Name: methods for analyzing the impacts of natural uranium on in vitro osteoclastogenesis
Uploaded: 2018-01-30T13:00:00
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Les auteurs tiens à remercier Chantal Cros pour assistance technique utile. Cette recherche a été financée par des subventions de la « Commissariat à l’Energie Atomique et aux énergies Alternatives » (URANOs - Programme Transversal de Toxicologie du CEA et RERPC CEA-AREVA) et de l’ANR (toxicité de l’URanium : approche multi-niveaux de biominéralisation processus en os, ANR-16-CE34-0003). Ce travail a été également soutenu par l’Université de Nice Sophia-Antipolis et le CNRS.

1. préparation de la Solution d’acétate d’uranyle
<ol><li>Pour préparer 2 mL d’une solution d’acétate d’uranyle 100 mM, ajouter 85 mg d’acétate d’uranyle (UO2(OCOCH3)2, 2 H2O ; M = 424 g.mol-1) à l’état solide dans un tube en plastique de 5 mL.</li>
	<li>Ajouter 2 mL d’eau distillée dans le tube en plastique et fixez-le avec un bouchon en plastique.</li>
	<li>Agiter vigoureusement le tube jusqu'à la dissolution totale du solide. Mettre l...

<ol>
	<li>Keith, S., Faroon, O., Roney, N., Scinicariello, F., Wilbur, S., Ingerman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicological+profile+for+uranium.">Toxicological profile for uranium.</a> Agency for Toxic Substances and Disease Registry. , (2013).</li><li>Ballou, J. E., Gies, R. A., Case, A. C., Haggard, D. L., Buschbom, R. L., Ryan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deposition+and+early+disposition+of+inhaled+233UO2(NO3)2+and+232UO2(NO3)2+in+the+rat.">Deposition and early disposition of inhaled 233UO2(NO3)2 and 232UO2(NO3)2 in the rat.</a> Health Phys. 51 (6), 755-771 (1986).</li><li>Kathren, R. L., McInroy, J. F., Moore, R. H., Dietert, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uranium+in+the+tissues+of+an+occupationally+exposed+individual.">Uranium in the tissues of an occupationally exposed individual.</a> Health Phys. 57 (1), 17-21 (1989).</li><li>Kurttio, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+effects+of+uranium+in+drinking+water.">Renal effects of uranium in drinking water.</a> Environ.Health Perspect. 110 (4), 337-342 (2002).</li><li>Leggett, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basis+for+the+ICRP's+age-specific+biokinetic+model+for+uranium.">Basis for the ICRP's age-specific biokinetic model for uranium.</a> Health Phys. 67 (6), 589-610 (1994).</li><li>Vidaud, C., Bourgeois, D., Meyer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+as+target+organ+for+metals:+the+case+of+f-elements.">Bone as target organ for metals: the case of f-elements.</a> Chem. Res. Toxicol. 25 (6), 1161-1175 (2012).</li><li>Arzuaga, X., Gehlhaus, M., Strong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modes+of+action+associated+with+uranium+induced+adverse+effects+in+bone+function+and+development.">Modes of action associated with uranium induced adverse effects in bone function and development.</a> Toxicol. Lett. 236 (2), 123-130 (2015).</li><li>Ikeda, K., Takeshita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+osteoclast+differentiation+and+function+in+skeletal+homeostasis.">The role of osteoclast differentiation and function in skeletal homeostasis.</a> J. Biochem. 159 (1), 1-8 (2016).</li><li>Teiltelbaum, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+osteoclast+and+its+unique+cytoskeleton.">The osteoclast and its unique cytoskeleton.</a> Ann N Y Acad Sci. 1240, 14-17 (2011).</li><li>Nesbitt, S. A., Horton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+of+matrix+collagens+through+bone-resorbing+osteoclasts.">Trafficking of matrix collagens through bone-resorbing osteoclasts.</a> Science. 276 (5310), 266-269 (1997).</li><li>Salo, J., Lehenkari, P., Mulari, M., Metsikko, K., Vaananen, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+osteoclast+bone+resorption+products+by+transcytosis.">Removal of osteoclast bone resorption products by transcytosis.</a> Science. 276 (5310), 270-273 (1997).