Name: dna staining method based on formazan precipitation induced by blue light exposure
Uploaded: 2018-01-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about DNA Staining Method Based on Formazan Precipitation Induced by Blue Light Exposure at JoVE.com

Diese Arbeit wurde unterstützt von Fondo Nacional de Desarrollo y Científico Tecnológico (Fondecyt), Chile, Projekt 11130263 (für CW), Projekt CONICYT ++ NERC Programa de Überwachung Internacional PCI-PII20150073 (für CW) und U-Inicia aus der Vicerrectoría-de Investigación Universidad de Chile (CW).
Danke an Tatiana Naranjo-Palma für die Hilfe in der Anfangsphase des Projekts, Dr. Jorge Babul und Diego Quiroga-Roger für hilfreiche Diskussion, Robert Lesch für die Überarbeitung des Manuskripts und Dirección de Extensión De La spielte de Ciencias Químicas y Farmacéuticas von Universidad de Chile. Vielen Dank auch an Marcelo Pérez für die Videobearbeitung und Neil Stevens zum Korrigieren von Text und Errol Watson für die Bereitstellung von der Voice-over.

1. Vorbereitung und Ausführung der Gel
<ol><li>Bereiten Sie die nicht Denaturierung 12 % Polyacrylamid-Gel Gele Sodium Dodecyl Sulfat-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE) Rezept fand in Sambrook und Russell14 , aber mit Wasser anstelle von SDS.<ol>
<li>Verwenden Sie um 5 mL Lösung Gel vorzubereiten, 1,7 mL destilliertem Wasser, 2 mL Acrylamid/Bis-Acrylamid (30/0,8 % w/V), 1,3 mL 1,5 M Tris pH 8,8, 0,05 mL 10 % Ammonium bleichen und 0,002 mL TEMED.</li>
		<li>Zur Vorbereitung verwenden 2...

<ol>
	<li>LePecq, J. B., Paoletti, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescent+complex+between+ethidium+bromide+and+nucleic+acids:+physical-chemical+characterization.">A fluorescent complex between ethidium bromide and nucleic acids: physical-chemical characterization.</a> J. Mol. Biol. 27 (1), 87-106 (1967).</li><li>Singer, V. L., Lawlor, T. 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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+visible+dye-based+staining+method+for+DNA+in+polyacrylamide+gels+by+ethyl+violet.">A visible dye-based staining method for DNA in polyacrylamide gels by ethyl violet.</a> Anal. Biochem. 402 (1), 99-101 (2010).</li><li>Altman, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrazolium+salts+and+formazans.">Tetrazolium salts and formazans.</a> Prog. Histochem. Cytochem. 9 (3), 1-56 (1976).</li><li>Nineham, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemistry+of+formazans+and+tetrazolium+salts.">The chemistry of formazans and tetrazolium salts.</a> Chem. Rev. 55 (2), 355-483 (1955).</li><li>Crandall, I. E., Zhao, B., Vlahakis, J. 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Eine sensible und Roman DNA Färbung Methode anhand der Reduzierung der NBT und die Verwendung von SG, die ich in diesem Artikel vorgestellt wurde. Der entscheidende Schritt in diesem Protokoll ist die Inkubationszeit des Gels in der NBT-SG ich Lösung und die Konzentration der NBT. Die Färbung Agarose-Gele dauert länger als bei Acrylamid Gele wegen der größeren Dicke Agarose-Gele. Diese Methode funktioniert nicht gut im Beisein von SDS, wie NBT mit ihm in Berührung ausfällt. Wenn das Gel einen violetten Hintergrun...

