Name: using a microfluidics device for mechanical stimulation and high resolution imaging of c. elegans
Uploaded: 2018-02-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans at JoVE.com

Wir bedanken uns bei Sandra N. Manosalvas-Kjono, Purim Ladpli, Farah Memon, Divya Gopisetty und Veronica Sanchez für Unterstützung im Gerätedesign und Generierung von mutierten Tieren. Diese Forschung wurde unterstützt durch NIH-Stipendien R01EB006745 (zur BLP), R01NS092099 (zu MBG), K99NS089942 (für MK), F31NS100318 (zu ALN) und empfangene Finanzierung vom European Research Council (ERC) unter Horizont 2020 Forschung und Innovation der Europäischen Union Programm () Finanzhilfevereinbarung Nr. 715243 MK).

1. Gerät Fertigung
<ol><li>Download der angehängten Maskendatei (ergänzende Datei 1) und erzeugen eine Chrom-Maske mit einem kommerziellen Dienst oder Inhouse-Anlage. Wie die kleinste Abmessung auf dem Gerät 10 µm (Aktor Membrandicke), sichergestellt, dass die Maske ausreichend hohen Auflösung innerhalb ± 0,25 µm, für die Funktionen zuverlässig zu produzieren.</li>
	<li>
SU-8 Photolithographie Standardmethoden zu folgen (z. B.verweist auf24<su...

