Name: improved protocol for chromatin immunoprecipitation from mouse skeletal muscle
Uploaded: 2017-11-06T17:00:00
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हम IGBMC उच्च प्रवाह अनुक्रमण सुविधा, "फ्रांस Génomique" कंसोर्टियम (ANR10-INBS-09-08) और विशेष रूप से IGBMC पशु सुविधा के कर्मचारियों में सभी IGBMC सामांय सेवाओं के एक सदस्य के सभी कर्मचारियों को धंयवाद । इस कार्य को CNRS, द INSERM, द AFM, द Ligue राष्ट्रीयकृत contre le Cancer, फ्रेंच स्टेट फंड के माध्यम से ANR के माध्यम से अनुदान का समर्थन किया गया Investissements d'Avenir बला ANR-10-IDEX-0002-02, द Labex INRT ANR-10-IDEX-0001-02 और ANR-AR2GR-16-CE11-009-01. funders अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि की तैयारी में कोई भूमिका नहीं थी । एस जे Ligue राष्ट्रीयकृत contre le कैंसर और ANR-AR2GR-16-CE11-009-01, और वी. यू द्वारा Ministère de l'Enseignement एट डे ला सूक्ष्म द्वारा समर्थित किया गया था । ID एक ' équipe labellisée ' का Ligue राष्ट्रीयकृत contre le Cancer है ।

चूहों को प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल और उपयोग के संबंध में संस्थागत दिशा-निर्देशों के अनुसार रखा गया और राष्ट्रीय पशु देखभाल दिशानिर्देशों के अनुसार (यूरोपियन कमीशन के डायरेक्टर 86/CEE/ फ्रेंच फरमान नं?...

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	<li>Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions.">Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions.</a> Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).</li><li>Furey, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+and+beyond:+new+and+improved+methodologies+to+detect+and+characterize+protein-DNA+interactions.">ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions.</a> Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).</li><li>Wade, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+Transcription+Regulatory+Networks+with+ChIP-seq+and+RNA-seq.">Mapping Transcription Regulatory Networks with ChIP-seq and RNA-seq.</a> Adv Exp Med Biol. 883, 119-134 (2015).</li><li>Alpern, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAF4,+a+subunit+of+transcription+factor+II+D,+directs+promoter+occupancy+of+nuclear+receptor+HNF4A+during+post-natal+hepatocyte+differentiation.">TAF4, a subunit of transcription factor II D, directs promoter occupancy of nuclear receptor HNF4A during post-natal hepatocyte differentiation.</a> Elife. 3, e03613 (2014).</li><li>Martianov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+occupancy+of+an+extended+repertoire+of+CREM+and+CREB+binding+loci+in+male+germ+cells.">Cell-specific occupancy of an extended repertoire of CREM and CREB binding loci in male germ cells.</a> BMC Genomics. 11, 530 (2010).</li><li>Achour, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+identity+genes+regulated+by+super-enhancers+are+preferentially+down-regulated+in+the+striatum+of+Huntington's+disease+mice.">Neuronal identity genes regulated by super-enhancers are preferentially down-regulated in the striatum of Huntington's disease mice.</a> Hum Mol Genet. 24 (12), 3481-3496 (2015).</li><li>Joshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TEAD+transcription+factors+are+required+for+normal+primary+myoblast+differentiation+in+vitro+and+muscle+regeneration+in+vivo.">TEAD transcription factors are required for normal primary myoblast differentiation in vitro and muscle regeneration in vivo.</a> PLoS Genet. 13 (2), e1006600 (2017).</li><li>Ohkawa, Y., Mallappa, C., Dacwag-Vallaster, C. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAK1+and+CtBP1+Regulate+the+Coupling+of+Neuronal+Activity+to+Muscle+Chromatin+and+Gene+Expression.">PAK1 and CtBP1 Regulate the Coupling of Neuronal Activity to Muscle Chromatin and Gene Expression.</a> Mol Cell Biol. 35 (24), 4110-4120 (2015).</li><li>Kuo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+glucocorticoid+receptor-binding+sites+in+myotubes+identifies+gene+networks+modulating+insulin+signaling.">Genome-wide analysis of glucocorticoid receptor-binding sites in myotubes identifies gene networks modulating insulin signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (28), 11160-11165 (2012).</li><li>Whyte, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Master+transcription+factors+and+mediator+establish+super-enhancers+at+key+cell+identity+genes.">Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes.</a> Cell. 153 (2), 307-319 (2013).</li><li>Benhaddou, A., Keime, C., Ye, T., Morlon, A., Michel, I., Jost, B., Mengus, G., Davidson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+TEAD4+regulates+expression+of+myogenin+and+the+unfolded+protein+response+genes+during+C2C12+cell+differentiation.">Transcription factor TEAD4 regulates expression of myogenin and the unfolded protein response genes during C2C12 cell differentiation.</a> Cell Death and Differentiation. 19 (2), 220-231 (2011).</li><li>Cowling, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+dynamin+2+expression+rescues+X-linked+centronuclear+myopathy.">Reducing dynamin 2 expression rescues X-linked centronuclear myopathy.</a> J Clin Invest. 124 (3), 1350-1363 (2014).</li><li>. ChIP Analysis Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/epigenetics-noncoding-rna-research/chromatin-remodeling/chromatin-immunoprecipitation-chip/chip-analysis.html">https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/epigenetics-noncoding-rna-research/chromatin-remodeling/chromatin-immunoprecipitation-chip/chip-analysis.html</a> (2017)</li></ol>

