Name: methods for analyzing the impacts of natural uranium on in vitro osteoclastogenesis
Uploaded: 2018-01-30T13:00:00
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Los autores desean agradecer a Chantal Cros por asistencia técnica útil. Esta investigación fue financiada por donaciones de la "Commissariat à l ' Energie Atomique et aux energías alternativas" (URANOs - programa Transversal de Toxicologie du CEA y CEA CPRR-AREVA) y de la ANR (toxicidad de uranio: enfoque multinivel de biomineralización proceso en el hueso, ANR-16-CE34-0003). Este trabajo fue apoyado también por la Universidad de Niza Sophia-Antipolis y el CNRS.

1. preparación de solución de acetato de uranilo
<ol><li>Para preparar 2 mL de una solución de acetato de uranilo de 100 mM, añadir 85 mg de acetato de uranilo (UO2(OCOCH3)2, 2 H2O; M = 424 g.mol-1) en estado sólido a un tubo de plástico de 5 mL.</li>
	<li>Añadir 2 mL de agua destilada al tubo de plástico e introducirlo con un tapón de plástico.</li>
	<li>Agitar el tubo enérgicamente hasta la total disolución del sólido. Poner la solución en la nevera...

<ol>
	<li>Keith, S., Faroon, O., Roney, N., Scinicariello, F., Wilbur, S., Ingerman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicological+profile+for+uranium.">Toxicological profile for uranium.</a> Agency for Toxic Substances and Disease Registry. , (2013).</li><li>Ballou, J. E., Gies, R. A., Case, A. C., Haggard, D. L., Buschbom, R. L., Ryan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deposition+and+early+disposition+of+inhaled+233UO2(NO3)2+and+232UO2(NO3)2+in+the+rat.">Deposition and early disposition of inhaled 233UO2(NO3)2 and 232UO2(NO3)2 in the rat.</a> Health Phys. 51 (6), 755-771 (1986).</li><li>Kathren, R. L., McInroy, J. F., Moore, R. H., Dietert, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uranium+in+the+tissues+of+an+occupationally+exposed+individual.">Uranium in the tissues of an occupationally exposed individual.</a> Health Phys. 57 (1), 17-21 (1989).</li><li>Kurttio, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+effects+of+uranium+in+drinking+water.">Renal effects of uranium in drinking water.</a> Environ.Health Perspect. 110 (4), 337-342 (2002).</li><li>Leggett, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basis+for+the+ICRP's+age-specific+biokinetic+model+for+uranium.">Basis for the ICRP's age-specific biokinetic model for uranium.</a> Health Phys. 67 (6), 589-610 (1994).</li><li>Vidaud, C., Bourgeois, D., Meyer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+as+target+organ+for+metals:+the+case+of+f-elements.">Bone as target organ for metals: the case of f-elements.</a> Chem. Res. Toxicol. 25 (6), 1161-1175 (2012).</li><li>Arzuaga, X., Gehlhaus, M., Strong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modes+of+action+associated+with+uranium+induced+adverse+effects+in+bone+function+and+development.">Modes of action associated with uranium induced adverse effects in bone function and development.</a> Toxicol. Lett. 236 (2), 123-130 (2015).</li><li>Ikeda, K., Takeshita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+osteoclast+differentiation+and+function+in+skeletal+homeostasis.">The role of osteoclast differentiation and function in skeletal homeostasis.</a> J. Biochem. 159 (1), 1-8 (2016).</li><li>Teiltelbaum, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+osteoclast+and+its+unique+cytoskeleton.">The osteoclast and its unique cytoskeleton.</a> Ann N Y Acad Sci. 1240, 14-17 (2011).</li><li>Nesbitt, S. A., Horton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+of+matrix+collagens+through+bone-resorbing+osteoclasts.">Trafficking of matrix collagens through bone-resorbing osteoclasts.</a> Science. 276 (5310), 266-269 (1997).</li><li>Salo, J., Lehenkari, P., Mulari, M., Metsikko, K., Vaananen, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+osteoclast+bone+resorption+products+by+transcytosis.">Removal of osteoclast bone resorption products by transcytosis.</a> Science. 276 (5310), 270-273 (1997).