Name: using a microfluidics device for mechanical stimulation and high resolution imaging of c. elegans
Uploaded: 2018-02-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans at JoVE.com

Agradecemos a Sandra N. Manosalvas-Kjono, Ladpli de Purim, Farah Memon, Divya Gopisetty e Veronica Sanchez para apoiar no projeto de dispositivo e geração de animais mutantes. Esta pesquisa foi apoiada por subsídios de NIH R01EB006745 (a BLP), R01NS092099 (para MBG), K99NS089942 (a MK), F31NS100318 (a ALN) e recebeu financiamento do Conselho Europeu de investigação (CEI), sob o Horizonte 2020 pesquisa e inovação da União Europeia (do programa Convenção de subvenção n. º 715243 para MK).

1. dispositivo fabricação
<ol><li>Baixe o arquivo de máscara (arquivo suplementar 1) e gerar uma máscara de cromo usando um serviço comercial ou instalações in-house. Como a menor dimensão no dispositivo é 10 µm (espessura de membrana do atuador), certifique-se de que a máscara tem resolução suficientemente alta, dentro de ± 0,25 µm, para produzir os recursos.</li>
	<li>
Seguir métodos de fotolitografia padrão SU-8 (por exemplo, referências24</...

<ol>
	<li>Eastwood, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+mechanics+govern+the+rapidly+adapting+and+symmetrical+response+to+touch.">Tissue mechanics govern the rapidly adapting and symmetrical response to touch.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 15 (50), E6955-E6963 (2015).</li><li>Katta, S., Krieg, M., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeling+Force:+Physical+and+Physiological+Principles+Enabling+Sensory+Mechanotransduction.">Feeling Force: Physical and Physiological Principles Enabling Sensory Mechanotransduction.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 31, 347-371 (2015).</li><li>Krieg, M., Dunn, A. R., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+systems+biology+of+C.+elegans+touch+sensation.">Mechanical systems biology of C. elegans touch sensation.</a> BioEssays. 37 (3), 335-344 (2015).</li><li>Krieg, M., Dunn, A. R., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+control+of+the+sense+of+touch+by+&#946;-spectrin.">Mechanical control of the sense of touch by &#946;-spectrin.</a> Nat. Cell Biol. 16 (3), 224-233 (2014).</li><li>Krieg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensile+forces+govern+germ-layer+organization+in+zebrafish.">Tensile forces govern germ-layer organization in zebrafish.</a> Nat Cell Biol. 10 (4), 429-436 (2008).</li><li>Gaub, B. M., M&#252;ller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stimulation+of+Piezo1+receptors+depends+on+extracellular+matrix+proteins+and+directionality+of+force.">Mechanical stimulation of Piezo1 receptors depends on extracellular matrix proteins and directionality of force.</a> Nano Lett. 17 (3), 2064-2072 (2017).</li><li>Geffeney, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DEG/ENaC+but+not+TRP+channels+are+the+major+mechanoelectrical+transduction+channels+in+a+c.+Elegans+nociceptor.">DEG/ENaC but not TRP channels are the major mechanoelectrical transduction channels in a c. Elegans nociceptor.</a> Neuron. 71 (5), 845-857 (2011).</li><li>O'Hagan, R., Chalfie, M., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MEC-4+DEG/ENaC+channel+of+Caenorhabditis+elegans+touch+receptor+neurons+transduces+mechanical+signals.">The MEC-4 DEG/ENaC channel of Caenorhabditis elegans touch receptor neurons transduces mechanical signals.</a> Nat. Neurosci. 8 (1), 43-50 (2005).</li><li>Suzuki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Imaging+of+C.+elegans+Mechanosensory+Neurons+Demonstrates+a+Specific+Role+for+the+MEC-4+Channel+in+the+Process+of+Gentle+Touch+Sensation.">In Vivo Imaging of C. elegans Mechanosensory Neurons Demonstrates a Specific Role for the MEC-4 Channel in the Process of Gentle Touch Sensation.</a> Neuron. 39 (6), 1005-1017 (2003).</li><li>Kopito, R. B., Levine, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Durable+spatiotemporal+surveillance+of+Caenorhabditis+elegans+response+to+environmental+cues.">Durable spatiotemporal surveillance of Caenorhabditis elegans response to environmental cues.