<ol>
	<li>Eastwood, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+mechanics+govern+the+rapidly+adapting+and+symmetrical+response+to+touch.">Tissue mechanics govern the rapidly adapting and symmetrical response to touch.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 15 (50), E6955-E6963 (2015).</li><li>Katta, S., Krieg, M., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeling+Force:+Physical+and+Physiological+Principles+Enabling+Sensory+Mechanotransduction.">Feeling Force: Physical and Physiological Principles Enabling Sensory Mechanotransduction.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 31, 347-371 (2015).</li><li>Krieg, M., Dunn, A. R., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+systems+biology+of+C.+elegans+touch+sensation.">Mechanical systems biology of C. elegans touch sensation.</a> BioEssays. 37 (3), 335-344 (2015).</li><li>Krieg, M., Dunn, A. R., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+control+of+the+sense+of+touch+by+&#946;-spectrin.">Mechanical control of the sense of touch by &#946;-spectrin.</a> Nat. Cell Biol. 16 (3), 224-233 (2014).</li><li>Krieg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensile+forces+govern+germ-layer+organization+in+zebrafish.">Tensile forces govern germ-layer organization in zebrafish.</a> Nat Cell Biol. 10 (4), 429-436 (2008).</li><li>Gaub, B. M., M&#252;ller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stimulation+of+Piezo1+receptors+depends+on+extracellular+matrix+proteins+and+directionality+of+force.">Mechanical stimulation of Piezo1 receptors depends on extracellular matrix proteins and directionality of force.</a> Nano Lett. 17 (3), 2064-2072 (2017).</li><li>Geffeney, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DEG/ENaC+but+not+TRP+channels+are+the+major+mechanoelectrical+transduction+channels+in+a+c.+Elegans+nociceptor.">DEG/ENaC but not TRP channels are the major mechanoelectrical transduction channels in a c. Elegans nociceptor.</a> Neuron. 71 (5), 845-857 (2011).</li><li>O'Hagan, R., Chalfie, M., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MEC-4+DEG/ENaC+channel+of+Caenorhabditis+elegans+touch+receptor+neurons+transduces+mechanical+signals.">The MEC-4 DEG/ENaC channel of Caenorhabditis elegans touch receptor neurons transduces mechanical signals.</a> Nat. Neurosci. 8 (1), 43-50 (2005).</li><li>Suzuki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Imaging+of+C.+elegans+Mechanosensory+Neurons+Demonstrates+a+Specific+Role+for+the+MEC-4+Channel+in+the+Process+of+Gentle+Touch+Sensation.">In Vivo Imaging of C. elegans Mechanosensory Neurons Demonstrates a Specific Role for the MEC-4 Channel in the Process of Gentle Touch Sensation.</a> Neuron. 39 (6), 1005-1017 (2003).</li><li>Kopito, R. B., Levine, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Durable+spatiotemporal+surveillance+of+Caenorhabditis+elegans+response+to+environmental+cues.">Durable spatiotemporal surveillance of Caenorhabditis elegans response to environmental cues.</a> Lab Chip. 14 (4), 764-770 (2014).</li><li>Chokshi, T. V., Ben-Yakar, A., Chronis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CO2+and+compressive+immobilization+of+C.+elegans+on-chip.">CO2 and compressive immobilization of C. elegans on-chip.</a> Lab Chip. 9 (1), 151 (2009).</li><li>Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., McGuigan, A. P., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifespan-on-a-chip:+microfluidic+chambers+for+performing+lifelong+observation+of+C.+elegans.">Lifespan-on-a-chip: microfluidic chambers for performing lifelong observation of C. elegans.</a> Lab Chip. 10 (5), 589-597 (2010).</li><li>Li, S., Stone, H. a., Murphy, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+device+and+automatic+counting+system+for+the+study+of+C.+elegans+reproductive+aging.">A microfluidic device and automatic counting system for the study of C. elegans reproductive aging.</a> Lab Chip. 15 (2), 524-531 (2015).</li><li>Chokshi, T. V., Bazopoulou, D., Chronis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+microfluidic+platform+for+calcium+imaging+of+chemosensory+neurons+in+Caenorhabditis+elegans.">An automated microfluidic platform for calcium imaging of chemosensory neurons in Caenorhabditis elegans.</a> Lab Chip. 10 (20), 2758-2763 (2010).</li><li>Mishra, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+microfluidics+chips+for+live+imaging+and+study+of+injury+responses+in+Drosophila+larvae.">Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae.</a> J. Vis. Exp. , e50998 (2014).</li><li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nat. Methods. 4 (9), 727-731 (2007).</li><li>Krajniak, J., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+high-resolution+imaging+and+culture+of+C.+elegans+in+chip-gel+hybrid+microfluidic+device+for+developmental+studies.">Long-term high-resolution imaging and culture of C. elegans in chip-gel hybrid microfluidic device for developmental studies.</a> Lab Chip. 10 (14), 1862-1868 (2010).</li><li>Vasquez, V., Krieg, M., Lockhead, D., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipids+that+Contain+Polyunsaturated+Fatty+Acids+Enhance+Neuronal+Cell+Mechanics+and+Touch+Sensation.">Phospholipids that Contain Polyunsaturated Fatty Acids Enhance Neuronal Cell Mechanics and Touch Sensation.</a> CellReports. 6 (1), 70-80 (2013).</li><li>Krieg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+defects+in+&#946;-spectrin+and+tau+sensitize+C.