</li><li>Pierrefite-Carle, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+natural+uranium+on+the+UMR-106+osteoblastic+cell+line:+impairment+of+the+autophagic+process+as+an+underlying+mechanism+of+uranium+toxicity.">Effect of natural uranium on the UMR-106 osteoblastic cell line: impairment of the autophagic process as an underlying mechanism of uranium toxicity.</a> Arch. Toxicol. 91 (4), 1903-1914 (2017).</li><li>Ubios, A. M., Guglielmotti, M. B., Steimetz, T., Cabrini, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uranium+inhibits+bone+formation+in+physiologic+alveolar+bone+modeling+and+remodeling.">Uranium inhibits bone formation in physiologic alveolar bone modeling and remodeling.</a> Environ. Res. 54 (1), 17-23 (1991).</li><li>Bozal, C. B., Martinez, A. B., Cabrini, R. L., Ubios, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+ethane-1-+hydroxy-1,1-bisphosphonate+(EHBP)+on+endochondral+ossification+lesions+induced+by+a+lethal+oral+dose+of+uranyl+nitrate.">Effect of ethane-1- hydroxy-1,1-bisphosphonate (EHBP) on endochondral ossification lesions induced by a lethal oral dose of uranyl nitrate.</a> Arch. Toxicol. 79 (8), 475-481 (2005).</li><li>Kurttio, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+as+a+possible+target+of+chemical+toxicity+of+natural+uranium+in+drinking+water.">Bone as a possible target of chemical toxicity of natural uranium in drinking water.</a> Environ. Health Perspect. 113 (1), 68-72 (2005).</li><li>Collin-Osdoby, P., Osdoby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RANKL-mediated+osteoclast+formation+from+murine+RAW+264.7+cells.">RANKL-mediated osteoclast formation from murine RAW 264.7 cells.</a> Methods Mol. Biol. 816, 187-202 (2012).</li><li>Beranger, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+binding+of+poly(ADP-Ribose)+polymerase-1+and+JunD/Fra2+accounts+for+RANKL-induced+Tcirg1+gene+expression+during+osteoclastogenesis.">Differential binding of poly(ADP-Ribose) polymerase-1 and JunD/Fra2 accounts for RANKL-induced Tcirg1 gene expression during osteoclastogenesis.</a> J. Bone Miner. Res. 22 (7), 975-983 (2007).</li><li>Mirto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+uranium(VI)+speciation+for+the+evaluation+of+in+vitro+uranium+cytotoxicity+on+LLC-PK1+cells.">Influence of uranium(VI) speciation for the evaluation of in vitro uranium cytotoxicity on LLC-PK1 cells.</a> Hum. Exp. Toxicol. 18 (3), 180-187 (1999).</li><li>Carri&#232;re, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+uranium+speciation+on+normal+rat+kidney+(NRK-52E)+proximal+cell+cytotoxicity.">Influence of uranium speciation on normal rat kidney (NRK-52E) proximal cell cytotoxicity.</a> Chem. Res. Toxicol. 17 (3), 446-452 (2004).</li><li>Milgram, S., Carri&#232;re, M., Malaval, L., Gouget, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+accumulation+and+distribution+of+uranium+and+lead+in+osteoblastic+cells+as+a+function+of+their+speciation.">Cellular accumulation and distribution of uranium and lead in osteoblastic cells as a function of their speciation.</a> Toxicology. 252 (1-3), 26-32 (2008).</li><li>Milgram, S., Carri&#232;re, M., Thiebault, C., Malaval, L., Gouget, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+and+phenotypic+effects+of+uranium+and+lead+on+osteoblastic+cells+are+highly+dependent+on+metal+speciation.">Cytotoxic and phenotypic effects of uranium and lead on osteoblastic cells are highly dependent on metal speciation.</a> Toxicology. 250 (1), 62-69 (2008).</li><li>Studzinski, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell Growth, Differentiation and Senescence A Practical Approach. , (1999).</li><li>Gritsaenko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+uranium+impairs+the+differentiation+and+the+resorbing+function+of+osteoclasts.">Natural uranium impairs the differentiation and the resorbing function of osteoclasts.</a> Biochim Biophys Acta. 1861 (4), 715-726 (2017).</li><li>Motiur Rahman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation-coupled+osteoclast+differentiation+by+RANKL:+Cell+density+as+a+determinant+of+osteoclast+formation.">Proliferation-coupled osteoclast differentiation by RANKL: Cell density as a determinant of osteoclast formation.</a> Bone. 81, 392-399 (2015).</li></ol>

