Name: improved protocol for chromatin immunoprecipitation from mouse skeletal muscle
Uploaded: 2017-11-06T17:00:00
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우리 감사 합니다 IGBMC 높은 처리량 시퀀싱 시설, "프랑스 Génomique" 컨소시엄 (ANR10-INBS-09-08)의 회원 및 모든 IGBMC 일반 서비스의 모든 직원 들은 특히 IGBMC 동물 시설 직원을. 이 작품은 CNRS는 INSERM, AFM, 국가 리그 죄수 르 암에서 교부 금에 의해 지원 되었다, 프랑스 프로그램 ANR-10-IDEX-0002-02, Labex INRT ANR-10-IDEX-0001-02 표시 하는 Investissements d'Avenir에서 ANR 통해 펀드와 ANR-AR2GR-16-CE11-009-01. Funders 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 결정 게시 또는 원고의 준비에 전혀 역할을 했다. S.J 지원 했다 국가 리그 죄수 르 암과 ANR-AR2GR-16-CE11-009-01, V.U Ministère de l'Enseignement에 의해 동부 표준시 드 라 Recherche. ID는 'équipe labellisée' 국가 리그 죄수 르 암입니다.

관리 및 실험 동물의 사용에 관한 기관 지침에 따라 그리고 국가 동물 관리 지침 (유럽 위원회 지시 86/609/CEE;에 따라 마우스 유지 했다 프랑스어 법령 no.87-848). 모든 절차는 프랑스 국가 윤리 위원회에 의해 승인 했다.
 1. 절연의 근육 조직 경부 전위에 의해 <ol><li>희생 한 성인 6 8 주 오래 된 마우스. Sterlise 70% 에탄올과 그것을 rinsing 하 여 사지 및 좋은 포인트가 위와 집게를 ?...

<ol>
	<li>Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions.">Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions.</a> Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).</li><li>Furey, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+and+beyond:+new+and+improved+methodologies+to+detect+and+characterize+protein-DNA+interactions.">ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions.</a> Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).</li><li>Wade, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+Transcription+Regulatory+Networks+with+ChIP-seq+and+RNA-seq.">Mapping Transcription Regulatory Networks with ChIP-seq and RNA-seq.</a> Adv Exp Med Biol. 883, 119-134 (2015).</li><li>Alpern, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAF4,+a+subunit+of+transcription+factor+II+D,+directs+promoter+occupancy+of+nuclear+receptor+HNF4A+during+post-natal+hepatocyte+differentiation.">TAF4, a subunit of transcription factor II D, directs promoter occupancy of nuclear receptor HNF4A during post-natal hepatocyte differentiation.</a> Elife. 3, e03613 (2014).</li><li>Martianov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+occupancy+of+an+extended+repertoire+of+CREM+and+CREB+binding+loci+in+male+germ+cells.">Cell-specific occupancy of an extended repertoire of CREM and CREB binding loci in male germ cells.</a> BMC Genomics. 11, 530 (2010).</li><li>Achour, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+identity+genes+regulated+by+super-enhancers+are+preferentially+down-regulated+in+the+striatum+of+Huntington's+disease+mice.">Neuronal identity genes regulated by super-enhancers are preferentially down-regulated in the striatum of Huntington's disease mice.</a> Hum Mol Genet. 24 (12), 3481-3496 (2015).</li><li>Joshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TEAD+transcription+factors+are+required+for+normal+primary+myoblast+differentiation+in+vitro+and+muscle+regeneration+in+vivo.">TEAD transcription factors are required for normal primary myoblast differentiation in vitro and muscle regeneration in vivo.</a> PLoS Genet. 13 (2), e1006600 (2017).</li><li>Ohkawa, Y., Mallappa, C., Dacwag-Vallaster, C. S., Imbalzano, A. N., DiMario, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Myogenesis: Methods and protocols. 798, 517-531 (2012).</li><li>Dimauro, I., Pearson, T., Caporossi, D., Jackson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+protocol+for+the+subcellular+fractionation+of+skeletal+muscle+cells+and+tissue.">A simple protocol for the subcellular fractionation of skeletal muscle cells and tissue.</a> BMC Res Notes. 5, 513 (2012).</li><li>Thomas, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAK1+and+CtBP1+Regulate+the+Coupling+of+Neuronal+Activity+to+Muscle+Chromatin+and+Gene+Expression.">PAK1 and CtBP1 Regulate the Coupling of Neuronal Activity to Muscle Chromatin and Gene Expression.</a> Mol Cell Biol. 35 (24), 4110-4120 (2015).</li><li>Kuo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+glucocorticoid+receptor-binding+sites+in+myotubes+identifies+gene+networks+modulating+insulin+signaling.">Genome-wide analysis of glucocorticoid receptor-binding sites in myotubes identifies gene networks modulating insulin signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (28), 11160-11165 (2012).</li><li>Whyte, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Master+transcription+factors+and+mediator+establish+super-enhancers+at+key+cell+identity+genes.">Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes.</a> Cell. 153 (2), 307-319 (2013).</li><li>Benhaddou, A., Keime, C., Ye, T., Morlon, A., Michel, I., Jost, B., Mengus, G., Davidson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+TEAD4+regulates+expression+of+myogenin+and+the+unfolded+protein+response+genes+during+C2C12+cell+differentiation.">Transcription factor TEAD4 regulates expression of myogenin and the unfolded protein response genes during C2C12 cell differentiation.</a> Cell Death and Differentiation. 19 (2), 220-231 (2011).</li><li>Cowling, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+dynamin+2+expression+rescues+X-linked+centronuclear+myopathy.">Reducing dynamin 2 expression rescues X-linked centronuclear myopathy.</a> J Clin Invest. 124 (3), 1350-1363 (2014).</li><li>. ChIP Analysis Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/epigenetics-noncoding-rna-research/chromatin-remodeling/chromatin-immunoprecipitation-chip/chip-analysis.html">https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/epigenetics-noncoding-rna-research/chromatin-remodeling/chromatin-immunoprecipitation-chip/chip-analysis.html</a> (2017)</li></ol>