</a> Lab Chip. 14 (4), 764-770 (2014).</li><li>Chokshi, T. V., Ben-Yakar, A., Chronis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CO2+and+compressive+immobilization+of+C.+elegans+on-chip.">CO2 and compressive immobilization of C. elegans on-chip.</a> Lab Chip. 9 (1), 151 (2009).</li><li>Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., McGuigan, A. P., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifespan-on-a-chip:+microfluidic+chambers+for+performing+lifelong+observation+of+C.+elegans.">Lifespan-on-a-chip: microfluidic chambers for performing lifelong observation of C. elegans.</a> Lab Chip. 10 (5), 589-597 (2010).</li><li>Li, S., Stone, H. a., Murphy, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+device+and+automatic+counting+system+for+the+study+of+C.+elegans+reproductive+aging.">A microfluidic device and automatic counting system for the study of C. elegans reproductive aging.</a> Lab Chip. 15 (2), 524-531 (2015).</li><li>Chokshi, T. V., Bazopoulou, D., Chronis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+microfluidic+platform+for+calcium+imaging+of+chemosensory+neurons+in+Caenorhabditis+elegans.">An automated microfluidic platform for calcium imaging of chemosensory neurons in Caenorhabditis elegans.</a> Lab Chip. 10 (20), 2758-2763 (2010).</li><li>Mishra, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+microfluidics+chips+for+live+imaging+and+study+of+injury+responses+in+Drosophila+larvae.">Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae.</a> J. Vis. Exp. , e50998 (2014).</li><li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nat. Methods. 4 (9), 727-731 (2007).</li><li>Krajniak, J., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+high-resolution+imaging+and+culture+of+C.+elegans+in+chip-gel+hybrid+microfluidic+device+for+developmental+studies.">Long-term high-resolution imaging and culture of C. elegans in chip-gel hybrid microfluidic device for developmental studies.</a> Lab Chip. 10 (14), 1862-1868 (2010).</li><li>Vasquez, V., Krieg, M., Lockhead, D., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipids+that+Contain+Polyunsaturated+Fatty+Acids+Enhance+Neuronal+Cell+Mechanics+and+Touch+Sensation.">Phospholipids that Contain Polyunsaturated Fatty Acids Enhance Neuronal Cell Mechanics and Touch Sensation.</a> CellReports. 6 (1), 70-80 (2013).</li><li>Krieg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+defects+in+&#946;-spectrin+and+tau+sensitize+C.+elegans+axons+to+movement-induced+damage+via+torque-tension+coupling.">Genetic defects in &#946;-spectrin and tau sensitize C. elegans axons to movement-induced damage via torque-tension coupling.</a> Elife. 6 (2010), e20172 (2017).</li><li>Arnad&#243;ttir, J., O'Hagan, R., Chen, Y., Goodman, M. B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DEG/ENaC+protein+MEC-10+regulates+the+transduction+channel+complex+in+Caenorhabditis+elegans+touch+receptor+neurons.">The DEG/ENaC protein MEC-10 regulates the transduction channel complex in Caenorhabditis elegans touch receptor neurons.</a> J. Neurosci. 31 (35), 12695-12704 (2011).</li><li>Lockhead, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tubulin+repertoire+of+Caenorhabditis+elegans+sensory+neurons+and+its+context-dependent+role+in+process+outgrowth.">The tubulin repertoire of Caenorhabditis elegans sensory neurons and its context-dependent role in process outgrowth.</a> Mol. Biol. Cell. 27 (23), 3717-3728 (2016).</li><li>Goodman, M. B., Ernstrom, G. G., Chelur, D. S., O'hagan, R., Yao, C. A., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MEC-2+regulates+C.+elegans+DEG/ENaC+channels+needed+for+mechanosensation.">MEC-2 regulates C. elegans DEG/ENaC channels needed for mechanosensation.</a> Nature. 415 (6875), 1039-1042 (2002).</li><li>Nekimken, A., Fehlauer, H., Kim, A., Goodman, M., Pruitt, B. L., Krieg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pneumatic+stimulation+of+C.+elegans+mechanoreceptor+neurons+in+a+microfluidic+trap.">Pneumatic stimulation of C. elegans mechanoreceptor neurons in a microfluidic trap.</a> Lab Chip. , (2017).</li><li>Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-step+Variable+Height+Photolithography+for+Valved+Multilayer+Microfluidic+Devices.">Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices.</a> J. Vis. Exp. (119), e55276 (2017).</li><li>Jenkins, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+prototyping+of+PDMS+devices+using+SU-8+lithography.">Rapid prototyping of PDMS devices using SU-8 lithography.</a> Methods Mol. Biol. 949 (1), 153-168 (2013).</li><li>Faustino, V., Catarino, S. O., Lima, R., Minas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomedical+microfluidic+devices+by+using+low-cost+fabrication+techniques:+A+review.">Biomedical microfluidic devices by using low-cost fabrication techniques: A review.</a> J. Biomech. 49 (11), 2280-2292 (2016).</li><li>Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOFT+LITHOGRAPHY.">SOFT LITHOGRAPHY.</a> Annu. Rev. Mater. Sci. 28 (1), 153-184 (1998).</li><li>Chen, T. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Cho, Y., Porto, D., Hwang, H., Grundy, L., Schafer, W. R., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+and+controlled+mechanical+stimulation+and+functional+imaging+in+vivo+in+C.+elegans.">Automated and controlled mechanical stimulation and functional imaging in vivo in C. elegans.</a> Lab Chip. , (2017).</li><li>Edwards, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+molecular+solution+for+ultraviolet+light+detection+in+Caenorhabditis+elegans.">A novel molecular solution for ultraviolet light detection in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Biol. 6 (8), 1715-1729 (2008).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> J. Vis. Exp. (64), e4019 (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Cho, Y., Porto, D. A., Hwang, H., Grundy, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Controlled+Mechanical+Stimulation+and+Functional+Imaging+In+Vivo.">High-Throughput Controlled Mechanical Stimulation and Functional Imaging In Vivo.</a> BiorXiv. , (2017).</li><li>Petzold, B. C., Park, S. -. J., Mazzochette, E. A., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MEMS-based+force-clamp+analysis+of+the+role+of+body+stiffness+in+C.+elegans+touch+sensation.">MEMS-based force-clamp analysis of the role of body stiffness in C. elegans touch sensation.</a> Integr. Biol. (Camb). 5 (6), 853-864 (2013).</li><li>Nekimken, A. L., Mazzochette, E. A., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forces+applied+during+classical+touch+assays+for+Caenorhabditis+elegans.">Forces applied during classical touch assays for Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 12 (5), e0178080 (2017).</li><li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nat. Methods. 4 (9), 727-731 (2007).</li><li>Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+immobilization+of+physiologically+active+Caenorhabditis+elegans.">Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans.</a> Nat. Protoc. 5 (12), 1888-1902 (2010).</li><li>Chuang, H. -. S., Raizen, D. M., Lamb, A., Dabbish, N., Bau, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dielectrophoresis+of+Caenorhabditis+elegans.">Dielectrophoresis of Caenorhabditis elegans.</a> Lab Chip. 11 (4), 599 (2011).</li><li>Christensen, A. M., Chang-Yen, D. A., Gale, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+interconnects+used+in+PDMS+microfluidic+systems.">Characterization of interconnects used in PDMS microfluidic systems.</a> J. Micromechanics Microengineering. 15 (5), 928-934 (2005).</li><li>Gilpin, W., Uppaluri, S., Brangwynne, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worms+under+Pressure:+Bulk+Mechanical+Properties+of+C.+elegans+Are+Independent+of+the+Cuticle.">Worms under Pressure: Bulk Mechanical Properties of C. elegans Are Independent of the Cuticle.</a> Biophys. J. 108 (8), 1887-1898 (2015).</li></ol>

Este protocolo demonstra um método de distribuição precisa estimulação mecânica na pele de uma lombriga, presa em um chip microfluidic. Destina-se a facilitar a integração dos estímulos físicos para responder às perguntas biológicas e visa agilizar a pesquisa de mechanobiology em laboratórios biológicos. Esse método amplia anteriores ensaios para avaliar a função dos neurônios mechanosensory em c. elegans. Técnicas quantitativas e semi-quantitativa anteriores medido forças1<...

O sentido do tato fornece animais com informações cruciais sobre seu ambiente. Dependendo da força aplicada, o toque é percebido como inócuo, prazeroso ou doloroso. A deformação do tecido durante o toque é detectada pelas células especializadas Mecanorreceptor incorporadas na pele que expressam proteínas do receptor, mais comumente canais iônicos. As etapas ligando a percepção da força para ativação de canal de íon durante o toque e a dor não são totalmente compreendidas. Menos ainda se sabe sobre como o tecido da pele filtra deformação mecânica e se mecanorreceptores detectam alterações na tensão ou stress1,2,3. Esta lacuna na compreensão decorre, em parte, a falta de ferramentas adequadas para aplicar estímulos mecânicos precisos para a superfície da pele de um animal vivo enquanto observa as respostas a nível celular. Considerando que a microscopia de força atômica tem sido amplamente utilizada para aplicar e medir forças em células isoladas de4,5 e também para ativar receptores Piezo1 em vida células6, experimentos semelhantes usando animais vivos, especialmente C. elegans, têm sido notoriamente desafiadora devido a mobilidade intrínseca do assunto. Tradicionalmente, este desafio é contornado usando cola de cianoacrilato de veterinária - ou -grau cirúrgico para imobilizar animais individuais em ágar almofadas1,7,8,9. Esta abordagem tem sido produtiva, mas tem limitações relacionadas com a habilidade necessária para a imobilização por colagem e superfície do agar macio na conformidade mecânica. Uma estratégia de microfluídica é uma alternativa gratuita que evita algumas das complicações ligadas à colagem.
O nemátodo c. elegans é um organismo modelo genético cujo sistema nervoso completamente mapeado que, devido ao tamanho do animal, é uma boa opção para tecnologia microfluídica. Oferta de dispositivos baseados em microfluídica a vantagem que os animais caso contrário extremamente móveis podem ser contidos durante a execução de imagens de alta resolução e entrega de estímulos neuro-moduladora relevantes. Com a ajuda de microfluidic tecnologias, vivem animais podem ser imobilizadas sem dano10,11, permitindo o monitoramento da atividade comportamental ao longo da vida inteira de12,13 e de alta resolução imagem de atividade neuronal14,15,16,17. Além disso, muitos neurônios Mecanorreceptor necessários para o sentido de toque e a dor pode ser caracterizado em sua fisiológicas1,8, mecânica4,18,19e molecular nível20,21,22.
C. elegans sentidos suaves estímulos mecânicos para sua parede do corpo usando seis TRNs, três dos quais inervam do animal anterior (ALML/R e AVM) e três dos quais inervam posterior do animal (PLML/R e PVM). As moléculas de canal de iões necessárias para transducing uma força aplicada em um sinal de bioquímico têm sido muito estudadas em seu TRNs8. Este artigo apresenta uma plataforma microfluidic23 que permite que os investigadores a aplicar forças mecânicas precisas na pele de um imobilizado c. elegans lombriga, ao ler a deformação de seus tecidos internos pela imagem latente ótica. Além de apresentar estímulos mecânicos bem definidos, transientes de cálcio podem ser gravados em neurônios Mecanorreceptor com resolução subcellular e correlacionados com características morfológicas e anatômicas. O dispositivo consiste de um canal central de interceptação que mantém um único animal e apresenta sua pele ao lado de seis canais de acionamento pneumático (Figura 1 e Figura 2). Os seis canais estão posicionados ao longo do canal de armadilhas para entregar a estímulos mecânicos para cada um dos seis TRNs do worm. Estes canais são separados da câmara de captura por diafragmas PDMS finos, que podem ser conduzidos por uma fonte de pressão do ar externo (Figura 1). Nós calibrado a deflexão em relação a pressão e fornecer as medições neste artigo. Cada atuador pode ser abordada individualmente e usado para estimular um Mecanorreceptor de escolha. A pressão é fornecida usando uma bomba de pressão piezo-driven, mas qualquer dispositivo alternativo pode ser usado. Nós mostramos que o protocolo de pressão pode ser usado para ativar TRNs na vivo e demonstrar o funcionamento dispositivos adequados para entrega de estímulos mecânicos para adultos c. elegans, carregar animais adultos em dispositivos, realizando a imagem latente de cálcio experiências e analisando os resultados. Fabricação de dispositivo consiste de duas etapas principais: 1) fotolitos para fazer um molde de SU-8; e 2) PDMS para tornar um dispositivo de moldagem. Por uma questão de brevidade e clareza, os leitores são referidos anteriormente publicados artigos e protocolos24,25 para obter instruções sobre como produzir os moldes e dispositivos.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chrome mask</td>
			<td>Compugraphics (http://www.compugraphics-photomasks.com/)</td>