</li><li>Pierrefite-Carle, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+natural+uranium+on+the+UMR-106+osteoblastic+cell+line:+impairment+of+the+autophagic+process+as+an+underlying+mechanism+of+uranium+toxicity.">Effect of natural uranium on the UMR-106 osteoblastic cell line: impairment of the autophagic process as an underlying mechanism of uranium toxicity.</a> Arch. Toxicol. 91 (4), 1903-1914 (2017).</li><li>Ubios, A. M., Guglielmotti, M. B., Steimetz, T., Cabrini, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uranium+inhibits+bone+formation+in+physiologic+alveolar+bone+modeling+and+remodeling.">Uranium inhibits bone formation in physiologic alveolar bone modeling and remodeling.</a> Environ. Res. 54 (1), 17-23 (1991).</li><li>Bozal, C. B., Martinez, A. B., Cabrini, R. L., Ubios, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+ethane-1-+hydroxy-1,1-bisphosphonate+(EHBP)+on+endochondral+ossification+lesions+induced+by+a+lethal+oral+dose+of+uranyl+nitrate.">Effect of ethane-1- hydroxy-1,1-bisphosphonate (EHBP) on endochondral ossification lesions induced by a lethal oral dose of uranyl nitrate.</a> Arch. Toxicol. 79 (8), 475-481 (2005).</li><li>Kurttio, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+as+a+possible+target+of+chemical+toxicity+of+natural+uranium+in+drinking+water.">Bone as a possible target of chemical toxicity of natural uranium in drinking water.</a> Environ. Health Perspect. 113 (1), 68-72 (2005).</li><li>Collin-Osdoby, P., Osdoby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RANKL-mediated+osteoclast+formation+from+murine+RAW+264.7+cells.">RANKL-mediated osteoclast formation from murine RAW 264.7 cells.</a> Methods Mol. Biol. 816, 187-202 (2012).</li><li>Beranger, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+binding+of+poly(ADP-Ribose)+polymerase-1+and+JunD/Fra2+accounts+for+RANKL-induced+Tcirg1+gene+expression+during+osteoclastogenesis.">Differential binding of poly(ADP-Ribose) polymerase-1 and JunD/Fra2 accounts for RANKL-induced Tcirg1 gene expression during osteoclastogenesis.</a> J. Bone Miner. Res. 22 (7), 975-983 (2007).</li><li>Mirto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+uranium(VI)+speciation+for+the+evaluation+of+in+vitro+uranium+cytotoxicity+on+LLC-PK1+cells.">Influence of uranium(VI) speciation for the evaluation of in vitro uranium cytotoxicity on LLC-PK1 cells.</a> Hum. Exp. Toxicol. 18 (3), 180-187 (1999).</li><li>Carri&#232;re, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+uranium+speciation+on+normal+rat+kidney+(NRK-52E)+proximal+cell+cytotoxicity.">Influence of uranium speciation on normal rat kidney (NRK-52E) proximal cell cytotoxicity.</a> Chem. Res. Toxicol. 17 (3), 446-452 (2004).</li><li>Milgram, S., Carri&#232;re, M., Malaval, L., Gouget, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+accumulation+and+distribution+of+uranium+and+lead+in+osteoblastic+cells+as+a+function+of+their+speciation.">Cellular accumulation and distribution of uranium and lead in osteoblastic cells as a function of their speciation.</a> Toxicology. 252 (1-3), 26-32 (2008).</li><li>Milgram, S., Carri&#232;re, M., Thiebault, C., Malaval, L., Gouget, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+and+phenotypic+effects+of+uranium+and+lead+on+osteoblastic+cells+are+highly+dependent+on+metal+speciation.">Cytotoxic and phenotypic effects of uranium and lead on osteoblastic cells are highly dependent on metal speciation.</a> Toxicology. 250 (1), 62-69 (2008).</li><li>Studzinski, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell Growth, Differentiation and Senescence A Practical Approach. , (1999).</li><li>Gritsaenko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+uranium+impairs+the+differentiation+and+the+resorbing+function+of+osteoclasts.">Natural uranium impairs the differentiation and the resorbing function of osteoclasts.</a> Biochim Biophys Acta. 1861 (4), 715-726 (2017).</li><li>Motiur Rahman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation-coupled+osteoclast+differentiation+by+RANKL:+Cell+density+as+a+determinant+of+osteoclast+formation.">Proliferation-coupled osteoclast differentiation by RANKL: Cell density as a determinant of osteoclast formation.</a> Bone. 81, 392-399 (2015).</li></ol>

Pour autant que nous savons, c’est la première fois que nous décrivons une procédure détaillée visant à étudier les effets de l’uranium naturel sur OS résorption des cellules. Cette approche sera utile à une meilleure compréhension de l’impact de l’uranium sur la physiologie osseuse et peut fournir un nouvel outil intéressant pour le dépistage des chélateurs de l’uranium. En outre, nous pensons que le protocole décrit ici pourrait être appliqué pour étudier l’impact des autres métaux lourds ...

L’uranium est un élément radioactif naturel présent dans les sols, air et eau ; par conséquent, animaux et les humains sont exposés à l’uranium naturel dans leur alimentation. En plus de sources naturelles, uranium provient d’origine anthropique, qui augmente son abondance dans l’environnement. L’uranium pose des risques chimiques et radiologiques. Cependant, parce que l’uranium naturel (qui est un mélange isotopique contenant 99,27 % 238U, 0,72 % 235U et 0,006 % 234U) a une faible activité spécifique (25,103 Bq.g-1), ses impacts sur la santé sont attribués à sa toxicité chimique.
Quelle que soit sa voie d’accès (inhalation, ingestion ou cutanée), la plupart d’uranium pénétrant dans l’organisme est éliminé par les fèces et seule une petite partie atteint la circulation générale. Environ 67 % de l’uranium dans le sang est ensuite filtrée par les reins et quitte le corps dans l’urine dans les 24 h1. Le reste se dépose principalement dans les reins et les os, les deux organes de cible principale de la toxicité de l’uranium pour2,3,4. Parce que le squelette a été identifié comme le principal site d’uranium à long terme conservation2,3,4,5,6, plusieurs études ont été réalisées afin d’explorer les effet de l’uranium sur OS physiologie7.
L’OS est un tissu minéralisé qui est remodelé en permanence tout au long de sa durée de vie. Remodelage osseux est un processus complexe qui dépend des types de cellules spécialisées et se compose essentiellement de deux phases : la résorption de la matrice préexistante vieux par les ostéoclastes suivie de novo construction d’os par les ostéoblastes. Les ostéoclastes sont des cellules multinucléaires grands résultant de la fusion de cellules précurseurs d’origine hématopoïétique qui migrent vers des sites de résorption où qu’ils attachent à l’OS8. Leur fixation se produit simultanément avec une réorganisation à grande échelle de leur cytosquelette9. Cette réorganisation est nécessaire pour la mise en place d’un compartiment isolé entre la cellule et la surface de l’os dans lequel les ostéoclastes sécrète des protons, conduisant à la dissolution de l’hydroxyapatite et des protéases impliquées dans la dégradation de la matrice organique. Les produits de dégradation qui en résultent sont mégacaryocyte, transporté à travers la cellule à la zone de la membrane opposée à la surface osseuse et sécrétée, un processus appelé transcytose10,11.
Les résultats des études in vivo et in vitro indiquent que l’uranium inhibe la formation osseuse et altère le nombre et l’activité des ostéoblastes7,12. En revanche, les effets de l’uranium sur la résorption osseuse et les ostéoclastes ont été peu explorées. Plusieurs des études in vivo ont signalé une augmentation de la résorption osseuse après administration de nitrate d’uranyle de souris ou rats13,14. En outre, une enquête épidémiologique a suggéré que l’augmentation de l’apport d’uranium dans l’eau potable ont tendance à être associée à une augmentation de la concentration sérique d’un marqueur de résorption osseuse en hommes15. Pris ensemble, ces conclusions ont conduit à la conclusion que l’uranium, qui s’accumule dans les os pourrait favoriser la résorption osseuse. Toutefois, les mécanismes cellulaires impliqués dans cet effet potentiel de l’uranium restent une question ouverte. Pour cette raison, nous avons décidé d’examiner l’impact de l’uranium sur le comportement de la résorption des cellules osseuses.
Nous décrivons ici le protocole que nous avons mis en place pour caractériser et quantifier les effets de l’uranium naturel sur la viabilité des ostéoclastes avant et sur la différenciation des ostéoclastes et activité de résorption. Les expériences décrites dans les présentes ont été faites avec la lignée de cellules macrophages de souris transformées RAW 264.7, qui peut facilement se différencient en ostéoclastes lorsque cultivées en présence de la cytokine RANKL pour 4 ou 5 jours, et qui est classiquement utilisé pour étudier ostéoclastes différenciation et fonction16. Les procédures mises en place sont fiables, donnent des résultats hautement reproductibles et sont pleinement applicable aux ostéoclastes primaires. Pour toutes ces raisons, nous croyons que cette méthode est utile pour obtenir une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans la toxicité de l’uranium dans les os. En outre, nous pensons que cette approche pourrait être adaptée comme outil de dépistage pour identifier les nouvelles d’uranium par des agents chélateurs.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-604F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-MEM</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-169F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMEM without phenol red</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-668E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water for cell culture</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-724F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;L-Glutamine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution 0.4%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone fetal bovine serum</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.5% sodium bicarbonate aqueous solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>387A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin Red S sodium salt, 1% w/v aq. sol.</td>
			<td>Alfa Aeros</td>
			<td>42746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>3987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell 24 well plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask 75 cm2</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Conical Tubes 50 ml</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrapers 30 cm</td>
			<td>TPP</td>
			<td>90003</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for analyzing the impacts of natural uranium on in vitro osteoclastogenesis

L’uranium a été montré pour interférer avec la physiologie osseuse et il est bien établi que ce métal s’accumule dans les os. Cependant, on connaît les effets de l’uranium naturel sur le comportement des cellules osseuses. En particulier, l’impact de l’uranium sur les ostéoclastes, les cellules responsables de la résorption de la matrice osseuse, n’est pas documentée. Pour étudier cette question, nous avons créé un nouveau protocole avec l’acétate d’uranyle comme une source d’uranium naturel et de la lignée murine RAW 264.7 comme modèle des précurseurs ostéoclastiques. Ici, nous avons détaillé tous les tests requis pour tester la cytotoxicité d’uranium sur les précurseurs d’ostéoclastes et d’évaluer son impact sur l’osteoclastogenesis et la fonction de résorption des ostéoclastes matures. Les conditions que nous avons développé, en particulier pour la préparation des milieux de culture contenant de l’uranyle et l’ensemencement des RAW 264.7 cellules permettent d’obtenir des résultats fiables et hautement reproductif. En outre, nous avons optimisé l’utilisation des outils logiciels pour faciliter l’analyse de divers paramètres tels que la taille des ostéoclastes ou le pourcentage de matrice résorbé.

Phosphatases acides tartrate-résistantes de coloration a été utilisée pour visualiser les ostéoclastes comme grandes cellules violets avoir 3 ou plusieurs noyaux. Des images représentatives des ostéoclastes provenant des 264.7 cellules crues cultivées en présence de RANKL et ions uranyle sont indiquées à la Figure 1. Changements dans le nombre et la taille des ostéoclastes en réponse à l’uranium sont facilement visibles dans l’image composit...

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Methods for Analyzing the Impacts of Natural Uranium on In Vitro Osteoclastogenesis

L’uranium est connu pour affecter le métabolisme osseux. Nous présentons ici un protocole visant à étudier les effets de l’exposition de l’uranium naturel sur la viabilité, la différenciation et la fonction des ostéoclastes, les cellules en charge de la résorption osseuse.

Méthodes pour analyser les effets de l’Uranium naturel sur In Vitro Osteoclastogenesis

Uranium has been shown to interfere with bone physiology and it is well established that this metal accumulates in bone. However, little is known about ...

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