y. S., Liang, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT3+Undergoes+Acetylation-dependent+Mitochondrial+Translocation+to+Regulate+Pyruvate+Metabolism.">STAT3 Undergoes Acetylation-dependent Mitochondrial Translocation to Regulate Pyruvate Metabolism.</a> Sci. Rep. 6 (1), 39517 (2016).</li><li>You, L., Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+STAT3+in+autophagy.">The role of STAT3 in autophagy.</a> Autophagy. 11 (5), 729-739 (2015).</li><li>Hashimoto, Y., Niikura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detailed+characterization+of+neuroprotection+by+a+rescue+factor+humanin+against+various+Alzheimer's+disease-relevant+insults.">Detailed characterization of neuroprotection by a rescue factor humanin against various Alzheimer's disease-relevant insults.</a> The J Neurosci. 21 (23), 9235-9245 (2001).</li><li>Ying, G., Iribarren, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanin,+a+newly+identified+neuroprotective+factor,+uses+the+G+protein-coupled+formylpeptide+receptor-like-1+as+a+functional+receptor.">Humanin, a newly identified neuroprotective factor, uses the G protein-coupled formylpeptide receptor-like-1 as a functional receptor.</a> J. Immunol. 172 (11), 7078-7085 (2004).</li><li>Hashimoto, Y., Kurita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanin+inhibits+apoptosis+in+pituitary+tumor+cells+through+several+signaling+pathways+including+NF-&#954;B+activation.">Humanin inhibits apoptosis in pituitary tumor cells through several signaling pathways including NF-&#954;B activation.</a> Mol. Biol. Cell. 20 (12), 2864-2873 (2009).</li></ol>

여기, 우리가 보여주는 두 가지 서로 다른 세포 유형, 발생 하는 humanin 펩 티 드-중재 ERK1/2 활성화 및 활성화 ERK1/2의 subcellular 지 방화 (예를 들면, 펩 티 드, 시간 및 셀의 조건에 따라 다를 수 있습니다. 입력) 합니다. 그것은 보였다 그 humanin 두 개의 다른 수용 체22,23, humanin의 다른 복용량에 대 한 요구 사항 뿐 아니라 두 셀 라인 신호에 차이점을 ?...

신흥 연구는 미토 콘 드리 아에서 파생 된 펩 티 드 (MDPs) cytoprotection 및 대사1,2,3중요 한 역할을 재생을 보여줍니다. 신호 변환 통로 MDPs의 존재 이해는 MDPs는 다양 한 기능을 조절 하는 메커니즘에 대 한 통찰력 제공. 첫 번째 확인 된 민주당 humanin, extracellular 신호 통제 키 1/2 (ERK1/2)을 증가 표시 되었습니다4,5바인딩 그것의 수용 체를 통해 인 산화. 그러나, ERK1/2 활성화의 다운스트림 효과 여전히 underexplored.
ERK1/2 캐스케이드 다양 한 확산, 셀 이동, 세포 물질 대사, 생존, 및 apoptosis6,,78을 포함 하 여 세포질 과정에에서 필수적인 중재자 역할을 합니다. 모든을 통합 하는 것을이 다른 세포질 과정, 활동 및 ERK1/2의 subcellular 지 방화는 단단히 통제 가수분해 및 비 계 단백질9,10. 포스트 번역 상 수정 뿐 아니라 그것의 신호 기능, 활동, 및 특이성11,12조절 또한 ERK1/2의 동적 였죠. ERK1/2 주로 cytosol13에서 지역화 됩니다. 고정 및 비 계 단백질의 세트, 세포의 표면 또는 세포질13확산에 cytoskeletal 요소에 ERK1/2을 유지 도움이. 자극, ERK1/2은 phosphorylated 고 핵, 미토 콘 드리 아, 골, 리소좀14, 등 다른 subcellular 구획에 ERK1/2의 전 수 있도록 그 정박 단백질에서 해리 된다 15 , 16.
비록 humanin는 ERK1/2 신호 전달 경로 활성화, ERK1/2의 활성화만 총 세포 lysates에서 관찰 됩니다. ERK1/2 subcellular 지 방화의 다운스트림 효과, 모두 subcellular 지 방화의 분석 및의 총 수준에 중요 한 역할 때문에 이전에 설명한 대로 phosphorylated ERK1/2는 포괄적인 이해를 제공 하는 데 필요한 ERK1/2 활성화 humanin 유도 및 다운스트림 목표의 활성화.
활성화 ERK1/2의 대상 세포를 이해 하려면 뒤에 phosphorylated ERK1/2 서 부 럽 subcellular 분류 수행 되었다. 이 방법은 표준 실험실 장비 및 시 약 사용으로 쉽게 구현할 수 있습니다. 격리 된 subcellular 구획 straightforwardly 해석 결과 허용 하는 고 순도의 있습니다. ERK1/2 Immunostaining의 비슷한 결과 얻을 수 있습니다. 그러나, 특정 subcellular 구획은 상대적으로 시각화 하 고 특별 한 고정 및 permeabilization 방법이 필요로 어렵습니다. ERK1/2 레벨 subcellular 구획에 변화 하 고 전체 세포 lysates 볼 때이 변화 거짓 긍정과 거짓 부정적인 신호를 발생할 수 있습니다. 따라서, 격리 된 subcellular 구획을 사용 하 여 한 immunoblot 우리가 ERK1/2 지역화의 더 나은 이해를 제공 합니다.
방법의 다양성에 다른 MDPs 또는 STAT3 같은 다른 신호 분자의 전 좌를 포함 하 여 다른 자극의 효과 조사 하는 프로토콜의 수정 수 있습니다. 최근 발견 된 작은 humanin와 같은 펩 티 드 (SHLPs) 16S rRNA 지구 humanin 인코딩 및 HN17에 비해 유사 하지만 개별 속성에서 인코딩됩니다. 예를 들어 SHLP2 및 SHLP3에 8 h humanin 검토 다른 펩 티 드에 대 한 응답에서 ERK1/2의 subcellular 지 방화 5 분 이내 ERK1/2를 활성화 하는 있지만 우리가 줄 것 이다 이러한 펩 티이 드의 생물학의 더 나은 이해 후 ERK1/2를 활성화 해야 합니다. 증거를 신흥 신호 분자의 subcellular 지 방화의 다운스트림 효과에 중요 한 역할을 담당 했다. 예를 들어, STAT3 전통적으로 주로 휴식 셀에 cytosol에서 지역화는 알려져 있으며 다음 응답 cytokines18으로 유전자 발현을 활성화 하는 핵으로 translocates. 또한 STAT3 미토 콘 드리 아를 translocates 하 고 TCA 주기 및 ATP 생산19. Autophagy 규제에 관한 STAT3의 다른 subcellular 지 방화 다양 한 방법으로20에서 autophagy를 조절 한다. 예를 들어 핵 STAT3 transcriptionally autophagy 관련 유전자를 조절 하 고 autophagy 변조기 역할. 세포질 STAT3 constitutively autophagy 신호 분자와 상호 작용 하 여 autophagy를 억제. 미토 콘 드 리아 STAT3 억제 하 고 산화 스트레스 유발 autophagy를 억제 하 여 mitophagy를 방지 합니다. 따라서,이 subcellular 구획 격리 방법은 다른 신호 분자로 ERK1/2의 역할을 이해 하기 위한 중요 한입니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>p44/42 MAPK (ERK1/2)</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>9102</td>
			<td>Dilution 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phospho-p44/42 MAPK (ERK1/2)(Thr202/Tyr204)</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>4370</td>
			<td>Dilution 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lamin B1</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>12586</td>
			<td>Nuclear Marker, Dilution 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>5174</td>
			<td>Cytoplasmic marker, Dilution 1:2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tom20</td>
			<td>Santa cruz</td>
			<td>SC-17764</td>
			<td>Mitochondria marker, Dilution 1:2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Rabbit-HRP conjugated</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>7074</td>
			<td>Dilution 1:30,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis and Extraction Buffer</td>
			<td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td>
			<td>89900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Culture Dish</td>
			<td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td>
			<td>12556002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HNG peptide</td>
			<td>Genescript</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25mm sylinge filter</td>
			<td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td>
			<td>09-719A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-512F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Scraper</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>353085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt&#8482; Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)</td>
			<td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td>
			<td>78440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thomas Pestle Tissue Grinder Assemblies with Smooth Pestles</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>3432S90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-16% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>4561104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-Blot Module</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>1658030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Transfer System</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>1704150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>1704272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clarity Western ECL Blotting Substrates</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>1705060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restore Western blot stripping buffer</td>
			<td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td>
			<td>21059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator, Medel: FB120</td>
			<td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td>
			<td>695320-07-12</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subcellular fractionation for erk activation upon mitochondrial-derived peptide treatment

