Name: methods for analyzing the impacts of natural uranium on in vitro osteoclastogenesis
Uploaded: 2018-01-30T13:00:00
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Gli autori vorrei ringraziare Chantal Cros per assistenza tecnica disponibile. Questa ricerca è stata finanziata da sovvenzioni dal "Commissariat à l'Energie Atomique et aux energie alternative" (URANOs - programma trasversale de Toxicologie du CEA e CPRR CEA-AREVA) e da ANR (tossicità di uranio: approccio multi-livello di biomineralizzazione elaborare in osso, ANR-16-CE34-0003). Questo lavoro è stato sostenuto anche dall'Università di Nizza Sophia-Antipolis e il CNRS.

1. preparazione della soluzione di acetato di uranile
<ol><li>Per preparare 2 mL di una soluzione di acetato di uranile 100mm, aggiungere 85 mg di acetato di uranile (UO2(OCOCH3)2, 2 H2O; M = 424 g.mol-1) a stato solido per un tubo di plastica da 5 mL.</li>
	<li>Aggiungere 2 mL di acqua distillata per il tubo di plastica e montarla con un tappo di plastica.</li>
	<li>Agitare bene il tubo fino alla totale dissoluzione del solido. Mettere la soluzione in frigorifero ...

<ol>
	<li>Keith, S., Faroon, O., Roney, N., Scinicariello, F., Wilbur, S., Ingerman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicological+profile+for+uranium.">Toxicological profile for uranium.</a> Agency for Toxic Substances and Disease Registry. , (2013).</li><li>Ballou, J. E., Gies, R. A., Case, A. C., Haggard, D. L., Buschbom, R. L., Ryan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deposition+and+early+disposition+of+inhaled+233UO2(NO3)2+and+232UO2(NO3)2+in+the+rat.">Deposition and early disposition of inhaled 233UO2(NO3)2 and 232UO2(NO3)2 in the rat.</a> Health Phys. 51 (6), 755-771 (1986).</li><li>Kathren, R. L., McInroy, J. F., Moore, R. H., Dietert, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uranium+in+the+tissues+of+an+occupationally+exposed+individual.">Uranium in the tissues of an occupationally exposed individual.</a> Health Phys. 57 (1), 17-21 (1989).</li><li>Kurttio, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+effects+of+uranium+in+drinking+water.">Renal effects of uranium in drinking water.</a> Environ.Health Perspect. 110 (4), 337-342 (2002).</li><li>Leggett, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basis+for+the+ICRP's+age-specific+biokinetic+model+for+uranium.">Basis for the ICRP's age-specific biokinetic model for uranium.</a> Health Phys. 67 (6), 589-610 (1994).</li><li>Vidaud, C., Bourgeois, D., Meyer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+as+target+organ+for+metals:+the+case+of+f-elements.">Bone as target organ for metals: the case of f-elements.</a> Chem. Res. Toxicol. 25 (6), 1161-1175 (2012).</li><li>Arzuaga, X., Gehlhaus, M., Strong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modes+of+action+associated+with+uranium+induced+adverse+effects+in+bone+function+and+development.">Modes of action associated with uranium induced adverse effects in bone function and development.</a> Toxicol. Lett. 236 (2), 123-130 (2015).</li><li>Ikeda, K., Takeshita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+osteoclast+differentiation+and+function+in+skeletal+homeostasis.">The role of osteoclast differentiation and function in skeletal homeostasis.</a> J. Biochem. 159 (1), 1-8 (2016).</li><li>Teiltelbaum, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+osteoclast+and+its+unique+cytoskeleton.">The osteoclast and its unique cytoskeleton.</a> Ann N Y Acad Sci. 1240, 14-17 (2011).</li><li>Nesbitt, S. A., Horton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+of+matrix+collagens+through+bone-resorbing+osteoclasts.">Trafficking of matrix collagens through bone-resorbing osteoclasts.</a> Science. 276 (5310), 266-269 (1997).</li><li>Salo, J., Lehenkari, P., Mulari, M., Metsikko, K., Vaananen, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+osteoclast+bone+resorption+products+by+transcytosis.">Removal of osteoclast bone resorption products by transcytosis.</a> Science. 276 (5310), 270-273 (1997).