Name: serum and plasma copy number detection using real-time pcr
Uploaded: 2017-12-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR at JoVE.com

データ解析のサポート、キアラ モリナーリとフィリッポ アングイッラーラに感謝します。

コピー数解析のリアルタイム PCR を実行する血清または血漿サンプルからの DNA の隔離のプロトコルの構成します。特定のターゲットのためのリアルタイム PCR、DNA 量制御 (分光光度計) DNA の抽出を行った。図 1手順とタイム ラインの概要について報告する.
プロトコルは、IRST 人間研究倫理委員会のガイドラインに従います。
1. 血...

<ol>
	<li>Salvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+DNA+as+a+diagnostic+marker+for+cancer:+current+insights.">Cell-free DNA as a diagnostic marker for cancer: current insights.</a> Onco Targets Ther. 9, 6549-6559 (2016).</li><li>Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+DNA+as+a+liquid+biopsy+for+cancer.">Circulating tumor DNA as a liquid biopsy for cancer.</a> Clin. Chem. 61 (1), 112-123 (2015).</li><li>Murtaza, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+analysis+of+acquired+resistance+to+cancer+therapy+by+sequencing+of+plasma+DNA.">Non-invasive analysis of acquired resistance to cancer therapy by sequencing of plasma DNA.</a> Nature. 497 (7447), 108-112 (2013).</li><li>Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B., Speicher, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+detection+of+genome-wide+somatic+copy+number+alterations+by+liquid+biopsies.">Non-invasive detection of genome-wide somatic copy number alterations by liquid biopsies.</a> Mol. Oncol. 10 (3), 494-502 (2016).</li><li>Diaz, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+evolution+of+acquired+resistance+to+targeted+EGFR+blockade+in+colorectal+cancers.">The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers.</a> Nature. 486 (7404), 537-540 (2012).</li><li>Dawson, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+circulating+tumor+DNA+to+monitor+metastatic+breast+cancer.">Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer.</a> N. Engl. J. Med. 368 (13), 1199-1209 (2013).</li><li>Salvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+cell-free+AR+and+CYP17A1+copy+number+variations+may+associate+with+outcome+of+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer+patients+treated+with+abiraterone.">Circulating cell-free AR and CYP17A1 copy number variations may associate with outcome of metastatic castration-resistant prostate cancer patients treated with abiraterone.</a> Br. J. Cancer. 112 (10), 1717-1724 (2015).</li><li>Salvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+AR+copy+number+and+outcome+to+enzalutamide+in+docetaxel-treated+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer.">Circulating AR copy number and outcome to enzalutamide in docetaxel-treated metastatic castration-resistant prostate cancer.</a> Oncotarget. 7 (25), 37839-37845 (2016).</li><li>Romanel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+AR+and+abiraterone-resistant+prostate+cancer.">Plasma AR and abiraterone-resistant prostate cancer.</a> Sci. Transl. Med. 7 (312), (2015).</li><li>Conteduca, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgen+receptor+gene+status+in+plasma+DNA+associates+with+worse+outcome+on+enzalutamide+or+abiraterone+for+castration-resistant+prostate+cancer:+a+multi-institution+correlative+biomarker+study.">Androgen receptor gene status in plasma DNA associates with worse outcome on enzalutamide or abiraterone for castration-resistant prostate cancer: a multi-institution correlative biomarker study.</a> Ann Oncol. , (2017).</li><li>Attard, G., Antonarakis, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostate+cancer:+AR+aberrations+and+resistance+to+abiraterone+or+enzalutamide.">Prostate cancer: AR aberrations and resistance to abiraterone or enzalutamide.</a> Nat. Rev. Urol. 13 (12), 697-698 (2016).</li><li>Lee, T. H., Montalvo, L., Chrebtow, V., Busch, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+genomic+DNA+in+plasma+and+serum+samples:+higher+concentrations+of+genomic+DNA+found+in+serum+than+in+plasma.">Quantitation of genomic DNA in plasma and serum samples: higher concentrations of genomic DNA found in serum than in plasma.</a> Transfusion. 41 (2), 276-282 (2001).</li><li>Chan, K. C., Yeung, S. W., Lui, W. B., Rainer, T. H., Lo, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+preanalytical+factors+on+the+molecular+size+of+cell-free+DNA+in+blood.">Effects of preanalytical factors on the molecular size of cell-free DNA in blood.</a> Clin. Chem. 51 (4), 781-784 (2005).</li></ol>

ARCN における血清と血漿中のサンプルは、去勢抵抗性前立腺癌 (CRPC) 患者の層別化のための新しい非侵襲的アプローチを表します。それは最近AR CN は CRPC 患者アビラテロンおよび enzalutamide、化学療法7,8,9,10前後の結果を予測することが実証されています。
我々 の...

