Name: methods for analyzing the impacts of natural uranium on in vitro osteoclastogenesis
Uploaded: 2018-01-30T13:00:00
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Os autores gostaria agradecer Cros Chantal por assistência técnica útil. Esta pesquisa foi financiada por doações do "Commissariat à l'Energie Atomique et aux energias alternativas" (URANOs - programa Transversal de Toxicologie du CEA e CPRR CEA-AREVA) e da ANR (toxicidade de urânio: abordagem multi-nível de biomineralização processo no osso, ANR-16-CE34-0003). Este trabalho também foi apoiado pela Universidade de Nice Sophia-Antipolis e o CNRS.

1. preparação da solução de acetato de uranilo
<ol><li>Para preparar 2 mL de uma solução de acetato de uranilo 100mm, adicione 85 mg de acetato de uranilo (UO2(OCOCH3)2, 2 H2O; M = 424 g.mol-1) em estado sólido para um tubo de plástico de 5 mL.</li>
	<li>Adicionar 2 mL de água destilada ao tubo de plástico e ajustá-lo com uma rolha de plástico.</li>
	<li>Agite o tubo vigorosamente até a dissolução total do sólido. Colocar a solução em geladeira po...

<ol>
	<li>Keith, S., Faroon, O., Roney, N., Scinicariello, F., Wilbur, S., Ingerman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicological+profile+for+uranium.">Toxicological profile for uranium.</a> Agency for Toxic Substances and Disease Registry. , (2013).</li><li>Ballou, J. E., Gies, R. A., Case, A. C., Haggard, D. L., Buschbom, R. L., Ryan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deposition+and+early+disposition+of+inhaled+233UO2(NO3)2+and+232UO2(NO3)2+in+the+rat.">Deposition and early disposition of inhaled 233UO2(NO3)2 and 232UO2(NO3)2 in the rat.</a> Health Phys. 51 (6), 755-771 (1986).</li><li>Kathren, R. L., McInroy, J. F., Moore, R. H., Dietert, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uranium+in+the+tissues+of+an+occupationally+exposed+individual.">Uranium in the tissues of an occupationally exposed individual.</a> Health Phys. 57 (1), 17-21 (1989).</li><li>Kurttio, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+effects+of+uranium+in+drinking+water.">Renal effects of uranium in drinking water.</a> Environ.Health Perspect. 110 (4), 337-342 (2002).</li><li>Leggett, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basis+for+the+ICRP's+age-specific+biokinetic+model+for+uranium.">Basis for the ICRP's age-specific biokinetic model for uranium.</a> Health Phys. 67 (6), 589-610 (1994).</li><li>Vidaud, C., Bourgeois, D., Meyer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+as+target+organ+for+metals:+the+case+of+f-elements.">Bone as target organ for metals: the case of f-elements.</a> Chem. Res. Toxicol. 25 (6), 1161-1175 (2012).</li><li>Arzuaga, X., Gehlhaus, M., Strong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modes+of+action+associated+with+uranium+induced+adverse+effects+in+bone+function+and+development.">Modes of action associated with uranium induced adverse effects in bone function and development.</a> Toxicol. Lett. 236 (2), 123-130 (2015).</li><li>Ikeda, K., Takeshita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+osteoclast+differentiation+and+function+in+skeletal+homeostasis.">The role of osteoclast differentiation and function in skeletal homeostasis.</a> J. Biochem. 159 (1), 1-8 (2016).</li><li>Teiltelbaum, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+osteoclast+and+its+unique+cytoskeleton.">The osteoclast and its unique cytoskeleton.</a> Ann N Y Acad Sci. 1240, 14-17 (2011).</li><li>Nesbitt, S. A., Horton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+of+matrix+collagens+through+bone-resorbing+osteoclasts.">Trafficking of matrix collagens through bone-resorbing osteoclasts.</a> Science. 276 (5310), 266-269 (1997).</li><li>Salo, J., Lehenkari, P., Mulari, M., Metsikko, K., Vaananen, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+osteoclast+bone+resorption+products+by+transcytosis.">Removal of osteoclast bone resorption products by transcytosis.</a> Science. 276 (5310), 270-273 (1997).