</li><li>Pierrefite-Carle, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+natural+uranium+on+the+UMR-106+osteoblastic+cell+line:+impairment+of+the+autophagic+process+as+an+underlying+mechanism+of+uranium+toxicity.">Effect of natural uranium on the UMR-106 osteoblastic cell line: impairment of the autophagic process as an underlying mechanism of uranium toxicity.</a> Arch. Toxicol. 91 (4), 1903-1914 (2017).</li><li>Ubios, A. M., Guglielmotti, M. B., Steimetz, T., Cabrini, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uranium+inhibits+bone+formation+in+physiologic+alveolar+bone+modeling+and+remodeling.">Uranium inhibits bone formation in physiologic alveolar bone modeling and remodeling.</a> Environ. Res. 54 (1), 17-23 (1991).</li><li>Bozal, C. B., Martinez, A. B., Cabrini, R. L., Ubios, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+ethane-1-+hydroxy-1,1-bisphosphonate+(EHBP)+on+endochondral+ossification+lesions+induced+by+a+lethal+oral+dose+of+uranyl+nitrate.">Effect of ethane-1- hydroxy-1,1-bisphosphonate (EHBP) on endochondral ossification lesions induced by a lethal oral dose of uranyl nitrate.</a> Arch. Toxicol. 79 (8), 475-481 (2005).</li><li>Kurttio, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+as+a+possible+target+of+chemical+toxicity+of+natural+uranium+in+drinking+water.">Bone as a possible target of chemical toxicity of natural uranium in drinking water.</a> Environ. Health Perspect. 113 (1), 68-72 (2005).</li><li>Collin-Osdoby, P., Osdoby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RANKL-mediated+osteoclast+formation+from+murine+RAW+264.7+cells.">RANKL-mediated osteoclast formation from murine RAW 264.7 cells.</a> Methods Mol. Biol. 816, 187-202 (2012).</li><li>Beranger, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+binding+of+poly(ADP-Ribose)+polymerase-1+and+JunD/Fra2+accounts+for+RANKL-induced+Tcirg1+gene+expression+during+osteoclastogenesis.">Differential binding of poly(ADP-Ribose) polymerase-1 and JunD/Fra2 accounts for RANKL-induced Tcirg1 gene expression during osteoclastogenesis.</a> J. Bone Miner. Res. 22 (7), 975-983 (2007).</li><li>Mirto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+uranium(VI)+speciation+for+the+evaluation+of+in+vitro+uranium+cytotoxicity+on+LLC-PK1+cells.">Influence of uranium(VI) speciation for the evaluation of in vitro uranium cytotoxicity on LLC-PK1 cells.</a> Hum. Exp. Toxicol. 18 (3), 180-187 (1999).</li><li>Carri&#232;re, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+uranium+speciation+on+normal+rat+kidney+(NRK-52E)+proximal+cell+cytotoxicity.">Influence of uranium speciation on normal rat kidney (NRK-52E) proximal cell cytotoxicity.</a> Chem. Res. Toxicol. 17 (3), 446-452 (2004).</li><li>Milgram, S., Carri&#232;re, M., Malaval, L., Gouget, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+accumulation+and+distribution+of+uranium+and+lead+in+osteoblastic+cells+as+a+function+of+their+speciation.">Cellular accumulation and distribution of uranium and lead in osteoblastic cells as a function of their speciation.</a> Toxicology. 252 (1-3), 26-32 (2008).</li><li>Milgram, S., Carri&#232;re, M., Thiebault, C., Malaval, L., Gouget, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+and+phenotypic+effects+of+uranium+and+lead+on+osteoblastic+cells+are+highly+dependent+on+metal+speciation.">Cytotoxic and phenotypic effects of uranium and lead on osteoblastic cells are highly dependent on metal speciation.</a> Toxicology. 250 (1), 62-69 (2008).</li><li>Studzinski, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell Growth, Differentiation and Senescence A Practical Approach. , (1999).</li><li>Gritsaenko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+uranium+impairs+the+differentiation+and+the+resorbing+function+of+osteoclasts.">Natural uranium impairs the differentiation and the resorbing function of osteoclasts.</a> Biochim Biophys Acta. 1861 (4), 715-726 (2017).</li><li>Motiur Rahman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation-coupled+osteoclast+differentiation+by+RANKL:+Cell+density+as+a+determinant+of+osteoclast+formation.">Proliferation-coupled osteoclast differentiation by RANKL: Cell density as a determinant of osteoclast formation.</a> Bone. 81, 392-399 (2015).</li></ol>