+elegans+axons+to+movement-induced+damage+via+torque-tension+coupling.">Genetic defects in &#946;-spectrin and tau sensitize C. elegans axons to movement-induced damage via torque-tension coupling.</a> Elife. 6 (2010), e20172 (2017).</li><li>Arnad&#243;ttir, J., O'Hagan, R., Chen, Y., Goodman, M. B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DEG/ENaC+protein+MEC-10+regulates+the+transduction+channel+complex+in+Caenorhabditis+elegans+touch+receptor+neurons.">The DEG/ENaC protein MEC-10 regulates the transduction channel complex in Caenorhabditis elegans touch receptor neurons.</a> J. Neurosci. 31 (35), 12695-12704 (2011).</li><li>Lockhead, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tubulin+repertoire+of+Caenorhabditis+elegans+sensory+neurons+and+its+context-dependent+role+in+process+outgrowth.">The tubulin repertoire of Caenorhabditis elegans sensory neurons and its context-dependent role in process outgrowth.</a> Mol. Biol. Cell. 27 (23), 3717-3728 (2016).</li><li>Goodman, M. B., Ernstrom, G. G., Chelur, D. S., O'hagan, R., Yao, C. A., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MEC-2+regulates+C.+elegans+DEG/ENaC+channels+needed+for+mechanosensation.">MEC-2 regulates C. elegans DEG/ENaC channels needed for mechanosensation.</a> Nature. 415 (6875), 1039-1042 (2002).</li><li>Nekimken, A., Fehlauer, H., Kim, A., Goodman, M., Pruitt, B. L., Krieg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pneumatic+stimulation+of+C.+elegans+mechanoreceptor+neurons+in+a+microfluidic+trap.">Pneumatic stimulation of C. elegans mechanoreceptor neurons in a microfluidic trap.</a> Lab Chip. , (2017).</li><li>Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-step+Variable+Height+Photolithography+for+Valved+Multilayer+Microfluidic+Devices.">Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices.</a> J. Vis. Exp. (119), e55276 (2017).</li><li>Jenkins, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+prototyping+of+PDMS+devices+using+SU-8+lithography.">Rapid prototyping of PDMS devices using SU-8 lithography.</a> Methods Mol. Biol. 949 (1), 153-168 (2013).</li><li>Faustino, V., Catarino, S. O., Lima, R., Minas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomedical+microfluidic+devices+by+using+low-cost+fabrication+techniques:+A+review.">Biomedical microfluidic devices by using low-cost fabrication techniques: A review.</a> J. Biomech. 49 (11), 2280-2292 (2016).</li><li>Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOFT+LITHOGRAPHY.">SOFT LITHOGRAPHY.</a> Annu. Rev. Mater. Sci. 28 (1), 153-184 (1998).</li><li>Chen, T. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Cho, Y., Porto, D., Hwang, H., Grundy, L., Schafer, W. R., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+and+controlled+mechanical+stimulation+and+functional+imaging+in+vivo+in+C.+elegans.">Automated and controlled mechanical stimulation and functional imaging in vivo in C. elegans.</a> Lab Chip. , (2017).</li><li>Edwards, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+molecular+solution+for+ultraviolet+light+detection+in+Caenorhabditis+elegans.">A novel molecular solution for ultraviolet light detection in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Biol. 6 (8), 1715-1729 (2008).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> J. Vis. Exp. (64), e4019 (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Cho, Y., Porto, D. A., Hwang, H., Grundy, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Controlled+Mechanical+Stimulation+and+Functional+Imaging+In+Vivo.">High-Throughput Controlled Mechanical Stimulation and Functional Imaging In Vivo.</a> BiorXiv. , (2017).</li><li>Petzold, B. C., Park, S. -. J., Mazzochette, E. A., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MEMS-based+force-clamp+analysis+of+the+role+of+body+stiffness+in+C.+elegans+touch+sensation.">MEMS-based force-clamp analysis of the role of body stiffness in C. elegans touch sensation.</a> Integr. Biol. (Camb). 5 (6), 853-864 (2013).</li><li>Nekimken, A. L., Mazzochette, E. A., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forces+applied+during+classical+touch+assays+for+Caenorhabditis+elegans.">Forces applied during classical touch assays for Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 12 (5), e0178080 (2017).</li><li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nat. Methods. 4 (9), 727-731 (2007).</li><li>Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+immobilization+of+physiologically+active+Caenorhabditis+elegans.">Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans.</a> Nat. Protoc. 5 (12), 1888-1902 (2010).</li><li>Chuang, H. -. S., Raizen, D. M., Lamb, A., Dabbish, N., Bau, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dielectrophoresis+of+Caenorhabditis+elegans.">Dielectrophoresis of Caenorhabditis elegans.</a> Lab Chip. 11 (4), 599 (2011).</li><li>Christensen, A. M., Chang-Yen, D. A., Gale, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+interconnects+used+in+PDMS+microfluidic+systems.">Characterization of interconnects used in PDMS microfluidic systems.</a> J. Micromechanics Microengineering. 15 (5), 928-934 (2005).</li><li>Gilpin, W., Uppaluri, S., Brangwynne, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worms+under+Pressure:+Bulk+Mechanical+Properties+of+C.+elegans+Are+Independent+of+the+Cuticle.">Worms under Pressure: Bulk Mechanical Properties of C. elegans Are Independent of the Cuticle.</a> Biophys. J. 108 (8), 1887-1898 (2015).</li></ol>

