Name: isolation of intact, whole mouse mammary glands for analysis of extracellular matrix expression and gland morphology
Uploaded: 2017-10-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology at JoVE.com

Les auteurs aimerait remercier avril Wiles et Dr Roger Broderson d’assistance avec la nécropsie animale et l’isolement de la glande, respectivement. Financement pour ces travaux a été appuyée par les centres de Philadelphia College of Osteopathic Medicine pour troubles chroniques du vieillissement.

procédures sur des sujets animaux au présent protocole ont été examinés et approuvés par le Comité de l’urbanisme de la faculté de médecine ostéopathique de Philadelphie et d’institutionnels animalier et toutes les techniques se sont déroulées sous stricte lignes directrices éthiques.
 1. échantillon approvisionnement et traitement <ol><li>Sélectionner la matière animale et la place dans une chambre de CO 2. Pour cette expérience, utiliser 8-10 semaine vieill...

<ol>
	<li>Gao-Feng Xiong, R. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+of+cancer+cell-derived+extracellular+matrix+in+tumor+progression.">Function of cancer cell-derived extracellular matrix in tumor progression.</a> J Cancer Metastasis Treat. 2, 357-364 (2016).</li><li>Place, A. E., Jin Huh, S., Polyak, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microenvironment+in+breast+cancer+progression:+biology+and+implications+for+treatment.">The microenvironment in breast cancer progression: biology and implications for treatment.</a> Breast Cancer Res. 13 (6), 227 (2011).</li><li>Provenzano, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+reorganization+at+the+tumor-stromal+interface+facilitates+local+invasion.">Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion.</a> BMC Med. 4 (1), 38 (2006).</li><li>Provenzano, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+density+promotes+mammary+tumor+initiation+and+progression.">Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression.</a> BMC Med. 6, 11 (2008).</li><li>Cox, T. R., Erler, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+and+homeostasis+of+the+extracellular+matrix:+implications+for+fibrotic+diseases+and+cancer.">Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer.</a> Dis Model Mech. 4 (2), 165-178 (2011).</li><li>Ioachim, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+expression+of+extracellular+matrix+components+tenascin,+fibronectin,+collagen+type+IV+and+laminin+in+breast+cancer:+their+prognostic+value+and+role+in+tumour+invasion+and+progression.">Immunohistochemical expression of extracellular matrix components tenascin, fibronectin, collagen type IV and laminin in breast cancer: their prognostic value and role in tumour invasion and progression.</a> Eur J Cancer. 38 (18), 2362-2370 (2002).</li><li>Barkan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastatic+growth+from+dormant+cells+induced+by+a+col-I-enriched+fibrotic+environment.">Metastatic growth from dormant cells induced by a col-I-enriched fibrotic environment.</a> Cancer Res. 70 (14), 5706-5716 (2010).</li><li>Levental, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+crosslinking+forces+tumor+progression+by+enhancing+integrin+signaling.">Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling.</a> Cell. 139 (5), 891-906 (2009).</li><li>Wang, J. P., Hielscher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin:+How+Its+Aberrant+Expression+in+Tumors+May+Improve+Therapeutic+Targeting.">Fibronectin: How Its Aberrant Expression in Tumors May Improve Therapeutic Targeting.</a> J Cancer. 8 (4), 674-682 (2017).</li><li>Qian, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+significance+of+tumor/stromal+caveolin-1+expression+in+breast+cancer+patients.">Prognostic significance of tumor/stromal caveolin-1 expression in breast cancer patients.</a> Cancer Sci. 102 (8), 1590-1596 (2011).</li><li>Simpkins, S. A., Hanby, A. M., Holliday, D. L., Speirs, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+functional+significance+of+loss+of+caveolin-1+expression+in+breast+cancer-associated+fibroblasts.">Clinical and functional significance of loss of caveolin-1 expression in breast cancer-associated fibroblasts.</a> J Pathol. 227 (4), 490-498 (2012).</li><li>Witkiewicz, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+absence+of+stromal+caveolin-1+expression+predicts+early+tumor+recurrence+and+poor+clinical+outcome+in+human+breast+cancers.">An absence of stromal caveolin-1 expression predicts early tumor recurrence and poor clinical outcome in human breast cancers.</a> Am J Pathol. 174 (6), 2023-2034 (2009).</li><li>Macias, H., Hinck, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+gland+development.">Mammary gland development.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (4), 533-557 (2012).</li><li>Caligioni, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+reproductive+status/stages+in+mice.">Assessing reproductive status/stages in mice.</a> Curr Protoc Neurosci. , (2009).</li><li>Cannata, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+circulating+IGF-I+promotes+mammary+gland+development+and+proliferation.">Elevated circulating IGF-I promotes mammary gland development and proliferation.</a> Endocrinology. 151 (12), 5751-5761 (2010).</li><li>Thompson, C., Rahim, S., Arnold, J., Hielscher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+caveolin-1+alters+extracellular+matrix+protein+expression+and+ductal+architecture+in+murine+mammary+glands.">Loss of caveolin-1 alters extracellular matrix protein expression and ductal architecture in murine mammary glands.</a> PLoS One. 12 (2), 0172067 (2017).</li><li>Williams, C. M., Engler, A. J., Slone, R. D., Galante, L. L., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+expression+modulates+mammary+epithelial+cell+proliferation+during+acinar+differentiation.">Fibronectin expression modulates mammary epithelial cell proliferation during acinar differentiation.</a> Cancer Res. 68 (9), 3185-3192 (2008).</li><li>Krause, S., Brock, A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraductal+injection+for+localized+drug+delivery+to+the+mouse+mammary+gland.">Intraductal injection for localized drug delivery to the mouse mammary gland.</a> J Vis Exp. (80), (2013).</li></ol>

Dans le livre, nous avons décrit une technique pour isoler les glandes mammaires souris intactes pour les analyses histologiques en aval d’expression de l’ECM et morphologie canalaire. En ce qui concerne les analyses de morphologie canalaire, cette méthodologie permet l’enquête rapide d’architecture canalaire basé sur des coupes histologiques colorées. Autres méthodes d’analyse canalaire s’appuient sur des injections de colorants pour permettre la visualisation de l’arborescence canalaire, méthodes q...

Le cancer du sein se caractérise par un degré important de tissu fibrose1,2,3,4. Dénommé l’ECM, cette entité non cellulaire se trouve à des degrés divers dans tous les tissus et se compose principalement d’un réseau complex de collagènes fibrillaires et non fibrillaire, élastine et de glycoprotéines en plus de diverses molécules de signalisation qui sont séquestré dans cette matrice. Dans des conditions homéostatiques, la déposition et la dégradation de l’ECM est étroitement contrôlée. 5 au cours de la tumorigenèse mammaire, le solde du dépôt de l’ECM et la dégradation est perturbé. Ainsi, les tumeurs du sein ont été signalés pour exprimer les protéines ECM abondantes telles que les collagènes, fibronectine et ténascine C entre autres. 6 l’expression anormale de ces protéines en plus de patrons une augmentation de la réticulation à matrice a été documentée pour promouvoir du sein tumeur progression, métastases et thérapie résistance1,3, 4,7,8,9.
Pour évaluer la composition de l’ECM et morphologie canalaire, isolement d’intact glande mammaire a été effectuée. Ici, nous avons utilisé des souris femelles nullipares déficients pour cavéoline-1, une protéine intégrale de membrane qui est reliée à un agressif du sein tumeur signature10,11,12et contrôler les femmes nullipares B6 souris. Traitement et la souillure de ces tissus histologiques permis d’identifier plusieurs protéines ECM ainsi que la caractérisation de la morphologie canalaire.
Dans l’ensemble, l’isolement des glandes mammaires intacts, tout donne aux chercheurs la possibilité d’étudier les tissus à l’échelle des changements morphologiques ou cellulaires survenant en réponse à des facteurs exogènes ou endogènes. Inconvénients de la technique sont associés aux analyses de 2 sections de tissu de dimensions (2D) par opposition à une perspective 3D, ce qui donnerait une image plus complète de la morphologie complexe de l’arbre canalaire. Compte tenu de la complexité des interactions cellule-cellule et cellule-ECM qui se déroulent dans la glande mammaire, l’isolement des glandes entières et intactes est avantageuse pour analyser efficacement une expression morphologie et protéine canalaire dans diverses régions de la murine mammaire glande.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX43</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>DP73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis Software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>cellSens Entry software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>NIH</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5x-R Surgical Micro Loupes</td>
			<td>Rose Micro Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Magnification at researcher&#39;s preference</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo Scissors</td>
			<td>Medline</td>
			<td>DYND04035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining Rack</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining Dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin Jars</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>Size appropriate for tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IHC EnVision+ Kit (HRP, Mouse, DAB+)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>K400611-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picrosirius Red Kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB150681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y, alcoholic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT110132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Hematoxylin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HHS16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Serum</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>S30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes, Reagent Grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 proof</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>792780</td>
			<td>suitable for molecular biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline, 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S279-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>202932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent Mounting Medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S1964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eukitt&#39;s Mounting Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB23750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tenascin-C antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB108930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha Smooth Muscle Actin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB124964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dako Envision Dual Link System HRP</td>
			<td>Dako</td>
			<td>K4065</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of intact, whole mouse mammary glands for analysis of extracellular matrix expression and gland morphology