यहां हम वयस्क माउस कंकाल की मांसपेशियों और शो से क्रोमेटिन तैयारी के लिए एक उपंयास प्रोटोकॉल का वर्णन है कि इस क्रोमेटिन चिप प्रयोगों कि प्रतिलेखन कारक बाध्यकारी और आबंध मांसपेशी फाइबर नाभिक में citrullinat...

क्रोमेटिन immunoprecipitation (चिप) मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (qPCR) और उच्च प्रवाह अनुक्रमण (चिप-seq) के लिए युग्मित विभिन्न ऊतकों में प्रतिलेखन और epigenetic जीन अभिव्यक्ति के नियमन का अध्ययन करने के लिए पसंद के तरीके बन गए हैं और कक्ष-प्रकार1। इस तकनीक आबंध क्रोमेटिन संशोधनों के जीनोम व्यापक रूपरेखा, citrullinated संस्करण अधिभोग, और प्रतिलेखन कारक2,3बंधन की अनुमति देता है ।
जबकि प्रसंस्कृत कोशिकाओं से चिप प्रदर्शन अच्छी तरह से स्थापित है, स्तनधारी ऊतकों से चिप अधिक चुनौतीपूर्ण रहता है । चिप के लिए क्रोमेटिन की तैयारी कई महत्वपूर्ण कदम है कि हर ऊतक और कोशिका प्रकार के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता शामिल है । क्रोमेटिन प्रसंस्कृत कोशिकाओं के सेलुलर lysates या उनके नाभिक की शुद्धि के बाद से तैयार किया जा सकता है. स्तनधारी ऊतकों, कुशल lysis, formaldehyde निर्धारण, और नाभिक के शुद्धिकरण के मामले में क्रोमेटिन की इष्टतम वसूली सुनिश्चित करने के क्रम में महत्वपूर्ण हैं । इसके अलावा, कि नाभिक को ठीक करने से पहले या उनके शुद्धिकरण के बाद के चुनाव के लिए प्रयोगात्मक निर्धारित किया जाना है । इन बाधाओं के बावजूद, चिप सफलतापूर्वक ऐसे जिगर, वृषण, या मस्तिष्क4,5,6के रूप में ऊतकों से किया गया है । कंकाल की मांसपेशी के मामले में, इस तरह के एक शारीरिक रूप से प्रतिरोधी ऊतक, जो संरचनात्मक प्रोटीन की एक उच्च सामग्री प्रदर्शित की विघटन, और इसके नाभिक के अलगाव विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण है । इस विशिष्टता को देखते हुए, अंय ऊतकों के लिए अनुकूलित प्रोटोकॉल कंकाल की मांसपेशियों के लिए संतोषजनक परिणाम नहीं देते ।
यहां हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए माउस कंकाल मांसपेशी ऊतक है कि शारीरिक रूप से ऊतक, formaldehyde निर्धारण बाधित शामिल है, और फिर नाभिक और sonication के अलगाव से चिप ग्रेड क्रोमेटिन अलग । इस विधि की दक्षता इस ऊतक से चिप के लिए उपयुक्त क्रोमेटिन तैयार करने के लिए चिप-qPCR और चिप-seq विभिन्न प्रतिलेखन कारकों के लिए प्रदर्शन करके प्रदर्शन किया गया था, आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय, और आबंध citrullinated संशोधन7.
इस नई तकनीक बहुत तेजी से है एक पहले रिपोर्ट प्रोटोकॉल8 लंबे समय collagenase पाचन चरणों के दौरान जिसके दौरान, प्रतिलेखन कारकों और जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन के जीनोमिक स्थानीकरण में परिवर्तन जगह ले सकते हैं । तेजी के साथ जो नाभिक अलग और तय कर रहे है विधि यहां विशेष रूप से क्रोमेटिन तैयार है कि अधिक ईमानदारी से देशी जीनोमिक अधिभोग राज्य कब्जा आकर्षक बताया जाता है । इसके अलावा, हालांकि क्रोमेटिन अलगाव या मांसपेशी ऊतक से प्रोटीन निष्कर्षण के लिए अंय तरीकों8,9,10 वर्णित किया गया है और चिप के लिए इस्तेमाल किया चयनित जीन पर qPCR प्रयोगों, कोई चिप-seq डेटा का उपयोग कर उंहें सूचित किया गया है । विधि यहां की रिपोर्ट प्रतिलेखन कारक और citrullinated संशोधन चिप seq के लिए उपयुक्त है, और इसलिए भी 3/4c या HiC क्रोमेटिन अनुरूप कब्जा अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त होना चाहिए ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>T 25 digital ULTRA-TURRAX</td>
			<td>T 18 ULTRA-TURRAX</td>
			<td>0009022800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE SARL</td>
