Name: serum and plasma copy number detection using real-time pcr
Uploaded: 2017-12-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR at JoVE.com

Agradecemos a Chiara Molinari e Filippo Martignano para apoio na análise de dados.

O protocolo consiste o isolamento do DNA de amostras de soro ou plasma para realizar o PCR em tempo real para análise de número de cópia. Extração de DNA, controle de quantidade de DNA (espectrofotômetro) e PCR em tempo real para alvos específicos foram realizados. Na Figura 1, um resumo dos procedimentos e linha do tempo são relatados.
O protocolo segue as diretrizes do Comitê de ética de pesquisa humana IRST.
1. processamento ...

<ol>
	<li>Salvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+DNA+as+a+diagnostic+marker+for+cancer:+current+insights.">Cell-free DNA as a diagnostic marker for cancer: current insights.</a> Onco Targets Ther. 9, 6549-6559 (2016).</li><li>Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+DNA+as+a+liquid+biopsy+for+cancer.">Circulating tumor DNA as a liquid biopsy for cancer.</a> Clin. Chem. 61 (1), 112-123 (2015).</li><li>Murtaza, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+analysis+of+acquired+resistance+to+cancer+therapy+by+sequencing+of+plasma+DNA.">Non-invasive analysis of acquired resistance to cancer therapy by sequencing of plasma DNA.</a> Nature. 497 (7447), 108-112 (2013).</li><li>Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B., Speicher, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+detection+of+genome-wide+somatic+copy+number+alterations+by+liquid+biopsies.">Non-invasive detection of genome-wide somatic copy number alterations by liquid biopsies.</a> Mol. Oncol. 10 (3), 494-502 (2016).</li><li>Diaz, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+evolution+of+acquired+resistance+to+targeted+EGFR+blockade+in+colorectal+cancers.">The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers.</a> Nature. 486 (7404), 537-540 (2012).</li><li>Dawson, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+circulating+tumor+DNA+to+monitor+metastatic+breast+cancer.">Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer.</a> N. Engl. J. Med. 368 (13), 1199-1209 (2013).</li><li>Salvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+cell-free+AR+and+CYP17A1+copy+number+variations+may+associate+with+outcome+of+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer+patients+treated+with+abiraterone.">Circulating cell-free AR and CYP17A1 copy number variations may associate with outcome of metastatic castration-resistant prostate cancer patients treated with abiraterone.</a> Br. J. Cancer. 112 (10), 1717-1724 (2015).</li><li>Salvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+AR+copy+number+and+outcome+to+enzalutamide+in+docetaxel-treated+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer.">Circulating AR copy number and outcome to enzalutamide in docetaxel-treated metastatic castration-resistant prostate cancer.</a> Oncotarget. 7 (25), 37839-37845 (2016).</li><li>Romanel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+AR+and+abiraterone-resistant+prostate+cancer.">Plasma AR and abiraterone-resistant prostate cancer.</a> Sci. Transl. Med. 7 (312), (2015).</li><li>Conteduca, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgen+receptor+gene+status+in+plasma+DNA+associates+with+worse+outcome+on+enzalutamide+or+abiraterone+for+castration-resistant+prostate+cancer:+a+multi-institution+correlative+biomarker+study.">Androgen receptor gene status in plasma DNA associates with worse outcome on enzalutamide or abiraterone for castration-resistant prostate cancer: a multi-institution correlative biomarker study.</a> Ann Oncol. , (2017).</li><li>Attard, G., Antonarakis, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostate+cancer:+AR+aberrations+and+resistance+to+abiraterone+or+enzalutamide.">Prostate cancer: AR aberrations and resistance to abiraterone or enzalutamide.</a> Nat. Rev. Urol. 13 (12), 697-698 (2016).</li><li>Lee, T. H., Montalvo, L., Chrebtow, V., Busch, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+genomic+DNA+in+plasma+and+serum+samples:+higher+concentrations+of+genomic+DNA+found+in+serum+than+in+plasma.">Quantitation of genomic DNA in plasma and serum samples: higher concentrations of genomic DNA found in serum than in plasma.</a> Transfusion. 41 (2), 276-282 (2001).</li><li>Chan, K. C., Yeung, S. W., Lui, W. B., Rainer, T. H., Lo, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+preanalytical+factors+on+the+molecular+size+of+cell-free+DNA+in+blood.">Effects of preanalytical factors on the molecular size of cell-free DNA in blood.</a> Clin. Chem. 51 (4), 781-784 (2005).</li></ol>

AR Análise CN em amostra de soro e plasma representa uma abordagem nova, não-invasivo para a estratificação de pacientes com câncer de próstata resistente a castração (CRPC). Foi recentemente demonstrado que a CN AR é capaz de prever os resultados no CRPC pacientes tratados com abiraterone e enzalutamide, antes e depois da quimioterapia7,8,9,10.
<p class="jove_con...