Dieses Protokoll veranschaulicht eine Methode für die Bereitstellung von präzisen mechanischen Stimulation der Haut ein Fadenwurm, gefangen in einem Mikrofluidik-Chip. Es soll die Integration der physikalischen Reize für biologische Fragen erleichtern und Mechanobiology Forschung im biologischen Labor optimieren soll. Diese Methode erweitert vorherigen Tests zur Beurteilung der Funktion der Mechanosensory Neuronen in C. Elegans. Vorherigen quantitative und semi-quantitativen Techniken gemessen Kräfte<sup cla...

Der Tastsinn bietet Tiere mit wichtigen Informationen über ihre Umgebung. Je nach der angewendeten Kraft wird Touch so harmlos, angenehm oder schmerzhaft empfunden. Die Gewebe-Verformung bei Berührung erkannt wird durch spezialisierte Mechanoreceptor Zellen in der Haut eingebettet, die Rezeptor-Proteine, die am häufigsten Ionenkanäle ausdrücken. Die Schritte verknüpfen Kraft Wahrnehmung mit Ionen-Kanal Aktivierung bei Berührung und Schmerz sind nicht vollständig geklärt. Noch weniger ist bekannt über das Hautgewebe filtert mechanische Verformung und ob Mechanorezeptoren erkennen von Änderungen im Stamm oder betonen,1,2,3. Diese Lücke im Verständnis ergibt sich einerseits aus einem Mangel an geeigneten Werkzeugen, präzise mechanische Reize an die Oberfläche der Haut ein lebendes Tier anzuwenden, unter Beachtung der Reaktionen auf zellulärer Ebene. Während Rasterkraftmikroskopie weitgehend verwendet worden ist, anzuwenden und messen Kräfte in isolierten Zellen4,5 und Piezo1 Rezeptoren im Leben aktivieren Zellen6, ähnliche Experimente mit lebenden Tieren, vor allem C. Elegans, wurden notorisch schwierig wegen der inhärenten Mobilität des Subjekts. Diese Herausforderung wird traditionell durch Veterinär- oder chirurgischen Klasse Cyanacrylat Klebstoff, um einzelne Tiere auf Agar-Pads1,7,8,9zu immobilisieren umgangen. Dieser Ansatz ist produktiv gewesen, aber hat Beschränkungen in Bezug auf das Geschick erforderlich für Immobilisierung durch Kleben und die weiche Agar-Oberfläche auf mechanische Compliance. Eine Mikrofluidik-Strategie ist eine kostenlose Alternative, die den Komplikationen verbunden zu kleben vermeidet.
Der Fadenwurm C. Elegans ist ein genetisches Modellorganismus mit einer völlig zugeordneten Nervensystem, das aufgrund der Größe des Tieres, eine gute Passform für Mikrofluidik-Technologie. Mikrofluidik-basierte Geräte bieten den Vorteil, dass die sonst äußerst mobilen Tiere zurückgehalten werden können, während der Durchführung hochauflösende Bildgebung und Lieferung von relevanten Neuro-modulierende reizen. Mit Hilfe von mikrofluidischen können Technologien, lebende Tiere ohne Schaden10,11, ermöglicht Überwachung des Verhaltens Aktivität über die gesamte Lebensdauer12,13 und hochauflösende immobilisiert werden Imaging von neuronaler Aktivität14,15,16,17. Weiter, viele Mechanoreceptor Neuronen benötigt für das Gefühl der Berührung und Schmerz auf ihre physiologischen1,8, mechanische4,18,19, gekennzeichnet werden kann und molekulare Level20,21,22.
C. Elegans spürt sanfte mechanische Reize an seinen Körper Wand mit sechs TRNs, von denen drei innervieren des Tieres anterior (ALML/R und AVM) und drei davon innervieren des Tieres Posterior (PLML/R und PVM). Die Ionen-Kanal Moleküle benötigt für eine ausgeübte Kraft in eine biochemische Signal transducing haben ausgiebig in seiner TRNs8untersucht. Dieser Artikel stellt eine mikrofluidischen Plattform23 , mit dem Forscher präzise mechanische Kräfte auf die Haut von einem immobilisierten C. Elegans anwenden können Fadenwurm, beim Auslesen der Verformung von seiner inneren Geweben durch optische Bildgebung. Neben der Präsentation klar definierte mechanische Reize, können Kalzium Transienten in Mechanoreceptor Neuronen mit subzellulären Auflösung aufgezeichnet und korreliert mit morphologischen und anatomischen Merkmale. Das Gerät besteht aus eine zentrale Trapping-Kanal, der hält ein einziges Tier und präsentiert seine Haut neben sechs pneumatische Betätigung-Kanälen (Abbildung 1 und Abbildung 2). Die sechs Kanäle befinden sich entlang der Trapping-Kanal, mechanische Reize zu jedem der sechs TRNs der Wurm zu liefern. Diese Kanäle sind aus der Trapping-Kammer durch dünne PDMS Membranen, getrennt durch eine externe Luftversorgung der Druck (Abbildung 1) gefahren werden kann. Wir kalibriert die Durchbiegung in Bezug auf Druck und liefern die Messungen in diesem Artikel. Jeder Antrieb kann individuell angesprochen und verwendet, um eine Mechanoreceptor Wahl zu stimulieren. Der Druck wird geliefert mit einem Piezo-gesteuerte Druckpumpe aber alternative Gerät verwendet werden kann. Wir zeigen, dass die Druck-Protokoll verwendet werden kann, TRNs in Vivo aktivieren und demonstrieren Betriebsgeräte geeignet für Erwachsene C. Elegansmechanische Stimuli bereitzustellen, ausgewachsene Tiere in Geräte laden, Kalzium Bildgebung durchführen Experimente und Analyse der Ergebnisse. Gerät Herstellung besteht aus zwei wesentlichen Schritten: 1) Photolithographie zu einer Form von SU-8; und 2) Guß PDMS um ein Gerät zu machen. Aus Gründen der Kürze und Klarheit gekennzeichnet Leser zuvor veröffentlichten Artikel und Protokolle24,25 für Anweisungen, wie man die Werkzeuge und Geräte zu produzieren.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chrome mask</td>