Mit den Fortschritten in der Biochemie und Molekularbiologie haben die Studien mit DNA bessere Techniken zur DNA Analyse erforderlich. Die erste Methode für DNA-Färbung wurde Silber Färbung, die sehr empfindlich ist, aber ermangelt Selektivität und erlaubt keine Probenrückgewinnung. Später, erlaubt die Entwicklung von fluoreszierenden DNA-Färbung die selektive Quantifizierung der DNA mit der Möglichkeit der Probenrückgewinnung. Eines der ersten Fluoreszenzfarbstoffen verwendet für DNA-Quantifizierung war Interkalation Bromid1, mutagene2. Allerdings gibt es nun verbesserte fluoreszierende Farbstoffe, die sicherer und empfindlicher, wie GelRed und SYBR Green sind ich (SG ich)3; aber alle diese Leuchtstofffärbungen erfordern den Einsatz eines ultravioletten (UV) Transilluminator oder Fluorimeter.
Es gibt andere Techniken zum Färben sichtbar DNA, wie Methylenblau4 und Kristallviolett5,6,7,8,9, aber all diese Leiden verringerte Empfindlichkeit und Selektivität. Die Tetrazolium-Salze sind organische Verbindungen, die anfällig für Reduktion, und in diesem Fall bilden sie eine unlösliche und farbigen Formazan überstürzen sich10,11. Vor kurzem zeigten einige bivalenten Tetrazoliumsalz Salze aufgrund ihrer positiven Tetrazoliumsalz Ringe12an DNA zu binden.
In den letzten Veröffentlichung13wurde eine neue sichtbare Technik zu färben und zu quantifizieren DNA in Polyacrylamid-Gele vorgeschlagen, mit der Reduktion von bivalenten Tetrazoliumsalz Salz namens Nitro blau Tetrazoliumsalz (NBT) und Fluoreszenz-Farbstoffen wie Interkalation Bromid, GelRed, SYBR Green I und SYBR Gold. Diese Reaktion bei Anwesenheit von blauem Licht oder Sonnenlicht gearbeitet und erlaubt Probenrückgewinnung mit verbesserter Qualität gegenüber dem Einsatz von SG ich mit einem UV-Transilluminator. Das Ziel dieses Papiers ist ein detailliertes Protokoll der Färbung Technik mit Tetrazoliumsalz bieten Salze.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="785">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:187px;">Nitro blue tetrazolium</td>
			<td style="width:227px;">Gold Biotechnology</td>
			<td style="width:307px;">298-83-9</td>
			<td style="width:64px;">reagent used in the staining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:187px;">SYBR Green I 10000X</td>
			<td style="width:227px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:307px;">S7563</td>
			<td>reagent used in the staining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:187px;">Gel extraction kit</td>
			<td style="width:227px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:307px;">28704</td>
			<td>used to extract plasmid from the gel in integrity assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:187px;">DNA ladder</td>
			<td style="width:227px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:307px;">SM 1331</td>
			<td>used to make calibration curves and as reference to cut band in integrity assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:187px;">Agar Agar</td>
			<td style="width:227px;">Merck</td>
			<td style="width:307px;"></td>
			<td>used to make LB-ampicillin culture plates&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:187px;">sodium chloride</td>
			<td style="width:227px;">Merck</td>
			<td style="width:307px;">1064045000</td>
			<td>used to make LB-ampicillin culture plates&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:187px;">yeast extract</td>
			<td style="width:227px;">Becton, Dickinson and Company</td>
			<td style="width:307px;">212750</td>
			<td>used to make LB-ampicillin culture plates&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:187px;">peptone</td>
			<td style="width:227px;">Merck</td>
			<td style="width:307px;">72161000</td>
			<td>used to make LB-ampicillin culture plates&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:187px;">TEMED</td>
			<td style="width:227px;">AMRESCO</td>
			<td style="width:307px;">761</td>
			<td>used to make polyacrylamide gels</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:187px;">ammonium persulfate</td>
			<td style="width:227px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:307px;">2310</td>
			<td>used to make polyacrylamide gels</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:187px;">acrylamide</td>
			<td style="width:227px;">invitrogen</td>
			<td style="width:307px;">15512-023</td>
			<td>used to make polyacrylamide gels</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:187px;">bisacrylamide</td>
			<td style="width:227px;">SIGMA</td>
			<td style="width:307px;">146072</td>
			<td>used to make polyacrylamide gels</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:187px;">Tris-base</td>
			<td style="width:227px;">Merck</td>
			<td style="width:307px;">1083821000</td>
			<td>used to make TAE buffer and non-denaturing polyacrylamide gel tris-HCl buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:187px;">EDTA</td>
			<td style="width:227px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:307px;">8993-01</td>
			<td>used to make TAE buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:187px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:227px;">Merck</td>
			<td style="width:307px;">1,000,632,500</td>
			<td>used to make TAE buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:187px;">agarose</td>
			<td style="width:227px;">Merck</td>
			<td style="width:307px;">16802</td>
			<td>used to make TAE buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:187px;">spectrophotometer</td>
			<td style="width:227px;">Tecan</td>
			<td style="width:307px;">infinite 200 pro</td>
			<td>used to quantify DNA plasmid</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:187px;">water purificatiom unit</td>
			<td style="width:227px;">Merck</td>
			<td style="width:307px;">Elix 100</td>
			<td>use to make water type 1 (ASTM) used in spectrophotometry and DNA dilutions\</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:187px;">distilled water</td>
			<td style="width:227px;"></td>
			<td style="width:307px;">-</td>
			<td>used in gels, culture medium, stainings and general solutions</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:187px;">HCl</td>
			<td style="width:227px;">J.T. Baker</td>
			<td>9535-03</td>
			<td>used to make non-denaturing polyacrylamide gel tris-HCl buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:187px;">6X DNA loading dye</td>
			<td style="width:227px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:307px;">R0610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:187px;">5 mm Blue LED</td>
			<td style="width:227px;">Jinyuan electronics</td>
			<td style="width:307px;">SP-021</td>
			<td>light source used in integrity assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:187px;">protoboard</td>
			<td style="width:227px;">KANDH</td>
			<td style="width:307px;">KH102</td>
			<td>light source support and circuit&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:187px;">9 V battery</td>
			<td style="width:227px;">Duracell</td>
			<td style="width:307px;">-</td>
			<td>used to power the LED&#39;s</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:187px;">horizontal electrophoresis chamber</td>
			<td style="width:227px;">Biorad</td>
			<td style="width:307px;">1704486EDU</td>
			<td>used to make and run agarose gel in integrity assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:187px;">vertical electrophoresis kit</td>
			<td style="width:227px;">Biorad</td>
			<td style="width:307px;">1658002EDU</td>
			<td>used to run polyacrylamide gels in calibration curves</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:187px;">power supply</td>
			<td style="width:227px;">Biorad</td>
			<td style="width:307px;">1645050&#160;</td>
			<td>used to power the electrophoresis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dna staining method based on formazan precipitation induced by blue light exposure