여기는 성인 마우스 골격 근육이 염색이 질은 근육 섬유 핵 녹음 방송 요인 바인딩 및 화학식 히스톤 수정을 감지 칩 실험에 적합 표시에서 chromatin를 준비 하기 위한 새로운 프로토콜에 설명 합니다. 이 프로토콜에는 몇 가지 중요 한 단계가 포함 됩니다. 첫 번째는 조직 장애 dounce 또는 기계적인 전단에 의해 수행 될 수 있는. 기계적 전단 빠르고 더 재현 이며 따라서 방법의 선택. 그럼에도 불구 ?...

Chromatin immunoprecipitation (칩) 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량)에 결합 하 고 높은 처리량 시퀀싱 (칩 seq) 전사를 공부 하는 선택의 방법 및 다양 한 조직에서 유전자 발현의 후 성적인 규정 되 그리고 세포 유형1. 이 기술은 화학식 chromatin 수정, 히스톤 변형 인, 및 녹음 방송 요인 바인딩2,3의 프로 파일링 게놈 넓은 수 있습니다.
배양된 세포에서 칩을 수행 하는 것이 잘 설립 동안 포유류 조직에서 칩 더 도전 남아 있다. Chromatin 칩에 대 한 준비 하 고 모든 조직 및 세포 유형에 대 한 최적화 하는 데 필요한 몇 가지 중요 한 단계를 포함 한다. Chromatin는 경작된 한 세포의 세포 lysates 또는 그들의 핵의 다음 정화에서 준비 될 수 있습니다. 포유류 직물의 경우 효율적인 세포, 포름알데히드 고정, 그리고 핵의 정화는 chromatin의 복구를 보장 하기 위해 중요 하다. 또한, 그들의 정화 전후 핵 해결을 선택 실험적으로 결정 될 수 있다. 이러한 장애물에도 불구 하 고 칩은 간, 고환, 또는 뇌4,,56같은 조직에서 성공적으로 수행 되었습니다. 골격 근육의 경우 같은 물리적으로 저항 조직, 구조 단백질의 높은 콘텐츠 및 그것의 핵의 절연 전시 중단은 특히 도전적 이다. 이 특이성을 감안할 때, 다른 조직에 대 한 최적화 된 프로토콜 주지 않는다 만족 스러운 결과 골격 근육에 대 한.
여기는 칩-학년 chromatin 물리적 조직, 포름알데히드 고정, 그리고 핵 및 쥡니다의 방해를 포함 하는 마우스 골격 근육 조직에서 분리 하는 프로토콜에 설명 합니다. 염색 질이이 조직에서 적합 한 칩에 대 한 준비를이 방법의 효율성은 다양 한 전사 인자와 RNA 중 합 효소 II, 화학식 히스톤 수정7칩 정량 및 칩 seq를 수행 하 여 시연 했다.
이 새로운 기술은 이전에 보고 된 프로토콜8 시간, 녹음 방송 요인의 게놈 현지화에 변화 하는 동안 오래 콜라 소화 단계를 구성 보다 훨씬 빠른 고 유전자 발현에 변경 자리를 차지할 수 있습니다. 핵은 분리 하 고 고정 속도 여기에 설명 된 메서드를 특히 매력적인 chromatin 네이티브 게놈 인 상태를 더 충실 하 게 준비 하 게 만듭니다. 또한, 비록 근육 조직에서 chromatin 격리 또는 단백질 추출에 대 한 다른 방법 설명된8,,910 되었고 선택 된 유전자, 아니 칩 seq에 칩 정량 실험을 위해 사용 그들을 사용 하 여 데이터 보고 되었습니다. 여기 보고 메서드는 전사 인자와 히스톤 수정 칩 seq에 적합 하 고 따라서 또한 적합 해야한다 3/4 C 또는 HiC chromatin 구조 캡처 응용 프로그램.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>T 25 digital ULTRA-TURRAX</td>
			<td>T 18 ULTRA-TURRAX</td>
			<td>0009022800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE SARL</td>
			<td>P7626-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail-EDTA Free</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein G Sepharose beads</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td>
			<td>P-3296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td>
			<td>P-2308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainers 70um</td>
			<td>Corning BV</td>
			<td>431751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainers 40um</td>