循環血液の細胞 DNA (cfDNA) は、がんの診断、予後、監視、および治療抵抗1,2の予測のためのバイオ マーカーの最適なソースであること実証されています。多くの研究は、DNA 変異 (突然変異、コピー数変異組織におけるエピジェネティック修飾) と対応するプラズマ サンプル1、腫瘍 DNA (葉緑体) の循環があることを確認で見つけられるそれらと良い一致を示しています。原発巣と転移腫瘍組織変化3のための情報。葉緑体を勉強の可能性こうしてゲノムの語順換えおよび特定遺伝子4、潜在的転移のクローンと subclonal のセルを識別するコピー数変化 (CNVs) の再構築が可能します。葉緑体は、がん治療のモニタリングとして特定の突然変異および関連の特定の目標とされた療法5,6CNVs を抱いてそれに特に有用であること示されています。また、組織生検の必要性を克服し、非侵襲的な方法で特定のがんの治療の間に異なった時に取得される結果をことができます。
前立腺癌細胞のアンドロゲンを循環の相関について受容体 (AR) CNVs と治療、アビラテロンおよび enzalutamide への応答が示されていることを示すAR遺伝子のコピー数 (CN) cfDNA 可能性があります、有望なバイオ マーカー治療抵抗7,8,9,10,11を予測できます。別の感度、コスト、速さとさまざまなアプローチを使用して緯度における特定遺伝子の CNVs を評価できる (e.g。 リアルタイムでデジタル PCR および次世代シーケンス)。
ここで二重の試金, 血清と血漿サンプル7,8から cfDNA のAR CN を評価するため、リアルタイム PCR の技術に基づいて、シンプルで高速なアプローチについて述べる。前立腺癌 (RNaseP、通常コピー番号ステータスを持っている知られていた内部標準遺伝子としてAR (Xq12) の 5 イントロンと他の 2 つの遺伝子内にある 2 つの異なるゲノム領域に設計された PCR の試金が 2 つと考えてください。14q11; に位置します。前1、1 にある p 34)。精度と結果の感度を高めるためのものではなく、2 つの参照の遺伝子を選びました。60 の DNA 量 ng は、アッセイの組み合わせ (結合アッセイAR assay_1 + RNasePとAR assay_2 + AGO1) ごとに増幅されました。健康な男性から 3 つの血清または血漿 DNA サンプルはプールされ、校正器として使用します。カットオフと考えた &#62; AR利得の 1.5 と &#60; 削除の 0.5。この方法の主な利点の 1 つは、それが柔軟なことと他の遺伝子も評価できるということ、腫瘍の種類と特性に基づいて、内部標準遺伝子の変更です。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Serum Tubes</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367814</td>
			<td>whole blood tube for serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer EDTA Tubes</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>366643</td>
			<td>whole blood tube for plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>the user could use also other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Copy Number assay</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4400291</td>
			<td>Pre-designed and validated assays with FAM-dye. We used the followig assay: AR_assay1: hs04107225 adn AR_assay2: hs04511283</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Copy Number assay (modified)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4467084</td>
			<td>Pre-designed assay modified with VIC-dye: AGO1: Hs02320401_cn</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Copy Number Reference Assay, human, RNase P</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4403326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4326708</td>
			<td>Master mix for Real Time PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Mini Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51304</td>
			<td>DNA extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp 96-Well Plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N8010560</td>
			<td>plates for realt time PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>the user could use also other spectrophotometric methods to quantify DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7500 Fast Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystem</td>
			<td>-</td>
			<td>the user could use also other real time instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CopyCaller Software</td>
			<td>Applied Biosystem</td>
			<td>-</td>
			<td>Software for copy number analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

serum and plasma copy number detection using real-time pcr

血清と血漿細胞 DNA (cfDNA) は、がんの診断、予後、監視、および治療抵抗性の予測のためのバイオ マーカーの報知的な非侵襲的なソースとして示されています。頻度の高いイベントは、アンドロゲン受容体 (AR) 遺伝子コピー数 (CN) を得る仮説から始まって転移性去勢抵抗性前立腺癌 (mCRPC)、提案する潜在的な予測バイオ マーカーとしての cfDNA でこのイベントを分析します。
AR CN 2 別のリアルタイム PCR の試金および 2 遺伝子 (RNasePと前1) を使用して cfDNA の評価を行った。60 の DNA 量 ng は、アッセイの組み合わせごとに使用されました。ARCN の利得より正確な方法としてデジタル PCR を使用して確認されました。CN 変動解析はすでに mCRPC の設定で治療抵抗性の予測のために有益であること実証されているが、ことができる役に立つことも異なる患者の設定で他の目的のため。CfDNA CN 分析いくつかの利点があります: それは非侵襲的な迅速かつ簡単に実行、および血清または血漿材料の少量から開始します。

合計 cfDNA 濃度は 6.12 ng/μ L の中央値を示すすべてのサンプル分析、吸光光度法による定量 (範囲: 2.00 23.71 ng/μ L) 血清サンプルの 3.21 ng/μ L の中央値 (範囲: 2.31 8.49 ng/μ L) 血漿検体の。リアルタイム PCR 実験による検体の合計を行った。
テスト感度は、コピー数解析の校正サンプルとしても使用されている健康なドナーから<e...

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Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

本稿では、血清または血漿 dna のリアルタイム PCR のアプローチを使用して実行されるコピー数変動解析について説明します。去勢抵抗性前立腺癌患者への薬剤耐性予測に適していますが、それはまた他の病気のために有益かもしれない。

血清およびリアルタイム PCR を用いたプラズマ コピー数検出

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Detection of Rare Mutations in CtDNA Using Next Generation Sequencing

次世代シーケンシングによる葉緑体の稀な遺伝子変異の検出

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. ...

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

チップを使ったデジタル PCR による新鮮凍結胃癌組織内CDH1まれなトラン スクリプト変種の検出

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal ...

Dried Blood and Serum Spots As A Useful Tool for Sample Storage to Evaluate Cancer Biomarkers

がんバイオ マーカーを評価するサンプル貯蔵のための便利なツールとして血液や血清スポットを乾燥

Blood sample quality is crucial to ensure accurate downstream analyses such as real-time PCR or ELISA. Correct storage of biological materials is the ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

CD8 による培養腫瘍細胞のアポトーシスのリアルタイム検出+ T 細胞腫瘍浸潤骨髄細胞の免疫抑制機能を勉強するには

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures

後根神経節軸軸索-オリゴデンドロサイト共培養におけるヒトグリオーマ細胞移動のリアルタイムモニタリング

Glioblastoma is one of the most aggressive human cancers due to extensive cellular heterogeneity and the migration properties of hGCs. In order to better ...

Detection of Retrotransposition Activity of Hot LINE-1s by Long-Distance Inverse PCR

長距離逆PCRによるホットLINE-1のレトロトランスポジション活性の検出

Long interspersed nuclear elements 1 (LINE-1s) are the only family of mobile genetic elements in the human genome that can move autonomously. They do so ...

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

尾静脈転移アッセイとリアルタイムインビボイメージングの併用による乳癌転移性コロニー形成と肺の負担の定量化

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Impedance-based Real-time Measurement of Cancer Cell Migration and Invasion

がん細胞の移動と浸潤のインピーダンスベースリアルタイム測定

Cancer arises due to uncontrolled proliferation of cells initiated by genetic instability, mutations, and environmental and other stress factors. These ...

Measuring Real-time Drug Response in Organotypic Tumor Tissue Slices

組織性腫瘍組織スライスにおけるリアルタイム薬物応答の測定

Tumor tissues are composed of cancerous cells, infiltrated immune cells, endothelial cells, fibroblasts, and extracellular matrix. This complex milieu ...

Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

がん患者の血漿サンプルにおける無細胞DNAの検出

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis ...

血清およびリアルタイム PCR を用いたプラズマ コピー数検出

血清およびリアルタイム PCR を用いたプラズマコピー数検出