Name: serum and plasma copy number detection using real-time pcr
Uploaded: 2017-12-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR at JoVE.com

Agradecemos a Chiara Molinari y Filippo Martignano apoyo en análisis de datos.

El protocolo consiste en el aislamiento de ADN de muestras de suero o plasma para realizar PCR en tiempo real para el análisis del número de copia. Se realizaron la extracción de ADN, control de la cantidad de ADN (espectrofotómetro) y PCR en tiempo real para objetivos específicos. En la figura 1, se informó un resumen de los procedimientos y la línea de tiempo.
El protocolo sigue las pautas del primer Comité de ética de investigación humana.
<p clas...

<ol>
	<li>Salvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+DNA+as+a+diagnostic+marker+for+cancer:+current+insights.">Cell-free DNA as a diagnostic marker for cancer: current insights.</a> Onco Targets Ther. 9, 6549-6559 (2016).</li><li>Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+DNA+as+a+liquid+biopsy+for+cancer.">Circulating tumor DNA as a liquid biopsy for cancer.</a> Clin. Chem. 61 (1), 112-123 (2015).</li><li>Murtaza, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+analysis+of+acquired+resistance+to+cancer+therapy+by+sequencing+of+plasma+DNA.">Non-invasive analysis of acquired resistance to cancer therapy by sequencing of plasma DNA.</a> Nature. 497 (7447), 108-112 (2013).</li><li>Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B., Speicher, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+detection+of+genome-wide+somatic+copy+number+alterations+by+liquid+biopsies.">Non-invasive detection of genome-wide somatic copy number alterations by liquid biopsies.</a> Mol. Oncol. 10 (3), 494-502 (2016).</li><li>Diaz, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+evolution+of+acquired+resistance+to+targeted+EGFR+blockade+in+colorectal+cancers.">The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers.</a> Nature. 486 (7404), 537-540 (2012).</li><li>Dawson, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+circulating+tumor+DNA+to+monitor+metastatic+breast+cancer.">Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer.</a> N. Engl. J. Med. 368 (13), 1199-1209 (2013).</li><li>Salvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+cell-free+AR+and+CYP17A1+copy+number+variations+may+associate+with+outcome+of+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer+patients+treated+with+abiraterone.">Circulating cell-free AR and CYP17A1 copy number variations may associate with outcome of metastatic castration-resistant prostate cancer patients treated with abiraterone.</a> Br. J. Cancer. 112 (10), 1717-1724 (2015).</li><li>Salvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+AR+copy+number+and+outcome+to+enzalutamide+in+docetaxel-treated+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer.">Circulating AR copy number and outcome to enzalutamide in docetaxel-treated metastatic castration-resistant prostate cancer.</a> Oncotarget. 7 (25), 37839-37845 (2016).</li><li>Romanel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+AR+and+abiraterone-resistant+prostate+cancer.">Plasma AR and abiraterone-resistant prostate cancer.</a> Sci. Transl. Med. 7 (312), (2015).</li><li>Conteduca, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgen+receptor+gene+status+in+plasma+DNA+associates+with+worse+outcome+on+enzalutamide+or+abiraterone+for+castration-resistant+prostate+cancer:+a+multi-institution+correlative+biomarker+study.">Androgen receptor gene status in plasma DNA associates with worse outcome on enzalutamide or abiraterone for castration-resistant prostate cancer: a multi-institution correlative biomarker study.</a> Ann Oncol. , (2017).</li><li>Attard, G., Antonarakis, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostate+cancer:+AR+aberrations+and+resistance+to+abiraterone+or+enzalutamide.">Prostate cancer: AR aberrations and resistance to abiraterone or enzalutamide.</a> Nat. Rev. Urol. 13 (12), 697-698 (2016).</li><li>Lee, T. H., Montalvo, L., Chrebtow, V., Busch, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+genomic+DNA+in+plasma+and+serum+samples:+higher+concentrations+of+genomic+DNA+found+in+serum+than+in+plasma.">Quantitation of genomic DNA in plasma and serum samples: higher concentrations of genomic DNA found in serum than in plasma.</a> Transfusion. 41 (2), 276-282 (2001).</li><li>Chan, K. C., Yeung, S. W., Lui, W. B., Rainer, T. H., Lo, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+preanalytical+factors+on+the+molecular+size+of+cell-free+DNA+in+blood.">Effects of preanalytical factors on the molecular size of cell-free DNA in blood.</a> Clin. Chem. 51 (4), 781-784 (2005).</li></ol>