Per quanto sappiamo, questa è la prima volta che una procedura dettagliata con l'obiettivo di studiare l'effetto di uranio naturale sull'osso resorbing cellule è descritto. Questo approccio sarà utile per ottenere una migliore comprensione dell'impatto di uranio sulla fisiologia dell'osso e può fornire un interessante nuovo strumento per lo screening dei chelatori di uranio. Inoltre, riteniamo che potrebbe essere applicato il protocollo descritto qui per studiare l'impatto di altri metalli pesanti su osteoclatogenesi...

L'uranio è un elemento radioattivo naturale presente nel suolo, aria e acqua; come tale, gli animali e gli esseri umani sono esposti a uranio naturale nelle loro diete. Oltre alle fonti naturali, l'uranio proviene da attività antropiche, che aumenta la sua abbondanza nell'ambiente. Uranio pone rischi sia chimici e radiologici. Tuttavia, poiché l'uranio naturale (che è una miscela isotopica contenente 99,27% 238U e 0,72% 235U 0.006% 234U) ha una debole attività specifica (25.103 Bq.g-1), suoi impatti sulla salute sono attribuiti a sua tossicità chimica.
Qualunque suo percorso di voce (inalazione, ingestione o esposizione cutanea), la maggior parte dell'uranio entra nel corpo è eliminato con le feci e solo una piccola parte raggiunge la circolazione sistemica. Circa il 67% di uranio nel sangue a sua volta viene filtrato dai reni e lascia il corpo nelle urine entro 24 ore1. Il resto è per lo più depositato in reni e le ossa, i due principali organi bersaglio di uranio tossicità2,3,4. Poiché lo scheletro è stato identificato come il luogo primario di uranio a lungo termine conservazione2,3,4,5,6, diversi studi sono stati condotti per esplorare il effetto dell'uranio su osso fisiologia7.
L'osso è un tessuto mineralizzato che è continuamente rinnovato tutta la sua durata. Rimodellamento osseo è un processo complesso che dipende dai tipi di cellula specializzata e consiste principalmente di due fasi: il riassorbimento della matrice vecchia pre-esistente dagli osteoclasti seguita da costruzione de novo dell'osso dall'osteoblasto. Gli osteoclasti sono grandi cellule multinucleare risultanti dalla fusione di cellule progenitrici di origine ematopoietica che migrare verso siti di riassorbimento dove essi attribuiscono alle ossa di8. Loro attaccamento si verifica simultaneamente con una vasta riorganizzazione di loro citoscheletro9. Questa riorganizzazione è necessaria per l'istituzione di un compartimento isolato tra la cella e la superficie dell'osso in cui l'osteoclasto secerne protoni, che porta alla dissoluzione dell'idrossiapatite e proteasi coinvolte nella degradazione della matrice organica. I prodotti di degradazione risultanti sono stimolazione, trasportati attraverso la cella per l'area della membrana di fronte la superficie ossea e secreta, un processo chiamato transcitosi10,11.
I risultati degli studi in vivo e in vitro indicano che l'uranio inibisce la formazione dell'osso e altera il numero e l'attività degli osteoblasti7,12. Al contrario, gli effetti dell'uranio sul riassorbimento dell'osso e gli osteoclasti sono stati scarsamente esplorati. Diversi studi in vivo hanno segnalato un aumento di riassorbimento dell'osso dopo amministrazione del nitrato di uranile in topi o ratti13,14. Inoltre, un'indagine epidemiologica ha suggerito che l'aumento nell'assunzione di uranio nell'acqua da bere ha teso ad essere associato con un aumento nel livello del siero di un marker di riassorbimento osseo in uomini15. Presi insieme, questi risultati hanno condotto alla conclusione che l'uranio, che si accumula nell'osso potrebbe promuovere il riassorbimento dell'osso. Tuttavia, i meccanismi cellulari coinvolti in questo effetto potenziale di uranio rimangano una questione aperta. Per questo motivo, abbiamo deciso di esaminare l'impatto dell'uranio sul comportamento di resorbing cellule ossee.
Qui, descriviamo il protocollo che abbiamo stabilito per caratterizzare e quantificare gli effetti di uranio naturale sulla vitalità di pre- osteoclasti e sulla differenziazione di osteoclasti e attività resorptive. Gli esperimenti descritti nel presente documento sono state fatte con il RAW 264.7 murino trasformato linea cellulare del macrofago, che possono facilmente differenziare in osteoclasti quando coltivate in presenza della citochina RANKL per 4 o 5 giorni, e che è classicamente usato per studiare osteoclasto differenziazione e la funzione16. Le procedure elaborate sono affidabili, dare risultati altamente riproducibili e sono pienamente applicabile al primari osteoclasti. Per tutte queste ragioni, riteniamo che questa metodologia è utile per ottenere una migliore comprensione dei meccanismi molecolari coinvolti nella tossicità di uranio nell'osso. Inoltre, riteniamo che questo approccio potrebbe essere adattato come uno strumento di screening per l'identificazione di nuovo uranio agenti chelanti.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-604F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-MEM</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-169F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMEM without phenol red</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-668E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water for cell culture</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-724F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;L-Glutamine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution 0.4%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone fetal bovine serum</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.5% sodium bicarbonate aqueous solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>387A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin Red S sodium salt, 1% w/v aq. sol.</td>
			<td>Alfa Aeros</td>
			<td>42746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>3987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell 24 well plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask 75 cm2</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Conical Tubes 50 ml</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrapers 30 cm</td>
			<td>TPP</td>
			<td>90003</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for analyzing the impacts of natural uranium on in vitro osteoclastogenesis