미토 콘 드리 아에서 파생 된 펩 티 드 (MDPs) 미토 콘 드리 아 게놈의 다른 알려진된 유전자 내의 작은 열려있는 독서 프레임으로 인코딩됩니다 펩 티 드의 새로운 클래스는. MDPs는 apoptosis에서 신경 세포를 보호, 개선 신진 대사 마커, 화학요법에서 세포를 보호 등 생물학적 효과의 다양 한이 있다. Humanin 발견 첫 번째 민주당 고 민주당 가족 중 가장 공부 펩 티 드 이다. 막 수용 체와 humanin의 하류 신호 경로 신중 하 게 특징 되었습니다. 태그 c와 SHLP1-6 등 추가 MDPs 최근에 발견 되었습니다 고 신호 메커니즘 아직 해명 될. 여기이 펩 티이 드의 기능을 결정 하는 셀 문화 기반 방법을 설명 합니다. 특히, 서 부 럽 함께에서 셀 분류 기법 활성화의 양적 결정 및 중요 한 신호 분자의 전 좌 허용. 세포 분별 법의 다른 방법이 있다, 하는 동안 여기에 설명 된 하나 쉽고 간단한 방법입니다. 이러한 방법은 더 명료이 펩 티이 드 및 다른 치료제의 행동의 메커니즘을 사용할 수 있습니다.

여기에 제시 된 절차를 사용 하 여, 우리 1 μ M와 100 μ M HEK293와 SH SY5Y 셀 치료 S14G-humanin, 강력한 humanin 아날로그21, 각각, 완료 미디어 (그림 1 및 그림 1 지정 된 기간에 대 한 B). 우리는 다음 세202총 단백질 추출 물에서 /Tyr204 에서 ERK1/2의 총 및 phosphorylated 형태 검사. S14G...

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Subcellular Fractionation for ERK Activation Upon Mitochondrial-derived Peptide Treatment

이 프로토콜에는 미토 콘 드리 아에서 파생 된 펩 티 드와 세포 신호 캐스케이드 인 단백질의 지 방화를 평가 하는 방법을 설명 합니다.

미토 콘 드리 아에서 파생 된 펩 티 드 치료 시 ERK 활성화에 대 한 subcellular 분류

Mitochondrial-derived peptides (MDPs) are a new class of peptides that are encoded by small open reading frames within other known genes of the ...

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