AR Análisis CN en suero y plasma de la muestra representa un nuevo enfoque no invasivo para la estratificación de pacientes con cáncer de próstata resistente a castración (CPRP). Se ha demostrado recientemente que el CN AR es capaz de predecir los resultados en pacientes de CPRP tratados con abiraterona y enzalutamide, antes y después de quimioterapia7,8,9,10.
<p cla...

ADN libre de la célula (cfDNA) en la sangre que circula ha demostrado ser una fuente óptima de biomarcadores para el diagnóstico de cáncer, pronóstico, seguimiento y predicción de tratamiento resistencia1,2. Muchos estudios han demostrado una buena concordancia entre alteraciones del ADN (mutaciones, variaciones de número de copia, las modificaciones epigenéticas en los tejidos) y los que se encuentran en el correspondiente plasma las muestras1, confirmando que circula ADN del tumor (ctDNA) es informativo para el tumor primario y metastático tejido alteraciones3. Así, la posibilidad de estudiar ctDNA permite la reconstrucción de los cambios de genomic y variaciones de número de copia (CNVs) en oncogenes específicos4, identificación de células clonales y subclonal potencialmente metastásicas. CtDNA ha demostrado ser clínicamente útil para el cáncer tratamiento seguimiento alberga mutaciones específicas y CNVs, relacionadas con las terapias dirigidas específicas5,6. También supera la necesidad de biopsias de tejido y permite resultados obtenidos en diferentes momentos durante un tratamiento de cáncer específico de forma no invasiva.
En relación con el cáncer de próstata, una correlación significativa entre la circulación libre de células andrógeno CNVs receptor (AR) y el tratamiento se ha demostrado respuesta a abiraterona y enzalutamide, que indica AR gen número de copia (CN) en cfDNA puede ser un prometedor biomarcador capaz de predecir el tratamiento resistencia7,8,9,10,11. CNVs de genes específicos en ctDNA pueden evaluarse utilizando diferentes enfoques con diferente sensibilidad, costo y rapidez (ej. PCR en tiempo real, Digital y secuenciación de próxima generación).
Aquí describimos un enfoque simple y rápido, basado en ensayos de duplex en tecnología PCR en tiempo real, para la evaluación de la AR CN en cfDNA de de7,de las muestras de suero y plasma8. Se consideraron dos diferentes ensayos PCR diseñados en dos diferentes regiones genómicas dentro del intrón 5 de AR (Xq12) y dos otros genes, como genes de referencia estándar interna sabidos que tiene un estatus de número de copia normal en el cáncer de próstata (RNaseP, situado en 14q11; AGO1, situado en 1 p 34). Se seleccionaron los genes de referencia dos, en lugar de uno, para aumentar la precisión y la sensibilidad de los resultados. Una cantidad de ADN de 60 ng fue amplificado para cada combinación de ensayo (ensayo combinado de AR-assay_1 + RNaseP y de AR-assay_2 + AGO1). Tres muestras de ADN de suero o plasma de varones sanos se agruparon y utilizadas como calibrador. Se consideraron los atajos de &#62; 1.5 para ganancia de AR y &#60; 0.5 para su eliminación. Una de las principales ventajas de este método es que es flexible y que se pueden evaluar también otros genes, cambiando los genes de referencia interna, sobre la base de características y tipo tumoral.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Serum Tubes</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367814</td>
			<td>whole blood tube for serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer EDTA Tubes</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>366643</td>
			<td>whole blood tube for plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>the user could use also other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Copy Number assay</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4400291</td>
			<td>Pre-designed and validated assays with FAM-dye. We used the followig assay: AR_assay1: hs04107225 adn AR_assay2: hs04511283</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Copy Number assay (modified)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4467084</td>
			<td>Pre-designed assay modified with VIC-dye: AGO1: Hs02320401_cn</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Copy Number Reference Assay, human, RNase P</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4403326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4326708</td>
			<td>Master mix for Real Time PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Mini Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51304</td>
			<td>DNA extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp 96-Well Plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N8010560</td>
			<td>plates for realt time PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>the user could use also other spectrophotometric methods to quantify DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7500 Fast Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystem</td>
			<td>-</td>
			<td>the user could use also other real time instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CopyCaller Software</td>
			<td>Applied Biosystem</td>
			<td>-</td>
			<td>Software for copy number analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