			<td>Corning BV</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde EM grade</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>15710-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase A</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>12091039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td>
			<td>P3803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td>
			<td>B4287-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yeast tRNA</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td>
			<td>R5636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen Blue</td>
			<td>AMIBION</td>
			<td>AM9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pol II ChIP Antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3K27ac ChIP Antibody</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>39133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tead4 ChIP Antibody</td>
			<td>Aviva Systems Biology</td>
			<td>(ARP38276_P050)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td>
			<td>I-3021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E220 Focused Ultrasonicator</td>
			<td>Covaris E220</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Additional items</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loose Dounce</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml and 50 ml falcon tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 ml round bottom tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml and 2 ml Eppendorf tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m and 40 &#956;m cell strainers (Corning)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved protocol for chromatin immunoprecipitation from mouse skeletal muscle

우리는 성인 마우스 골격 근육, 구조 단백질의 높은 내용 가진 물리적으로 저항 조직에서에서 chromatin의 준비에 대 한 효율적이 고 재현 가능한 프로토콜을 설명합니다. 성인 쥐에서 해 부 다리 근육은 육체적으로 기계 이동할 또는 닦지 세포 lysate의 포름알데히드 고정 하기 전에 당뇨 버퍼에 douncing의 조합에 의해 중단 됩니다. 고정된 핵 더 사이클 기계 이동할 또는 douncing 및 순차 filtrations 세포 파편을 제거 하 여 정화 됩니다. 순화 핵 동결 후 즉시 또는 나중에 무대에서 sonicated 수 수 있습니다. chromatin를 효율적으로 sonicated 수 있습니다 그리고는 프로필에서 볼 수 있듯이 chromatin immunoprecipitation 실험에 적합 전사 인자와 RNA 중 합 효소 II, 화학식 히스톤 수정에 대 한. 이 프로토콜에 의해 준비 하는 chromatin를 사용 하 여 검출 바인딩 이벤트는 주로 다른 섬유 관련 위성 및 내 피 세포에서 chromatin의 존재에도 불구 하 고 근육 섬유 핵에서 그. 이 프로토콜은 따라서 성인 쥐 골격 근육에 있는 유전자 규칙을 공부에 적응.