DNA-Färbung Methoden sind sehr wichtig für die biomedizinische Forschung. Wir haben eine einfache Methode, die DNA-Visualisierung mit dem bloßen Auge durch die Bildung von farbigen Niederschlag ermöglicht entwickelt. Es funktioniert durch Einweichen der Acrylamid oder DNA Agarose-gel in einer Lösung aus 1 X (entspricht 2,0 µM) SYBR Green ich (SG ich) und 0,20 mM Nitro blau Tetrazoliumsalz, die eine lila produziert Niederschlag von Formazan bei Sonneneinstrahlung oder speziell blaues Licht. Auch wurden DNA-Recovery Tests durchgeführt mit einem Ampicillin resistent Plasmid in einem Agarosegel mit unserer Methode befleckt. Eine größere Zahl von Kolonien wurde erreicht mit unserer Methode als mit traditionellen Färbung mit SG ich mit UV-Beleuchtung. Das beschriebene Verfahren ist schnell, spezifisch und nicht toxisch für DNA-Nachweis, so dass Visualisierung von Biomolekülen mit dem "bloßen Auge" ohne ein Transilluminator und ist billig und für den mobilen Einsatz geeignet. Aus diesen Gründen hat unsere neue DNA Färbung Methode potenzielle Nutzen für Forschung und Industrie.

Ein violette Formazan Niederschlag erscheint (verifiziert durch Massenspektrometrie13) wo die DNA befindet. Im Experiment wurde eine DNA-Leiter geladen zu einer Kalibrierkurve (Abbildung 3). Das Protokoll arbeitet für Acrylamid und Agarose Gele, aber es hat eine geringere Intensität und nimmt eine längere Zeit in Agarose. Jedoch die Verwendung von Agarose-Gele ermöglicht die Rückgewinnung der Probe mit einem kommerziell erhältlic...

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DNA Staining Method Based on Formazan Precipitation Induced by Blue Light Exposure

Diese Methode erlaubt selektive Färbung und Quantifizierung der DNA in den Gelen durch Einweichen das Gel in einem SYBR Grün ich / Nitro blau Tetrazoliumsalz Lösung und setzen Sie sie dem Sonnenlicht oder eine blaue Lichtquelle. Dies erzeugt einen sichtbaren Niederschlag und erfordert fast keine Ausrüstung, wodurch es ideal für den mobilen Einsatz.

DNA-Färbung Methode basiert auf Formazan Niederschlag induziert durch blaues Licht aussetzen

DNA staining methods are very important for biomedical research. We designed a simple method that allows DNA visualization to the naked eye by the ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Auflösen von Affinity Purified Protein-Komplexen von Blue native PAGE und Protein Correlation Profilieren

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Forschung

Biochemie

Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone

Echtzeit-Tracking der DNA-Fragment-Trennung durch Smartphone

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

DNA-Polymerase-Aktivität Assay mit Nahinfrarot-Leuchtstoff beschrifteten DNA durch Acrylamid Gelelektrophorese sichtbar gemacht

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Eine einfache Methode zur chemischen Hochdurchsatz-Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Elektrochemische Detektion von Deuterium kinetische Isotop Effekt auf extrazelluläre Elektronentransport in Shewanella Oneidensis MR-1

Direct electrochemical detection of c-type cytochrome complexes embedded in the bacterial outer membrane (outer membrane c-type cytochrome complexes; OM ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Analyse der Thylakoidmembran Membran-Protein-komplexe durch blaue Native Gelelektrophorese

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analyse der β-Amyloid-induzierte Anomalien auf Fibrin Gerinnsel Struktur von Spektroskopie und Rasterelektronenmikroskopie

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

DNA-Sequenzerkennung durch DNA-Primase mit High-Throughput Primase Profiling

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Visualisierung der Oberflächen-T-Zell-Rezeptordynamik vierdimensional mit Lattice Light-Sheet-Mikroskopie

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

Messung von Wechselwirkungen zwischen fluoreszierenden Sonden und Lignin in Pflanzenabschnitten durch sFLIM basierend auf nativer Autofluoreszenz

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...