serum and plasma copy number detection using real-time pcr

Suero y plasma de la célula ADN libre (cfDNA) se ha mostrado como una fuente informativa, no-invasivo de biomarcadores para el diagnóstico de cáncer, pronóstico, seguimiento y predicción de la resistencia al tratamiento. A partir de la hipótesis de que el aumento del número de copias de genes andrógenos receptor (AR) (CN) es un evento frecuente en cáncer de próstata de resistencia de castración metastático (mCRPC), nos proponemos analizar este evento en cfDNA como un biomarcador predictivo potencial.
Se evaluaron AR CN en cfDNA con 2 diferentes ensayos PCR en tiempo real y 2 genes de referencia (RNaseP y hace1). Cantidad de ADN de 60 ng fue utilizado para cada combinación de ensayo. AR Aumento de las CN se confirmó mediante PCR Digital como un método más preciso. Análisis de variación de CN ya ha demostrado para ser informativo para la predicción de la resistencia al tratamiento en el ajuste de mCRPC, pero podría ser útil también para otros fines en diferentes contextos de paciente. Análisis CN en cfDNA tiene varias ventajas: es no invasivo, rápido y fácil de realizar, y se parte de un pequeño volumen de suero o plasma.

Concentración total cfDNA fue cuantificable por espectrofotometría para todas las muestras analizadas, mostrando un nivel medio de 6,12 ng/μl (rango: 23.71 2.00 ng/μL) para las muestras de suero y una media de 3.21 ng/μl (rango: 2.31-8.49 ng/μL) para muestras de plasma. Se analizaron un total de 115 muestras de experimentos PCR en tiempo real.
Sensibilidad de la prueba se evaluó mediante suero mezclado ADN de pacientes co...

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Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

Este manuscrito describe el análisis de variación número de la copia realizado en la DNA del suero o plasma utilizando el método PCR en tiempo real. Este método es adecuado para la predicción de resistencia a medicamentos en pacientes con cáncer de próstata resistente a castración, pero podría ser informativa también para otras enfermedades.

Suero y Plasma copia número detección mediante PCR en tiempo real

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Detection of Rare Mutations in CtDNA Using Next Generation Sequencing

Detección de mutaciones raras en CtDNA usando la siguiente secuencia de generación

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

Detección de una variante rara transcripción de CDH1 en tejidos de cáncer gástrico congelado por PCR Digital basado en el Chip

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal ...

Dried Blood and Serum Spots As A Useful Tool for Sample Storage to Evaluate Cancer Biomarkers

Secado de la sangre y manchas de suero como una herramienta útil para el almacenamiento de la muestra a evaluar biomarcadores de cáncer

Blood sample quality is crucial to ensure accurate downstream analyses such as real-time PCR or ELISA. Correct storage of biological materials is the ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Tiempo real detección de Vitro Tumor de la célula apoptosis inducida por CD8+ T las células para el estudio de las funciones inmunológicas de supresores de Tumor infiltrante de células mieloides

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

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Glioblastoma is one of the most aggressive human cancers due to extensive cellular heterogeneity and the migration properties of hGCs. In order to better ...

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Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

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