</li><li>Pierrefite-Carle, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+natural+uranium+on+the+UMR-106+osteoblastic+cell+line:+impairment+of+the+autophagic+process+as+an+underlying+mechanism+of+uranium+toxicity.">Effect of natural uranium on the UMR-106 osteoblastic cell line: impairment of the autophagic process as an underlying mechanism of uranium toxicity.</a> Arch. Toxicol. 91 (4), 1903-1914 (2017).</li><li>Ubios, A. M., Guglielmotti, M. B., Steimetz, T., Cabrini, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uranium+inhibits+bone+formation+in+physiologic+alveolar+bone+modeling+and+remodeling.">Uranium inhibits bone formation in physiologic alveolar bone modeling and remodeling.</a> Environ. Res. 54 (1), 17-23 (1991).</li><li>Bozal, C. B., Martinez, A. B., Cabrini, R. L., Ubios, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+ethane-1-+hydroxy-1,1-bisphosphonate+(EHBP)+on+endochondral+ossification+lesions+induced+by+a+lethal+oral+dose+of+uranyl+nitrate.">Effect of ethane-1- hydroxy-1,1-bisphosphonate (EHBP) on endochondral ossification lesions induced by a lethal oral dose of uranyl nitrate.</a> Arch. Toxicol. 79 (8), 475-481 (2005).</li><li>Kurttio, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+as+a+possible+target+of+chemical+toxicity+of+natural+uranium+in+drinking+water.">Bone as a possible target of chemical toxicity of natural uranium in drinking water.</a> Environ. Health Perspect. 113 (1), 68-72 (2005).</li><li>Collin-Osdoby, P., Osdoby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RANKL-mediated+osteoclast+formation+from+murine+RAW+264.7+cells.">RANKL-mediated osteoclast formation from murine RAW 264.7 cells.</a> Methods Mol. Biol. 816, 187-202 (2012).</li><li>Beranger, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+binding+of+poly(ADP-Ribose)+polymerase-1+and+JunD/Fra2+accounts+for+RANKL-induced+Tcirg1+gene+expression+during+osteoclastogenesis.">Differential binding of poly(ADP-Ribose) polymerase-1 and JunD/Fra2 accounts for RANKL-induced Tcirg1 gene expression during osteoclastogenesis.</a> J. Bone Miner. Res. 22 (7), 975-983 (2007).</li><li>Mirto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+uranium(VI)+speciation+for+the+evaluation+of+in+vitro+uranium+cytotoxicity+on+LLC-PK1+cells.">Influence of uranium(VI) speciation for the evaluation of in vitro uranium cytotoxicity on LLC-PK1 cells.</a> Hum. Exp. Toxicol. 18 (3), 180-187 (1999).</li><li>Carri&#232;re, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+uranium+speciation+on+normal+rat+kidney+(NRK-52E)+proximal+cell+cytotoxicity.">Influence of uranium speciation on normal rat kidney (NRK-52E) proximal cell cytotoxicity.</a> Chem. Res. Toxicol. 17 (3), 446-452 (2004).</li><li>Milgram, S., Carri&#232;re, M., Malaval, L., Gouget, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+accumulation+and+distribution+of+uranium+and+lead+in+osteoblastic+cells+as+a+function+of+their+speciation.">Cellular accumulation and distribution of uranium and lead in osteoblastic cells as a function of their speciation.</a> Toxicology. 252 (1-3), 26-32 (2008).</li><li>Milgram, S., Carri&#232;re, M., Thiebault, C., Malaval, L., Gouget, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+and+phenotypic+effects+of+uranium+and+lead+on+osteoblastic+cells+are+highly+dependent+on+metal+speciation.">Cytotoxic and phenotypic effects of uranium and lead on osteoblastic cells are highly dependent on metal speciation.</a> Toxicology. 250 (1), 62-69 (2008).</li><li>Studzinski, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell Growth, Differentiation and Senescence A Practical Approach. , (1999).</li><li>Gritsaenko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+uranium+impairs+the+differentiation+and+the+resorbing+function+of+osteoclasts.">Natural uranium impairs the differentiation and the resorbing function of osteoclasts.</a> Biochim Biophys Acta. 1861 (4), 715-726 (2017).</li><li>Motiur Rahman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation-coupled+osteoclast+differentiation+by+RANKL:+Cell+density+as+a+determinant+of+osteoclast+formation.">Proliferation-coupled osteoclast differentiation by RANKL: Cell density as a determinant of osteoclast formation.</a> Bone. 81, 392-399 (2015).</li></ol>