핵을, 우리는 15 또는 45 s, 18000 및 22, 000 rpm ( 재료의 표참조)에 대 한 해 부와 다진 근육 조직의 기계적 균질 수행. 모든 조건에서 핵에서 조직, 분리 될 수 있었다 하지만 수익률은 낮은 속도 (그림 1A-B)를 사용 하 여 최적의. Douncing 3-5 분 (그림 1A및 데이터 표시 되지 않음), 핵 수 또한 준비 하지만 기계적 ...

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Improved Protocol for Chromatin Immunoprecipitation from Mouse Skeletal Muscle

마우스 골격 근육에서 Chromatin Immunoprecipitation에 대 한 향상 된 프로토콜

염색 질 chromatin immunoprecipitation 근육 섬유에 있는 유전자 규칙의 학문에 적응 하는 성인 마우스 골격 근육에서의 준비에 대 한 새로운 프로토콜 제공 됩니다.

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

인간 승모판에서 단백질 추출을위한 최적화 된 프로토콜

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit ...

연구

생화학

A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation

Chromatin Immunoprecipitation을위한 Cross-linked Skeletal Musculus로부터 고품질 핵을 준비하기위한 Filtration 기반 방법

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful method to determine protein binding to chromatin DNA. Fiber-rich skeletal muscle, however, has been a ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

멀티플렉스 동시 면역 침전을 이용한 단백질 상호 작용 네트워크 역학의 정량화

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

대규모 핵 상호 작용 프로파일링을 위한 라벨 없는 면역 침전 질량 분광 워크플로우

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...

Measurement of Protein Import Capacity of Skeletal Muscle Mitochondria

골격 근육 미토콘드리아의 단백질 수입 능력 측정

Mitochondria are key metabolic and regulatory organelles that determine the energy supply as well as the overall health of the cell. In skeletal muscle, ...

Extraction and Purification of FAHD1 Protein from Swine Kidney and Mouse Liver

돼지 신장과 마우스 간에서 FAHD1 단백질의 추출 및 정제

Fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing protein 1 (FAHD1) is the first identified member of the FAH superfamily in eukaryotes, acting as ...

Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy

투과 전자 현미경을 이용한 골격근섬유의 세포하 글리코겐 분포의 정량화

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This ...

Isolation of Mitochondrial Contact Sites

An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites

Unveiling Mitochondrial Contact Sites and Architectural Insights (Video) | JoVE

미토콘드리아 접촉 부위를 분리하는 개선된 방법

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the ...

MyDoBID- A Novel Technique for Identifying Muscle Fiber Types Efficiently

Fiber Type Identification of Human Skeletal Muscle

Deciphering the Mysteries of Skeletal Muscle Fiber Types Using the MyDoBID Technique (Video) | JoVE

인체 골격근의 섬유 유형 식별

The technique described here can be used to identify specific myosin heavy chain (MHC) isoforms in segments of individual muscle fibers using dot ...

Locus-Specific Chromatin Isolation from Yeast Cells

Single-Copy Gene Locus Chromatin Purification in Saccharomyces cerevisiae

Advancing Chromatin Research and Overcoming Limitations with a High-Enrichment Locus-Specific Chromatin Isolation Protocol (Video) | JoVE

Single-Copy Gene Locus Chromatin Purification in Saccharomyces cerevisiae (맥주효모균의 단일 복제 유전자 자리, 염색질 정제)

The basic organizational unit of eukaryotic chromatin is the nucleosome core particle (NCP), which comprises DNA wrapped ~1.7 times around a histone ...