L'uranio è stato indicato per interferire con la fisiologia dell'osso ed è ormai assodato che questo metallo si accumula in osso. Tuttavia, piccolo è conosciuto circa l'effetto di uranio naturale sul comportamento delle cellule di osso. In particolare, l'impatto dell'uranio su osteoclasti, le cellule responsabili del riassorbimento della matrice dell'osso, non è documentata. Per studiare questo problema, abbiamo stabilito un nuovo protocollo con acetato di uranile come fonte di uranio naturale e la linea cellulare murina di 264,7 come modello dei precursori degli osteoclasti. Nel presente documento, abbiamo dettagliate tutte le analisi necessarie per test di citotossicità di uranio sui precursori degli osteoclasti e per valutarne l'impatto sul osteoclastogenesis e la resorbing funzione degli osteoclasti maturi. Le condizioni abbiamo sviluppato, in particolare per la preparazione di uranile contenenti terreni di coltura e per la semina di RAW 264.7 celle consentono di ottenere risultati affidabili e altamente riproduttive. Inoltre, abbiamo ottimizzato l'uso di strumenti software per facilitare l'analisi di vari parametri quali la dimensione degli osteoclasti o la percentuale di matrice resorbed.

Macchiatura di fosfatasi acida tartrato-resistente è stata utilizzata per visualizzare gli osteoclasti come grandi cellule viola che hanno 3 o più nuclei. Immagini rappresentative degli osteoclasti ottenuti da 264.7 celle grezze coltivate in presenza di RANKL e ioni uranile sono mostrati nella Figura 1. Cambiamenti nel numero e le dimensioni degli osteoclasti in risposta all'uranio sono facilmente visibili in immagini composite di tutta pozzi e in immagini ...

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Methods for Analyzing the Impacts of Natural Uranium on In Vitro Osteoclastogenesis

L'uranio è conosciuto per interessare il metabolismo dell'osso. Qui, presentiamo un protocollo volto a indagare l'effetto dell'esposizione all'uranio naturale sulla vitalità, la differenziazione e la funzione degli osteoclasti, le cellule responsabili di riassorbimento dell'osso.

Metodi per analizzare gli impatti di uranio naturale il Osteoclastogenesis In Vitro

Uranium has been shown to interfere with bone physiology and it is well established that this metal accumulates in bone. However, little is known about ...

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