Tanto quanto sabemos, esta é a primeira vez que um procedimento detalhado com o objetivo de estudar os efeitos do urânio natural no osso resorbing células é descrito. Esta abordagem será útil para alcançar uma melhor compreensão do impacto de urânio na fisiologia do osso e pode fornecer uma ferramenta nova e interessante para o rastreio de quelantes de urânio. Além disso, acreditamos que o protocolo descrito aqui pode ser aplicado para estudar o impacto de outros metais pesados na osteoclatogenesis.
<p cla...

Urânio é um elemento radioativo ocorre naturalmente presente no solo, ar e água; como tal, animais e seres humanos estão expostos ao urânio natural em suas dietas. Além de fontes naturais, urânio origina actividades antropogénicas, que aumenta a sua abundância no ambiente. Urânio representa perigos químicos e radiológicos. No entanto, porque o urânio natural (que é uma mistura isotópica contendo 99.27% 238U, 0.72% 235U e 0.006% 234U) tem uma baixa atividade específica (25.103 Bq.g-1), seus impactos na saúde são atribuídos à sua toxicidade química.
O que quer que sua rota de entrada (inalação, ingestão ou exposição dérmica), a maioria de urânio, entrando no corpo é eliminado com fezes e apenas uma pequena porção atinge a circulação sistêmica. Cerca de 67% do urânio no sangue, por sua vez é filtrada pelos rins e deixa o corpo na urina dentro de 24 h1. O restante é depositado principalmente nos rins e ossos, os dois órgãos-alvo principal de urânio toxicidade2,3,4. Porque o esqueleto foi identificado como o local principal de urânio de retenção do longo prazo2,3,4,5,6, vários estudos têm sido realizados para explorar o efeito de urânio no osso fisiologia7.
Osso é um tecido mineralizado que é continuamente remodelado durante toda sua vida. Remodelação óssea é um processo complexo que depende de tipos de células especializadas e consiste principalmente em duas fases: reabsorção da matriz antiga pré-existente pelos osteoclastos, seguido por construção de osso de novo pelos osteoblastos. Osteoclastos são células grandes Relaxometria, resultando da fusão de células precursoras de origem hematopoiética que migram para locais de reabsorção, onde eles atribuem ao osso8. Sua fixação ocorre simultaneamente com uma extensa reorganização do seu citoesqueleto9. Esta reorganização é necessária para o estabelecimento de um compartimento isolado entre a célula e superfície óssea no qual o osteoclasto segrega prótons, levando à dissolução da hidroxiapatita e proteases envolvidas na degradação da matriz orgânica. Os produtos resultantes da degradação são endocytosed, transportado através da célula para a área de membrana oposta à superfície óssea e secretada, um processo chamado transcytosis10,11.
Resultados de estudos in vivo e in vitro indicam que o urânio inibe a formação óssea e altera o número e a atividade dos osteoblastos7,12. Em contraste, os efeitos do urânio na reabsorção óssea e osteoclastos têm sido mal explorados. Várias em vivo estudos relataram um aumento da reabsorção óssea após a administração de nitrato de uranilo para ratos ou ratos de13,14. Além disso, uma investigação epidemiológica sugere que o aumento na ingestão de urânio através da água potável tendeu a ser associado com um aumento do nível de soro de um marcador de reabsorção óssea em homens15. Tomados em conjunto, estas descobertas levaram à conclusão de que o urânio, que se acumula no osso poderia promover reabsorção óssea. No entanto, os mecanismos celulares envolvidos neste efeito potencial de urânio permanecem uma questão em aberto. Por esta razão, decidimos analisar o impacto de urânio no comportamento de resorbing células ósseas.
Aqui, descrevemos o protocolo que estabelecemos para caracterizar e quantificar os efeitos do urânio natural na viabilidade de pre-osteoclastos e na diferenciação de osteoclastos e atividade Odontoclastic. Os experimentos descritos neste documento tem sido feitos com a linha de celular de murino macrófago transformado 264.7 crus, que facilmente pode se diferenciar em osteoclastos quando cultivadas na presença da citocina RANKL por 4 ou 5 dias, e que é classicamente usado para estudar osteoclast diferenciação e função16. Os procedimentos desenvolvidos são confiáveis, dá resultados altamente reprodutíveis e são plenamente aplicável aos osteoclastos primários. Por todas estas razões, acreditamos que essa metodologia é útil para obter uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos na toxicidade de urânio no osso. Além disso, pensamos que esta abordagem poderia ser adaptada como uma ferramenta de triagem para identificar o urânio novo agentes quelantes.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-604F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-MEM</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-169F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMEM without phenol red</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-668E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water for cell culture</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-724F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;L-Glutamine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution 0.4%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone fetal bovine serum</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.5% sodium bicarbonate aqueous solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>387A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin Red S sodium salt, 1% w/v aq. sol.</td>
			<td>Alfa Aeros</td>
			<td>42746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>3987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell 24 well plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask 75 cm2</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Conical Tubes 50 ml</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrapers 30 cm</td>
			<td>TPP</td>
			<td>90003</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for analyzing the impacts of natural uranium on in vitro osteoclastogenesis