			<td>P7626-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail-EDTA Free</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein G Sepharose beads</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td>
			<td>P-3296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td>
			<td>P-2308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainers 70um</td>
			<td>Corning BV</td>
			<td>431751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainers 40um</td>
			<td>Corning BV</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde EM grade</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>15710-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase A</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>12091039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td>
			<td>P3803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td>
			<td>B4287-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yeast tRNA</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td>
			<td>R5636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen Blue</td>
			<td>AMIBION</td>
			<td>AM9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pol II ChIP Antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3K27ac ChIP Antibody</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>39133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tead4 ChIP Antibody</td>
			<td>Aviva Systems Biology</td>
			<td>(ARP38276_P050)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td>
			<td>I-3021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E220 Focused Ultrasonicator</td>
			<td>Covaris E220</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Additional items</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loose Dounce</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml and 50 ml falcon tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 ml round bottom tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml and 2 ml Eppendorf tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m and 40 &#956;m cell strainers (Corning)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved protocol for chromatin immunoprecipitation from mouse skeletal muscle

हम वयस्क माउस कंकाल मांसपेशी, संरचनात्मक प्रोटीन की एक उच्च सामग्री के साथ एक शारीरिक रूप से प्रतिरोधी ऊतक से क्रोमेटिन की तैयारी के लिए एक कुशल और प्रतिलिपि प्रोटोकॉल का वर्णन । वयस्क चूहों से विच्छेदित अंगों की मांसपेशियों को शारीरिक रूप से यांत्रिक homogenisation द्वारा बाधित कर रहे हैं, या नख़रेबाज़ और douncing का एक संयोजन, एक hypotonic बफर में formaldehyde निर्धारण के पहले सेल lysate. फिक्स्ड नाभिक कोशिका मलबे को दूर करने के लिए यांत्रिक homogenisation या douncing और अनुक्रमिक निस्पंदन के आगे चक्र द्वारा शुद्ध कर रहे हैं । शुद्ध नाभिक को तुरंत या बाद में अवस्था में जमने के बाद sonicated जा सकता है । क्रोमेटिन कुशलता से sonicated किया जा सकता है और क्रोमेटिन immunoprecipitation प्रयोगों के लिए उपयुक्त है, के रूप में प्रतिलेखन कारकों के लिए प्राप्त प्रोफाइल द्वारा सचित्र, आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय, और आबंध citrullinated संशोधनों । इस प्रोटोकॉल द्वारा तैयार क्रोमेटिन का उपयोग कर पाया बंधन घटनाओं मुख्य रूप से अन्य फाइबर से क्रोमेटिन की उपस्थिति के बावजूद मांसपेशी फाइबर नाभिक में जगह ले जा रहे हैं-संबंधित उपग्रह और endothelial कोशिकाओं. इस प्रोटोकॉल इसलिए वयस्क माउस कंकाल की मांसपेशी में जीन विनियमन अध्ययन के लिए अनुकूलित है ।

नाभिक को अलग करने के लिए, हम या तो 15 या ४५ एस के लिए विच्छेदित और कीमा बनाया हुआ मांसपेशी ऊतक के यांत्रिक homogenization प्रदर्शन किया, १८,००० और २२,००० rpm पर ( सामग्री की तालिकादेखें) । सभी स्थितिय?...

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Improved Protocol for Chromatin Immunoprecipitation from Mouse Skeletal Muscle

माउस कंकाल की मांसपेशी से क्रोमेटिन Immunoprecipitation के लिए बेहतर प्रोटोकॉल

वयस्क माउस कंकाल मांसपेशी से क्रोमेटिन की तैयारी के लिए एक उपंयास प्रोटोकॉल क्रोमेटिन immunoprecipitation द्वारा मांसपेशी तंतुओं में जीन विनियमन के अध्ययन के लिए अनुकूलित प्रस्तुत किया है ।

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

मानव मैट्रल वाल्व से प्रोटीन के निष्कर्षण के लिए अनुकूलित प्रोटोकॉल

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit ...

A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation

Chromatin Immunoprecipitation के लिए क्रॉस-लिंक किए गए स्केलेटल स्नायु से उच्च-गुणवत्ता वाले नाभिक तैयार करने का एक निस्पंदन-आधारित पद्धति

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful method to determine protein binding to chromatin DNA. Fiber-rich skeletal muscle, however, has been a ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

मल्टीप्लेक्स्ड सह-प्रतिरक्षा का उपयोग कर प्रोटीन इंटरेक्शन नेटवर्क गतिशीलता का परिमाणीकरण

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

बड़े पैमाने पर परमाणु इंटरैक्टूम प्रोफाइलिंग के लिए लेबल-फ्री इम्यूनोप्रिसिप्रिशन मास स्पेक्ट्रोमेट्री वर्कफ्लो

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...

Measurement of Protein Import Capacity of Skeletal Muscle Mitochondria

कंकाल की मांसपेशी माइटोकॉन्ड्रिया की प्रोटीन आयात क्षमता का मापन

Mitochondria are key metabolic and regulatory organelles that determine the energy supply as well as the overall health of the cell. In skeletal muscle, ...

Extraction and Purification of FAHD1 Protein from Swine Kidney and Mouse Liver

निष्कर्षण और सूअर गुर्दे और माउस जिगर से FAHD1 प्रोटीन की शुद्धि

Fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing protein 1 (FAHD1) is the first identified member of the FAH superfamily in eukaryotes, acting as ...

Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy

संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके कंकाल मांसपेशी तंतुओं में उपकोशिकीय ग्लाइकोजन वितरण का परिमाणीकरण

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This ...

Isolation of Mitochondrial Contact Sites

An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites

Unveiling Mitochondrial Contact Sites and Architectural Insights (Video) | JoVE

माइटोकॉन्ड्रियल संपर्क साइटों को अलग करने के लिए एक बेहतर तरीका

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the ...

MyDoBID- A Novel Technique for Identifying Muscle Fiber Types Efficiently

Fiber Type Identification of Human Skeletal Muscle

Deciphering the Mysteries of Skeletal Muscle Fiber Types Using the MyDoBID Technique (Video) | JoVE

मानव कंकाल की मांसपेशी की फाइबर प्रकार की पहचान

The technique described here can be used to identify specific myosin heavy chain (MHC) isoforms in segments of individual muscle fibers using dot ...

Locus-Specific Chromatin Isolation from Yeast Cells

Single-Copy Gene Locus Chromatin Purification in Saccharomyces cerevisiae

Advancing Chromatin Research and Overcoming Limitations with a High-Enrichment Locus-Specific Chromatin Isolation Protocol (Video) | JoVE

Saccharomyces cerevisiae में सिंगल-कॉपी जीन लोकस क्रोमैटिन शुद्धि

The basic organizational unit of eukaryotic chromatin is the nucleosome core particle (NCP), which comprises DNA wrapped ~1.7 times around a histone ...