			<td>Compugraphics (http://www.compugraphics-photomasks.com/)</td>
			<td></td>
			<td>5&#39;&#39;, designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chrome mask</td>
			<td>Mitani-Micronics (http://www.mitani-micro.co.jp/en/)</td>
			<td></td>
			<td>5&#39;&#39;, designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chrome mask</td>
			<td>Kuroda-Electric (http://www.kuroda-electric.eu/</td>
			<td></td>
			<td>5&#39;&#39;, designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;&#39; Silicon wafer (B-test)</td>
			<td>Stanford Nanofabrication Facility</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2002</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2050</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-coater</td>
			<td>Laurell Technologies</td>
			<td>WS-400BZ-6NPP/LITE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exposure timer</td>
			<td>Optical Associates, Inc</td>
			<td>OAI 150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumination controller</td>
			<td>Optical Associates, Inc</td>
			<td>2105C2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A426F-1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A18-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloromethylsilane (TCMS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>92361-500ML</td>
			<td>Caution: TCMS is toxic and water-reactive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td></td>
			<td>PDMS prepolymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch, 1 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>95039-090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen Plasma Asher</td>
			<td>Branson/IPC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small metal tubing (0.635 mm OD, 0.4318 mm ID, 12.7 mm long); gage size 23TW</td>
			<td>New England Small Tube Corporation</td>
			<td>NE-1300-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene syringe filter, 0.22 &#956;m</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>725-2520</td>
			<td>to filter all solution, small particles would clog the chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing; 0.9652 mm OD, 0.5842 mm ID</td>
			<td>Solomon Scientific</td>
			<td>BPE-T50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 1 ml</td>
			<td>BD Scientific</td>
			<td>309628</td>
			<td>for worm trapping and release</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 20 ml</td>
			<td>BD Scientific</td>
			<td>309661</td>
			<td>for gravity-based flow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson Minipuls 3, Peristaltic pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>to suck solutions and worms out of the chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic flow controller, equipped with 0&#8211;800 kPa pressure channel</td>
			<td>Elveflow</td>
			<td>OB1 MK3</td>
			<td>pressure delivery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-Resistant Clear Poly- urethane Tubing, 4 mm ID and 6 mm OD</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5195 T52</td>
			<td>connection from house air to pressure pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-Resistant Clear Polyurethane Tubing, 2.6mm ID and 4mm OD</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5195 T51</td>
			<td>connect pressure pump to small tubng</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Push-to-Connect Tube Fitting for Air</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5111K468</td>
			<td>metric - imperial converter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Connector for 6 mm &#215; 1/4&#8243; Tube OD</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5779 K258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMI 4000 B microscopy system</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>63&#215;/1.32 NA HCX PL APO oil objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>506081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamamatsu Orca-Flash 4.0LT digital CMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C11440-42U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lumencor Spectra X light engine</td>
			<td>Lumencor</td>
			<td></td>
			<td>With cyan and green/yellow light source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excitation beam splitter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>59022bs</td>
			<td>in the microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamamatsu W-view Gemini Image splitting optics</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>A12801-01</td>
			<td>to split green and red emission and project them on different areas on the camera chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission beam splitter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>T570lpxr</td>
			<td>in the image splitter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filters GCamp6s</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET525/50m</td>
			<td>in the image splitter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filters mCherry</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET632/60m</td>
			<td>in the image splitter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using a microfluidics device for mechanical stimulation and high resolution imaging of c. elegans