Circular célula DNA gratuito (cfDNA) no sangue tem demonstrado para ser uma óptima fonte de biomarcadores para diagnóstico de câncer, prognóstico, acompanhamento e previsão de tratamento resistência1,2. Muitos estudos têm mostrado uma boa concordância entre alterações de DNA (mutações, variações de número de cópia, modificações epigenéticas em tecidos) e aqueles encontrados no correspondente plasma amostras1, confirmando que circulam o DNA do tumor (ctDNA) é informativo para o tumor primário e metastático tecido alterações3. A possibilidade de estudar ctDNA permite, assim, para a reconstrução de rearranjos do genoma e variações de número de cópia (CNVs) em oncogenes específicos4, identificando potencialmente metastáticas células clonais e subclonal. CtDNA tem demonstrado ser clinicamente útil especialmente para câncer tratamento monitoramento à medida que abriga mutações específicas e CNVs, relacionadas com terapias alvo específico5,6. Também supera a necessidade de biópsias do tecido e permite resultados a serem obtidos em diferentes momentos durante um tratamento de câncer específicos, de forma não-invasiva.
No que se refere a câncer de próstata, uma correlação significativa entre a circulação livre de células andrógeno CNVs do receptor (AR) e tratamento demonstrou-se a resposta a abiraterone e enzalutamide, indicando AR gene cópia número (CN) em cfDNA pode ser uma biomarcador promissor capaz de prever tratamento resistência7,8,9,10,11. CNVs de genes específicos no ctDNA podem ser avaliados usando diferentes abordagens com diferente sensibilidade, custo e rapidez (EG. PCR em tempo real, Digital e a próxima geração de sequenciamento).
Aqui nós descrevemos uma abordagem simples e rápida, com base em ensaios de frente e verso em tecnologia PCR em tempo real, para avaliar o AR CN em cfDNA de soro e plasma amostras7,8. Consideramos dois diferentes ensaios PCR concebidos em duas diferentes regiões genômicas dentro intron 5 do AR (Xq12) e dois outros genes, como genes de referência padrão interno, conhecidos por ter um status de número de cópia normal em câncer de próstata (RNaseP, localizado no 14q11; AGO1, localizado no 1 p. 34). Nós selecionamos os genes de duas referência, ao invés, para aumentar a precisão e a sensibilidade dos resultados. Uma quantidade de DNA de 60 ng foi amplificado para cada combinação de ensaio (ensaio combinado para AR-assay_1 + RNaseP e de AR-assay_2 + AGO1). Três amostras de DNA de soro ou plasma de homens saudáveis foram agrupadas e usadas como um calibrador. Consideramos a cortes de &#62; 1.5 para ganho de AR e &#60; 0.5 para exclusão. Uma das principais vantagens deste método é que é flexível e que outros genes podem também ser avaliados, alterando os genes de padrão interno de referência, com base no tipo de tumor e características.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Serum Tubes</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367814</td>
			<td>whole blood tube for serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer EDTA Tubes</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>366643</td>
			<td>whole blood tube for plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>the user could use also other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Copy Number assay</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4400291</td>
			<td>Pre-designed and validated assays with FAM-dye. We used the followig assay: AR_assay1: hs04107225 adn AR_assay2: hs04511283</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Copy Number assay (modified)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4467084</td>
			<td>Pre-designed assay modified with VIC-dye: AGO1: Hs02320401_cn</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Copy Number Reference Assay, human, RNase P</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4403326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4326708</td>
			<td>Master mix for Real Time PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Mini Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51304</td>
			<td>DNA extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp 96-Well Plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N8010560</td>
			<td>plates for realt time PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>the user could use also other spectrophotometric methods to quantify DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7500 Fast Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystem</td>
			<td>-</td>
			<td>the user could use also other real time instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CopyCaller Software</td>
			<td>Applied Biosystem</td>
			<td>-</td>
			<td>Software for copy number analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