Lo que sabemos, esta es la primera vez que se describe un procedimiento detallado con el objetivo de estudiar el efecto del uranio natural en resorbing células del hueso. Este enfoque será útil para lograr una mejor comprensión del impacto de uranio en la fisiología del hueso y puede proporcionar una nueva herramienta para la proyección de quelantes del uranio. Además, creemos que el protocolo descrito aquí podría aplicarse para estudiar el impacto de metales pesados en osteoclatogenesis.
<p class="jove_cont...

El uranio es un elemento radioactivo que ocurre naturalmente en suelos, aire y agua; así, los animales y los seres humanos están expuestos a uranio natural en su dieta. Además de fuentes naturales, uranio origina de actividades antropogénicas, que aumenta su abundancia en el medio ambiente. Uranio plantea riesgos químicos y radiológicos. Sin embargo, debido a que el uranio natural (que es una mezcla de isótopos que contiene 99.27% 238U, 0.72% 235U y 0.006% 234U) tiene una baja actividad específica (25.103 Bq.g-1), su impacto en la salud se atribuye a su toxicidad química.
Sea cual sea su vía de entrada (inhalación, ingestión o exposición dérmica), la mayor parte del uranio de entrar en el cuerpo se elimina con las heces y solo una pequeña parte alcanza la circulación sistémica. Aproximadamente el 67% de uranio en la sangre a su vez es filtrado por los riñones y deja el cuerpo en la orina dentro de 24 h1. El resto se deposita sobre todo en los riñones y los huesos, los dos órganos principales de uranio toxicidad2,3,4. Porque el esqueleto se ha identificado como el sitio primario de uranio a largo plazo retención2,3,4,5,6, se han realizado varios estudios para explorar la efecto del uranio en hueso fisiología7.
El hueso es un tejido mineralizado que está remodelado continuamente durante toda su vida. Remodelamiento óseo es un proceso complejo que depende de los tipos de células especializadas y que consiste principalmente en dos fases: resorción de la matriz vieja existente por los osteoclastos seguida de construcción de hueso de novo por los osteoblastos. Los osteoclastos son células grandes, multinuclear resultante de la fusión de células precursoras de origen hematopoyético que migran a los sitios de reabsorción donde fijan al hueso8. El apego ocurre simultáneamente con una reorganización amplia de su citoesqueleto9. Esta reorganización es necesaria para el establecimiento de un compartimiento aislado entre la célula y la superficie del hueso en el cual los osteoclastos secretan protones, llevando a la disolución de hidroxiapatita y proteasas involucradas en la degradación de la matriz orgánica. Los productos resultantes de la degradación son endocytosed, transportado a través de la célula a la superficie de la membrana opuesta a la superficie del hueso y segregada, un proceso llamado transcitosis10,11.
Los resultados de estudios en vivo y en vitro indican que el uranio inhibe la formación de hueso y altera el número y la actividad de osteoblastos7,12. En contraste, los efectos del uranio sobre la resorción del hueso y osteoclastos han sido poco explorados. Varios en vivo estudios han reportado un aumento de la resorción del hueso después de la administración de nitrato de uranilo a ratones o ratas13,14. Además, una investigación epidemiológica sugiere que el aumento en la ingesta de uranio mediante agua potable tendía a asociarse con un aumento en el nivel del suero de un marcador de resorción ósea en hombres15. Tomados en conjunto, estos resultados llevaron a la conclusión de que el uranio, que se acumula en el hueso podría promover la resorción ósea. Sin embargo, los mecanismos celulares implicados en este efecto potencial de uranio siguen siendo una cuestión abierta. Por esta razón, decidimos examinar los efectos del uranio sobre el comportamiento de resorbing las células óseas.
Aquí, describimos el protocolo que hemos establecido para caracterizar y cuantificar los efectos del uranio natural sobre la viabilidad de los osteoclastos y en la diferenciación de osteoclastos y la actividad reabsorbedor. Los experimentos descritos en este documento se han realizado con la línea celular RAW 264.7 macrófago transformado murino, que pueden distinguir fácilmente en osteoclastos cuando se cultivan en presencia de la citoquina RANKL para 4 o 5 días, y que clásicamente se utiliza para estudiar diferenciación y función de los osteoclastos16. Los procedimientos desarrollados son confiables, dar resultados altamente reproducibles y son plenamente aplicable a osteoclastos primarios. Por todas estas razones, creemos que esta metodología es útil para obtener una mejor comprensión de los mecanismos moleculares implicados en la toxicidad del uranio en el hueso. Además, consideramos que este enfoque puede ser adaptado como una herramienta de detección para la identificación de uranio nuevos agentes quelantes.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-604F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-MEM</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-169F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMEM without phenol red</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-668E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water for cell culture</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-724F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;L-Glutamine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution 0.4%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone fetal bovine serum</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.5% sodium bicarbonate aqueous solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>387A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin Red S sodium salt, 1% w/v aq. sol.</td>
			<td>Alfa Aeros</td>
			<td>42746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>3987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell 24 well plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask 75 cm2</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Conical Tubes 50 ml</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrapers 30 cm</td>
			<td>TPP</td>
			<td>90003</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for analyzing the impacts of natural uranium on in vitro osteoclastogenesis

Uranio se ha demostrado que interfieren con la fisiología del hueso y está bien establecido que este metal se acumula en el hueso. Sin embargo, poco se sabe sobre el efecto del uranio natural en el comportamiento de las células óseas. En particular, el impacto del uranio en los osteoclastos, las células responsables de la resorción de la matriz ósea, no está documentado. Para investigar esta cuestión, hemos establecido un nuevo protocolo con acetato de uranilo como fuente de uranio natural y la línea de celular RAW 264.7 murina como un modelo de precursores de osteoclastos. En este documento, nos detalló todos los ensayos necesarios para prueba de citotoxicidad de uranio en precursores de los osteoclastos y evaluar su impacto en la osteoclastogénesis y la función resorbing de osteoclastos maduros. Las condiciones hemos desarrollado, en particular para la preparación de medios de cultivo que contienen uranilo y para la siembra de RAW 264.7 células permiten obtener resultados confiables y altamente reproductivos. Por otra parte, hemos optimizado el uso de herramientas de software para facilitar el análisis de diversos parámetros como el tamaño de los osteoclastos o el porcentaje de la matriz correspondiente.

Tinción de fosfatasa ácida tartrato-resistente fue utilizado para visualizar los osteoclastos como grandes células púrpura que tienen 3 o más núcleos. Imágenes representativas de los osteoclastos de RAW 264.7 células cultivadas en presencia de RANKL e iones de uranilo se muestran en la figura 1. Cambios en número y tamaño de los osteoclastos en respuesta a uranio son fácilmente visibles en imágenes compuestas de los pozos todas y en imágenes ampl...

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Methods for Analyzing the Impacts of Natural Uranium on In Vitro Osteoclastogenesis

Uranio se sabe que afectan el metabolismo óseo. Aquí, presentamos un protocolo dirigido a investigar el efecto de la exposición de uranio natural en la viabilidad, la diferenciación y la función de los osteoclastos, las células de reabsorción ósea.

Métodos para analizar los efectos del uranio Natural en In Vitro la osteoclastogénesis

Uranium has been shown to interfere with bone physiology and it is well established that this metal accumulates in bone. However, little is known about ...

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