Ein zentrales Ziel des Mechanobiology ist die Wechselwirkung von mechanischem Stress auf Proteine und Zellen zu verstehen. Trotz seiner Bedeutung ist der Einfluss von mechanischem Stress auf zelluläre Funktion immer noch schlecht verstanden. Unter anderem existiert diese Wissenslücke, weil einige Tools gleichzeitige Verformung von Gewebe und Zellen, Bildgebung der Zellaktivität in lebenden Tieren und effiziente Einschränkung der Beweglichkeit in ansonsten hochmobile Modellorganismen wie die Nematoden ermöglichen Caenorhabditis Elegans. Die geringe Größe von C. Elegans stellt sie eine ausgezeichnete Übereinstimmung Mikrofluidik-Forschung Geräte und Lösungen für Immobilisierung wurden mit mikrofluidischen Geräten vorgestellt. Obwohl diese Geräte hochauflösende Bildgebung zu ermöglichen, ist das Tier vollständig eingehüllt in Polydimethylsiloxan (PDMS) und Glas, physischen Zugriff für die Lieferung der mechanischen Kraft oder elektrophysiologische Aufnahmen zu begrenzen. Vor kurzem haben wir ein Gerät, das pneumatische Antriebe mit einem Trapping-Design integriert, die mit hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie kompatibel ist. Die Betätigung-Kanal trennt sich von den Wurm-Trapping-Kanal durch eine dünne Membran PDMS. Diese Membran ist in die Seite eines Wurms abgelenkt durch Druck aus einer externen Quelle. Das Gerät kann individuelle Mechanosensitive Neuronen ausrichten. Die Aktivierung dieser Neuronen ist abgebildet bei hochauflösenden mit genetisch codierte Kalzium Indikatoren. Dieser Artikel stellt die allgemeine Methode mit C. Elegans Stämme Calcium-Sensitive Aktivitätsanzeige (GCaMP6s) in ihrer Touch-Rezeptor-Neuronen (TRNs) zum Ausdruck zu bringen. Die Methode ist nicht beschränkt auf TRNs noch auf Kalzium-Sensoren als Sonde jedoch, auf andere mechanisch empfindlichen Zellen oder Sensoren erweitert werden kann.