Urânio foi mostrado para interferir na fisiologia óssea e está bem estabelecido que este metal se acumula no osso. No entanto, pouco é conhecido sobre o efeito do urânio natural sobre o comportamento de células ósseas. Em particular, o impacto de urânio em osteoclastos, as células responsáveis pela reabsorção da matriz óssea, não está documentado. Para investigar esse problema, nós estabelecemos um novo protocolo usando acetato de uranilo como uma fonte de urânio natural e a linha de celular murino 264.7 crus como um modelo de precursores do osteoclast. Neste documento, nós detalhados todos os ensaios necessários para testar a citotoxidade de urânio sobre precursores osteoclasto e avaliar o seu impacto sobre a osteoclastogenesis e a função resorbing dos osteoclastos maduros. As condições que nós desenvolvemos, em particular para a preparação de uranilo, contendo meios de cultura e para a semeadura de RAW 264.7 células permitem para obter resultados confiáveis e altamente reprodutivos. Além disso, otimizamos o uso de ferramentas de software para facilitar a análise de vários parâmetros como o tamanho dos osteoclastos ou a porcentagem de matriz reabsorvido.

Coloração da fosfatase ácida tartarato-resistente foi usado para visualizar os osteoclastos como grandes células roxas tendo 3 ou mais núcleos. Imagens representativas dos osteoclastos obtidos de 264.7 pilhas cultivadas na presença de RANKL e íons uranilo são mostrados na Figura 1. Alterações no número e tamanho dos osteoclastos em resposta ao urânio são facilmente visíveis em imagens compostas de poços inteira e em fotos alargadas.
<p clas...

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Methods for Analyzing the Impacts of Natural Uranium on In Vitro Osteoclastogenesis

Urânio é conhecido por afetar o metabolismo ósseo. Aqui, apresentamos um protocolo que visa investigar o efeito da exposição de urânio natural sobre a viabilidade, a diferenciação e a função dos osteoclastos, as células responsável pela reabsorção óssea.

Métodos para analisar os impactos de urânio Natural em In Vitro Osteoclastogenesis

Uranium has been shown to interfere with bone physiology and it is well established that this metal accumulates in bone. However, little is known about ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Methods for Analyzing the Impacts of Natural Uranium on In Vitro Osteoclastogenesis

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