serum and plasma copy number detection using real-time pcr

Soro e plasma cell DNA gratuito (cfDNA) tem sido demonstrado como fonte informativa, não-invasivo de biomarcadores para diagnóstico de câncer, prognóstico, acompanhamento e previsão da resistência do tratamento. A partir da hipótese de que a ganhar o número de cópia de gene do andrógeno receptores (AR) (CN) é um evento frequente no cancro da próstata de castração metastático resistência (Abiraterona), propomo-na analisar este evento em cfDNA como um potencial biomarcador preditivo.
Nós avaliamos AR CN em cfDNA usando 2 diferentes ensaios PCR em tempo real e 2 genes de referência (RNaseP e AGO1). Quantidade de DNA de 60 ng foi usado para cada combinação de ensaio. AR Ganho de CN foi confirmado usando PCR Digital como um método mais preciso. Análise de variação de CN já foi demonstrado ser informativo para a previsão da resistência do tratamento no cenário do Abiraterona, mas pode ser útil também para outros fins em diferentes configurações de paciente. Análise CN na cfDNA tem várias vantagens: é não-invasiva, rápida e fácil de executar, e começa de um pequeno volume de material de soro ou plasma.

CfDNA total concentração era quantificável por espectrofotometria para todas as amostras analisadas, apresentando uma mediana de 6,12 ng / µ l (intervalo: 2,00-23.71 ng / µ l) para amostras de soro e uma mediana de 3,21 ng / µ l (intervalo: 2.31-8.49 ng / µ l) para as amostras de plasma. Foram analisados um total de 115 amostras por experimentos PCR em tempo real.
Teste de sensibilidade foi avaliada utilizando DNA misto d...

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Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

Este manuscrito descreve a análise de variação número da cópia realizada em DNA de soro ou plasma utilizando a abordagem PCR em tempo real. Este método é adequado para a previsão da resistência a drogas em pacientes com câncer de próstata resistente a castração, mas poderia ser informativo também para outras doenças.

Soro e Plasma cópia número deteção usando PCR em tempo real

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Detection of Rare Mutations in CtDNA Using Next Generation Sequencing

Deteção de mutações raras no CtDNA usando a próxima geração de sequenciamento

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. ...

Pesquisa do câncer

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

Deteção de uma variante de transcrição raro CDH1 em tecidos de câncer gástrico fresco congelado pelo PCR Digital baseada em Chip

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal ...

Dried Blood and Serum Spots As A Useful Tool for Sample Storage to Evaluate Cancer Biomarkers

Secas de sangue e soro manchas como uma ferramenta útil para o armazenamento de amostra avaliar biomarcadores de câncer

Blood sample quality is crucial to ensure accurate downstream analyses such as real-time PCR or ELISA. Correct storage of biological materials is the ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Detecção de tempo real em Vitro Tumor celular apoptose induzida por CD8+ T células para estudar as funções imunológicas supressora de Tumor infiltrando células mieloides

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures

Monitoramento em tempo real da migração humana de células glioma em co-culturas de raiz dorsal Ganglion Axon-Oligodendrocyte

Glioblastoma is one of the most aggressive human cancers due to extensive cellular heterogeneity and the migration properties of hGCs. In order to better ...

Detection of Retrotransposition Activity of Hot LINE-1s by Long-Distance Inverse PCR

Detecção de atividade de retrotransposição de Hot LINE-1s por PCR inverso de longa distância

Long interspersed nuclear elements 1 (LINE-1s) are the only family of mobile genetic elements in the human genome that can move autonomously. They do so ...

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

Uso combinado de ensaios de metástase de veia de cauda e imagens in vivo em tempo real para quantificar a colonização metastática do câncer de mama e carga nos pulmões

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Impedance-based Real-time Measurement of Cancer Cell Migration and Invasion

Medição em tempo real da migração e invasão de células cancerígenas

Cancer arises due to uncontrolled proliferation of cells initiated by genetic instability, mutations, and environmental and other stress factors. These ...

Measuring Real-time Drug Response in Organotypic Tumor Tissue Slices

Medição da resposta de drogas em tempo real em fatias de tecido tumoral organotípico

Tumor tissues are composed of cancerous cells, infiltrated immune cells, endothelial cells, fibroblasts, and extracellular matrix. This complex milieu ...

Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

Detecção de DNA livre de células em amostras de plasma de sangue de pacientes com câncer

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis ...