Name: improved protocol for chromatin immunoprecipitation from mouse skeletal muscle
Uploaded: 2017-11-06T17:00:00
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Ringraziamo tutto il personale della struttura di sequenziamento di IGBMC elevato throughput, un membro del Consorzio "Francia Génomique" (ANR10-INBS-09-08) e tutti i servizi generali di IGBMC in particolare il personale della struttura animale IGBMC. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal CNRS, INSERM, l'AFM, la Ligue Nationale contre le Cancer, i francesi dichiarano fondo attraverso l'ANR nell'ambito del programma d'Avenir Investissements etichettati ANR-10-IDEX-0002-02, Labex INRT ANR-10-IDEX-0001-02 e il ANR-AR2GR-16-CE11-009-01. I finanziatori non avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, raccolta dati e analisi, decisione di pubblicare o preparazione del manoscritto. Santiago è stata sostenuta dal Ligue Nationale contre le Cancer, ANR-AR2GR-16-CE11-009-01 e V.U dal Ministère de l'enseignement et de la Recherche. ID è un 'équipe labellisée' della Ligue Nationale contre le Cancer.

topi sono stati mantenuti in conformità con le linee guida istituzionali per quanto riguarda la cura e l'uso degli animali da laboratorio e conformemente alle linee guida nazionali di cura degli animali (Commissione europea direttiva 86/609/CEE; Decreto francese n. 87-848). Tutte le procedure sono state approvate dal comitato etico nazionale francese.
 1. isolamento del tessuto muscolare <ol><li>sacrificio un adulto 6 a 8-settimana-vecchio mouse da dislocazione cervicale. Sterlise l'arto s...

<ol>
	<li>Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions.">Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions.</a> Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).</li><li>Furey, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+and+beyond:+new+and+improved+methodologies+to+detect+and+characterize+protein-DNA+interactions.">ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions.</a> Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).</li><li>Wade, J. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAK1+and+CtBP1+Regulate+the+Coupling+of+Neuronal+Activity+to+Muscle+Chromatin+and+Gene+Expression.">PAK1 and CtBP1 Regulate the Coupling of Neuronal Activity to Muscle Chromatin and Gene Expression.</a> Mol Cell Biol. 35 (24), 4110-4120 (2015).</li><li>Kuo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+glucocorticoid+receptor-binding+sites+in+myotubes+identifies+gene+networks+modulating+insulin+signaling.">Genome-wide analysis of glucocorticoid receptor-binding sites in myotubes identifies gene networks modulating insulin signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (28), 11160-11165 (2012).</li><li>Whyte, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Master+transcription+factors+and+mediator+establish+super-enhancers+at+key+cell+identity+genes.">Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes.</a> Cell. 153 (2), 307-319 (2013).</li><li>Benhaddou, A., Keime, C., Ye, T., Morlon, A., Michel, I., Jost, B., Mengus, G., Davidson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+TEAD4+regulates+expression+of+myogenin+and+the+unfolded+protein+response+genes+during+C2C12+cell+differentiation.">Transcription factor TEAD4 regulates expression of myogenin and the unfolded protein response genes during C2C12 cell differentiation.</a> Cell Death and Differentiation. 19 (2), 220-231 (2011).</li><li>Cowling, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+dynamin+2+expression+rescues+X-linked+centronuclear+myopathy.">Reducing dynamin 2 expression rescues X-linked centronuclear myopathy.</a> J Clin Invest. 124 (3), 1350-1363 (2014).</li><li>. ChIP Analysis Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/epigenetics-noncoding-rna-research/chromatin-remodeling/chromatin-immunoprecipitation-chip/chip-analysis.html">https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/epigenetics-noncoding-rna-research/chromatin-remodeling/chromatin-immunoprecipitation-chip/chip-analysis.html</a> (2017)</li></ol>

Qui descriviamo un romanzo protocollo per la preparazione della cromatina da muscoli scheletrici topo adulto e dimostrano che la cromatina è adatta per gli esperimenti di ChIP che rilevano associazione di fattore di trascrizione e modificazioni istoniche covalente nei nuclei della fibra di muscolo. Questo protocollo prevede diversi passaggi critici. Il primo è la rottura del tessuto che possa essere eseguita mediante lisata o tosatura meccanica. Cesoia meccanica è più veloce e più riproducibile e pertanto è il meto...

Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) accoppiato alla reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR) e sequenziamento ad alta (ChIP-seq) sono diventati i metodi di scelta per lo studio di trascrizione e regolazione epigenetica dell'espressione genica in vari tessuti e tipi di cellule1. Questa tecnica permette di genoma profilatura di modificazioni covalenti della cromatina, occupazione variante dell'istone e fattore di trascrizione associazione2,3.
Mentre l'esecuzione di ChIP da cellule coltivate è ben consolidata, ChIP da tessuti di mammiferi rimane più impegnativo. Preparazione della cromatina per ChIP prevede diversi passaggi critici che devono essere ottimizzate per ogni tipo di tessuti e cellule. Cromatina può essere preparata da lisati cellulari delle cellule coltivate o seguente purificazione dei loro nuclei. Nel caso di tessuti di mammiferi, efficiente Lisi, fissazione di formaldeide e purificazione dei nuclei sono fondamentali al fine di garantire un recupero ottimale della cromatina. Inoltre, la scelta se risolvere i nuclei prima o dopo la loro purificazione deve essere determinato sperimentalmente. Nonostante questi ostacoli, il ChIP è stato eseguito con successo da tessuti quali fegato, testicolo o cervello4,5,6. Nel caso del muscolo scheletrico, la rottura di un tessuto resistente fisicamente, che esibisce un alto contenuto di proteine strutturali e l'isolamento dei suoi nuclei è particolarmente impegnativa. Data questa specificità, protocolli ottimizzati per altri tessuti non danno risultati soddisfacenti per i muscoli scheletrici.
Qui descriviamo un protocollo per isolare la cromatina ChIP-grado da tessuto muscolare scheletrico del mouse che coinvolge fisicamente interrompendo il tessuto, fissazione di formaldeide e quindi l'isolamento dei nuclei e sonicazione. L'efficienza di questo metodo per preparare cromatina adatta per ChIP da questo tessuto è stato dimostrato eseguendo ChIP-qPCR e ChIP-seq per vari fattori di trascrizione, RNA polimerasi II e istone covalente modifiche7.
Questa nuova tecnica è molto più veloce di un protocollo precedentemente segnalati8 composto da lunghi passaggi di digestione della collagenosi durante i quali, cambiamenti nella localizzazione genomica dei fattori di trascrizione e le alterazioni nell'espressione genica possono aver luogo. La rapidità con cui i nuclei sono isolati e fissa rende particolarmente attraente per preparare della cromatina che cattura più fedelmente lo stato nativo occupazione genomico il metodo qui descritto. Inoltre, anche se hanno altri metodi per l'estrazione di isolamento o proteine della cromatina da tessuto muscolare sono stato descritto8,9,10 e utilizzato per esperimenti di ChIP-qPCR su geni selezionati, nessun ChIP-seq dati sono stati segnalati li utilizzano. Il metodo segnalato qui è adatto per la modifica di fattore e istone trascrizione ChIP-seq e quindi dovrebbe anche essere adatto per 3 / 4C o applicazioni di acquisizione di HiC cromatina conformazione.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>T 25 digital ULTRA-TURRAX</td>
			<td>T 18 ULTRA-TURRAX</td>
			<td>0009022800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE SARL</td>
			<td>P7626-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail-EDTA Free</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein G Sepharose beads</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td>
			<td>P-3296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td>
			<td>P-2308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainers 70um</td>
			<td>Corning BV</td>
			<td>431751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainers 40um</td>
			<td>Corning BV</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde EM grade</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>15710-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase A</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>12091039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td>
			<td>P3803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td>
			<td>B4287-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yeast tRNA</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td>
			<td>R5636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen Blue</td>
			<td>AMIBION</td>
			<td>AM9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pol II ChIP Antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3K27ac ChIP Antibody</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>39133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tead4 ChIP Antibody</td>
			<td>Aviva Systems Biology</td>
			<td>(ARP38276_P050)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td>
			<td>I-3021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E220 Focused Ultrasonicator</td>
			<td>Covaris E220</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Additional items</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loose Dounce</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml and 50 ml falcon tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 ml round bottom tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml and 2 ml Eppendorf tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m and 40 &#956;m cell strainers (Corning)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved protocol for chromatin immunoprecipitation from mouse skeletal muscle