SU-8 Lithographie und Chip Bonding Die Lithographie Protokoll und PDMS-Spritzgießen folgen Standardverfahren. Details finden an anderer Stelle23,24,25,26. Die PDMS sollte nach dem Aushärten der Wafer ohne Probleme abziehen. Wenn die SU-8-Features während PDMS Peelings Abzocke, reichten die SU-8 Adhäsion Schicht oder der Silanisierung. Wen...

Watch this Scientific Journal Video about Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans at JoVE.com

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

Neue Werkzeuge für die Mechanobiology Forschung sind erforderlich, um verstehen, wie mechanischen Beanspruchung biochemische Stoffwechselwege aktiviert und biologische Reaktionen hervorruft. Hier präsentieren wir eine neue Methode zur selektiven mechanischen Stimulation der immobilisierten Tiere mit einem mikrofluidischen Trap ermöglicht hochauflösende Bildgebung der zellulären Antworten.

Verwendung von einem Mikrofluidik-Gerät für mechanische Stimulation und High Resolution Imaging von C. elegans

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

Assaying &beta;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

Assaying ÃƒÅ½Ã‚Â²-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

Assaying β-Amyloid-Toxizität mit Hilfe eines transgenen C. elegans Modell

Accumulation of the &beta;-amyloid peptide (A&beta;) is generally believed to be central to the induction of Alzheimer's disease, but the relevant ...

Forschung

Neurowissenschaften

Combining Transcranial Magnetic Stimulation and fMRI to Examine the Default Mode Network

Die Kombination TMS und fMRT dem Standard-Modus Netzwerk Untersuchen

The default mode network is a group of brain regions that are active when an individual is not focused on the outside world and the brain is at "wakeful ...

TMS: Using the Theta-Burst Protocol to Explore Mechanism of Plasticity in Individuals with Fragile X Syndrome and Autism

TMS: Mit dem Theta-Burst-Protokoll zu Mechasnism der Plastizität in Individuen sich mit Fragile X-Syndrom und Autismus

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS ...

State-Dependency Effects on TMS:  A Look at Motive Phosphene Behavior

State-Dependency Auswirkungen auf TMS: Ein Blick auf Motive Phosphene Behavior

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate ...

The NeuroStar TMS Device: Conducting the FDA Approved Protocol for Treatment of Depression

Die Neurostar TMS Device: Die Durchführung der FDA genehmigten Protokoll für die Behandlung von Depression

The Neuronetics NeuroStar Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) System is a class II medical device that produces brief duration, pulsed magnetic ...

Enabling High Grayscale Resolution Displays and Accurate Response Time Measurements on Conventional Computers

Enabling High Graustufen auflösende Displays und präzise Antwort Zeitmessungen auf herkömmlichen Computern

Display systems based on conventional computer graphics cards are capable of generating images with 8-bit gray level resolution. However, most experiments ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Hochauflösende Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Mittelhirn

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

Hochauflösende Live-Bildgebung von Zell-Verhalten in der Entwicklung von Neuroepithel

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Automatisierte Quantifizierung der Fluoreszenz-in Synaptic<em&gt; C elegans</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronale Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...