Cette procédure visait à récolter les #4 abdominale des glandes mammaires des femelles nullipares afin d’évaluer l’expression de l’ECM et architecture canalaire. Ici, une petite poche sous la peau a été créée à l’aide de ciseaux de Mayo, permettant une séparation des glandes dans le tissu sous-cutané de la péritoine sous-jacent. Visualisation des glandes ont été facilitée par l’utilisation de 3.5 loupes micro chirurgical x-R. La dépouille a été inversée et épinglé de retour permettant d’identifier les coussinets adipeux mammaires intacts. Chacune des glandes abdominales #4 a été carrément disséqué en faisant glisser la lame de bistouri Swann-Morton latéralement entre les glandes et la couche sous-cutanée. Immédiatement après la récolte, les glandes ont été placés dans 10 % de formol tamponné neutre pour le traitement des tissus ultérieures. L’excision de la glande entière est avantageuse car elle élimine principalement le risque d’exclure les tissus à l’échelle des interactions importantes entre les cellules épithéliales canalaires et autres populations cellulaires micro-environnementales qui pourraient manquer dans une biopsie partielle. Un inconvénient de la méthode est l’utilisation de coupes sériées de tissus fixés qui limite les analyses d’expression canalaire de la morphogénèse et la protéine à des endroits distincts au sein de la glande. Par conséquent, changements dans l’expression d’architecture et protéines canalaire en 3 dimensions (3D) n’est pas vérifiable. Dans l’ensemble, la technique est applicable aux études exigeant des glandes mammaires murins ensemble intacts pour les enquêtes en aval telles que le cancer morphogénèse ou du sein canalaire du développement.

Des souris femelles ont 5 paires de glandes mammaires. Plus précisément, il y a une paire de ganglions cervicaux (#1), deux paires de glandes thoracique (#2 et #3), une paire de glandes abdominales (#4) et 1 paire de glandes inguinales (#5) (Figure 1A). Ici, nous avons isolé les glandes #4 où ils sont facilement identifiables. Dans certaines circonstances, les glandes fois #4 et #5 ont été isolés ensemble car la distinction entre les d...

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Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

Nous présentons ici un protocole pour l’isolement des souris entière et intacte pour étudier l’expression de la matrice extracellulaire (ECM) et de la morphologie ductal des glandes mammaires. La souris #4 glandes abdominales ont été extraits des 8-10 semaines vieux nullipares les souris femelles, fixés dans du formol tamponné neutre, sectionnés et colorés par immunohistochimie pour protéines ECM.

Isolement des glandes mammaires de souris intacte, toute analyse d’Expression de la matrice extracellulaire et la morphologie de la glande

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

Research

JoVE Journal

Biology

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L&#39;isolement et l&#39;analyse physiologique de cardiomyocytes de souris

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