Descriviamo un protocollo efficiente e riproducibile per la preparazione della cromatina dal muscolo scheletrico di topo adulto, un tessuto fisicamente resistente con un alto contenuto di proteine strutturali. Muscoli degli arti sezionati da topi adulti fisicamente sono interrotte da omogeneizzazione meccanica, o una combinazione di macinazione e douncing, in un buffer ipotonico prima della fissazione della formaldeide del lysate delle cellule. I nuclei fissi sono purificati da ulteriori cicli di omogeneizzazione meccanica o douncing e filtrazioni sequenziale per rimuovere i detriti cellulari. I nuclei purificati possono essere sonicati immediatamente o in una fase successiva dopo il congelamento. La cromatina può essere sonicata in modo efficiente ed è adatto per esperimenti di immunoprecipitazione della cromatina, come illustrato dai profili ottenuto per fattori di trascrizione, la RNA polimerasi II e modificazioni istoniche covalente. L'associazione di eventi rilevati utilizzando la cromatina preparata dal presente protocollo è principalmente quelli che si svolgono nei nuclei della fibra di muscolo nonostante la presenza di cromatina da altro satellite fibra-collegato e cellule endoteliali. Questo protocollo è pertanto adattato per studiare la regolazione genica in muscolo scheletrico del topo adulto.

Per isolare i nuclei, abbiamo effettuato omogeneizzazione meccanica del tessuto del muscolo dissecato e macinate per s o 15 o 45, a 18.000 e 22.000 giri/min (Vedi Tabella materiali). In tutte le condizioni, i nuclei hanno potevano essere separati dai detriti dei tessuti, ma la resa è stata ottima usando la velocità più bassa (Figura 1A-B). I nuclei potrebbero anche essere preparati da douncing per 3-5 min (<strong class="x...

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Improved Protocol for Chromatin Immunoprecipitation from Mouse Skeletal Muscle

Miglioramento protocollo per immunoprecipitazione della cromatina dal Mouse del muscolo scheletrico

Viene presentato un nuovo protocollo per la preparazione della cromatina dal muscolo scheletrico del topo adulto adattato allo studio della regolazione genica nelle fibre muscolari di immunoprecipitazione della cromatina.

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

Protocollo ottimizzato per l&#39;estrazione delle proteine ​​dalla valvola mitrale umana

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit ...

Ricerca

Biochimica

A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation

Un metodo basato sulla filtrazione per preparare nuclei di alta qualità dal muscolo scheletrico incrociato per l&#39;immunoprecipitazione cromatina

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful method to determine protein binding to chromatin DNA. Fiber-rich skeletal muscle, however, has been a ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Quantificazione delle dinamiche della rete di interazione proteica mediante co-immunoprecipitazioni multiplexate

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Flusso di lavoro per spettrometria di massa per l'immunoprecipitazioni nucleari senza etichetta per la profilazione del contraglio nucleare su larga scala

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...

Measurement of Protein Import Capacity of Skeletal Muscle Mitochondria

Misurazione della capacità di importazione di proteine dei mitocondri del muscolo scheletrico

Mitochondria are key metabolic and regulatory organelles that determine the energy supply as well as the overall health of the cell. In skeletal muscle, ...

Extraction and Purification of FAHD1 Protein from Swine Kidney and Mouse Liver

Estrazione e purificazione della proteina FAHD1 dal rene suino e dal fegato di topo

Fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing protein 1 (FAHD1) is the first identified member of the FAH superfamily in eukaryotes, acting as ...

Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy

Quantificazione della distribuzione subcellulare del glicogeno nelle fibre muscolari scheletriche mediante microscopia elettronica a trasmissione

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This ...

Isolation of Mitochondrial Contact Sites

An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites

Unveiling Mitochondrial Contact Sites and Architectural Insights (Video) | JoVE

Un metodo migliorato per isolare i siti di contatto mitocondriali

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MyDoBID- A Novel Technique for Identifying Muscle Fiber Types Efficiently

Fiber Type Identification of Human Skeletal Muscle

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Identificazione del tipo di fibra del muscolo scheletrico umano

The technique described here can be used to identify specific myosin heavy chain (MHC) isoforms in segments of individual muscle fibers using dot ...

Locus-Specific Chromatin Isolation from Yeast Cells

Single-Copy Gene Locus Chromatin Purification in Saccharomyces cerevisiae

Advancing Chromatin Research and Overcoming Limitations with a High-Enrichment Locus-Specific Chromatin Isolation Protocol (Video) | JoVE

Purificazione della cromatina del locus genico a copia singola in Saccharomyces cerevisiae

The basic organizational unit of eukaryotic chromatin is the nucleosome core particle (NCP), which comprises DNA wrapped ~1.7 times around a histone ...