			<td></td>
			<td>5&#39;&#39;, designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chrome mask</td>
			<td>Mitani-Micronics (http://www.mitani-micro.co.jp/en/)</td>
			<td></td>
			<td>5&#39;&#39;, designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chrome mask</td>
			<td>Kuroda-Electric (http://www.kuroda-electric.eu/</td>
			<td></td>
			<td>5&#39;&#39;, designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;&#39; Silicon wafer (B-test)</td>
			<td>Stanford Nanofabrication Facility</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2002</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2050</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-coater</td>
			<td>Laurell Technologies</td>
			<td>WS-400BZ-6NPP/LITE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exposure timer</td>
			<td>Optical Associates, Inc</td>
			<td>OAI 150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumination controller</td>
			<td>Optical Associates, Inc</td>
			<td>2105C2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A426F-1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A18-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloromethylsilane (TCMS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>92361-500ML</td>
			<td>Caution: TCMS is toxic and water-reactive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td></td>
			<td>PDMS prepolymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch, 1 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>95039-090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen Plasma Asher</td>
			<td>Branson/IPC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small metal tubing (0.635 mm OD, 0.4318 mm ID, 12.7 mm long); gage size 23TW</td>
			<td>New England Small Tube Corporation</td>
			<td>NE-1300-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene syringe filter, 0.22 &#956;m</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>725-2520</td>
			<td>to filter all solution, small particles would clog the chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing; 0.9652 mm OD, 0.5842 mm ID</td>
			<td>Solomon Scientific</td>
			<td>BPE-T50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 1 ml</td>
			<td>BD Scientific</td>
			<td>309628</td>
			<td>for worm trapping and release</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 20 ml</td>
			<td>BD Scientific</td>
			<td>309661</td>
			<td>for gravity-based flow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson Minipuls 3, Peristaltic pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>to suck solutions and worms out of the chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic flow controller, equipped with 0&#8211;800 kPa pressure channel</td>
			<td>Elveflow</td>
			<td>OB1 MK3</td>
			<td>pressure delivery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-Resistant Clear Poly- urethane Tubing, 4 mm ID and 6 mm OD</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5195 T52</td>
			<td>connection from house air to pressure pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-Resistant Clear Polyurethane Tubing, 2.6mm ID and 4mm OD</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5195 T51</td>
			<td>connect pressure pump to small tubng</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Push-to-Connect Tube Fitting for Air</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5111K468</td>
			<td>metric - imperial converter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Connector for 6 mm &#215; 1/4&#8243; Tube OD</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5779 K258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMI 4000 B microscopy system</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>63&#215;/1.32 NA HCX PL APO oil objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>506081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamamatsu Orca-Flash 4.0LT digital CMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C11440-42U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lumencor Spectra X light engine</td>
			<td>Lumencor</td>
			<td></td>
			<td>With cyan and green/yellow light source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excitation beam splitter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>59022bs</td>
			<td>in the microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamamatsu W-view Gemini Image splitting optics</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>A12801-01</td>
			<td>to split green and red emission and project them on different areas on the camera chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission beam splitter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>T570lpxr</td>
			<td>in the image splitter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filters GCamp6s</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET525/50m</td>
			<td>in the image splitter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filters mCherry</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET632/60m</td>
			<td>in the image splitter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using a microfluidics device for mechanical stimulation and high resolution imaging of c. elegans

Um objetivo central da mechanobiology é entender o efeito recíproco de estresse mecânico em proteínas e células. Apesar de sua importância, a influência do estresse mecânico na função celular é ainda mal compreendida. Em parte, essa lacuna de conhecimento existe porque alguns ferramentas permitem a deformação simultânea de tecidos e células, imagens da atividade celular em animais vivos e eficiente restrição da motilidade em organismos-modelo caso contrário altamente móveis, tais como o nematódeo Caenorhabditis elegans. O pequeno tamanho da c. elegans -los faz um excelente partido para dispositivos de microfluídica-com base em pesquisa, e foram apresentadas soluções para imobilização usando dispositivos microfluídicos. Embora estes dispositivos permitem imagens de alta resolução, o animal é totalmente envolto em polydimethylsiloxane (PDMS) e vidro, limitando o acesso físico para entrega de força mecânica ou eletrofisiológicas gravações. Recentemente, criamos um dispositivo que integra actuadores pneumáticos com um design de captura compatível com microscopia de fluorescência de alta resolução. O canal de atuação é separado pelo canal da interceptação de verme por uma fina membrana PDMS. Este diafragma é desviada para o lado de um verme aplicando pressão de uma fonte externa. O dispositivo pode direcionar os neurônios mechanosensitive individuais. A ativação desses neurônios é fotografada em alta resolução com indicadores de cálcio geneticamente codificado. Este artigo apresenta o método geral usando cepas de c. elegans , expressando o indicador de atividade de cálcio sensíveis (GCaMP6s) em seus neurônios receptores de toque (TRNs). O método, no entanto, não está limitado aos TRNs nem aos sensores de cálcio como uma sonda, mas pode ser expandido para outras células mecanicamente sensíveis ou sensores.

SU-8 litografia e colagem de Chip O protocolo de litografia e moldagem de PDMS sigam os procedimentos padrão. Detalhes podem ser encontrados em outros lugares23,24,25,26. O PDMS deve descascar fora a hóstia sem problemas após a cura. Se os recursos de SU-8 arrancar durante o descascamento de PDMS, ou a camada de aderência de SU-8 ou a sil...

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Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

Novas ferramentas para pesquisa de mechanobiology são necessários para compreender o estresse mecânico como ativa vias bioquímicas e elicia respostas biológicas. Aqui, vamos mostrar um novo método para a estimulação mecânica seletiva dos animais imobilizados com uma armadilha de microfluidic permitindo imagens de alta resolução de respostas celulares.

Utilizando um dispositivo microfluídica para estimulação mecânica e alta resolução de imagem de c. elegans

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

Assaying &beta;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

Assaying ÃƒÅ½Ã‚Â²-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

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