Name: saturated fatty acids induce ceramide-associated macrophage cell death
Uploaded: 2017-10-31T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Saturated Fatty Acids Induce Ceramide-associated Macrophage Cell Death at JoVE.com

עבודה זו נתמכה חלקית על ידי ראשונית אוניברסיטת לואיוויל ומענקים המכון הלאומי לסרטן (בת'סדה, מרילנד) R01CA177679, R01CA180986.

הפרוטוקול אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת לואיוויל.
 1. עכבר מח עצם נגזר מקרופאגים (BMDMs) <ol><li>Euthanize עכבר 6 עד 8-בת, בריא פראי סוג באמצעות CO 2. להצמיד אותו למטה לוח קצף, תשפריץ עם אתנול 70% עד שהכל רטוב. הסר את עצמות השוקה/עצם הירך עם מלקח...

<ol>
	<li>Martins de Lima, T., Cury-Boaventura, M. F., Giannocco, G., Nunes, M. T., Curi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+toxicity+of+fatty+acids+on+a+macrophage+cell+line+(J774).">Comparative toxicity of fatty acids on a macrophage cell line (J774).</a> Clin Sci (Lond). 111 (5), 307-317 (2006).</li><li>Simard, J. R., Zunszain, P. A., Hamilton, J. A., Curry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location+of+high+and+low+affinity+fatty+acid+binding+sites+on+human+serum+albumin+revealed+by+NMR+drug-competition+analysis.">Location of high and low affinity fatty acid binding sites on human serum albumin revealed by NMR drug-competition analysis.</a> J Mol Biol. 361 (2), 336-351 (2006).</li><li>Penn, A. H., Dubick, M. A., Torres Filho, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+Acid+Saturation+of+Albumin+Used+in+Resuscitation+Fluids+Modulates+Cell+Damage+in+Shock:+In+Vitro+Results+Using+a+Novel+Technique+to+Measure+Fatty+Acid+Binding+Capacity.">Fatty Acid Saturation of Albumin Used in Resuscitation Fluids Modulates Cell Damage in Shock: In Vitro Results Using a Novel Technique to Measure Fatty Acid Binding Capacity.</a> Shock. , (2017).</li><li>Vusse, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Albumin+as+fatty+acid+transporter.">Albumin as fatty acid transporter.</a> Drug Metab Pharmacokinet. 24 (4), 300-307 (2009).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+Fatty+Acid+Binding+Protein+Promotes+Saturated+Fatty+Acid-Induced+Macrophage+Cell+Death+through+Enhancing+Ceramide+Production.">Adipose Fatty Acid Binding Protein Promotes Saturated Fatty Acid-Induced Macrophage Cell Death through Enhancing Ceramide Production.</a> J Immunol. 198 (2), 798-807 (2017).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+Fatty+Acid+binding+protein+promotes+skin+inflammation+induced+by+high-fat+diet.">Epidermal Fatty Acid binding protein promotes skin inflammation induced by high-fat diet.</a> Immunity. 42 (5), 953-964 (2015).</li><li>Wen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid-induced+NLRP3-ASC+inflammasome+activation+interferes+with+insulin+signaling.">Fatty acid-induced NLRP3-ASC inflammasome activation interferes with insulin signaling.</a> Nat Immunol. 12 (5), 408-415 (2011).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid-binding+protein+E-FABP+restricts+tumor+growth+by+promoting+IFN-beta+responses+in+tumor-associated+macrophages.">Fatty acid-binding protein E-FABP restricts tumor growth by promoting IFN-beta responses in tumor-associated macrophages.</a> Cancer Res. 74 (11), 2986-2998 (2014).</li><li>Ulloth, J. E., Casiano, C. A., De Leon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitic+and+stearic+fatty+acids+induce+caspase-dependent+and+-independent+cell+death+in+nerve+growth+factor+differentiated+PC12+cells.">Palmitic and stearic fatty acids induce caspase-dependent and -independent cell death in nerve growth factor differentiated PC12 cells.</a> J Neurochem. 84 (4), 655-668 (2003).</li><li>Weischenfeldt, J., Porse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+Marrow-Derived+Macrophages+(BMM):+Isolation+and+Applications.">Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications.</a> CSH Protoc. , (2008).</li><li>Dansen, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-affinity+binding+of+very-long-chain+fatty+acyl-CoA+esters+to+the+peroxisomal+non-specific+lipid-transfer+protein+(sterol+carrier+protein-2).">High-affinity binding of very-long-chain fatty acyl-CoA esters to the peroxisomal non-specific lipid-transfer protein (sterol carrier protein-2).</a> Biochem J. 339 (Pt 1), 193-199 (1999).</li><li>Ulloth, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+methyl-beta-cyclodextrin+toxicity+in+NGF-differentiated+PC12+cell+death.">Characterization of methyl-beta-cyclodextrin toxicity in NGF-differentiated PC12 cell death.</a> Neurotoxicology. 28 (3), 613-621 (2007).</li></ol>

הכנה נכונה של חומצת שומן פתרון יש חשיבות קריטית כדי ללמוד את התפקוד הביולוגי של חומצות שומן. הניטרול של חומצת שומן מעלה מסיסות שלה ב תמיסה מימית. עם זאת, מלחי נתרן של חומצות שומן, בעיקר חומצות שומן רוויות, הן עדיין של מסיסות נמוכה במים או PBS הבחנו. שיטה אחת היא להשתמש אתנול 95-100% כדי לסייע לפזר ...

חומצות שומן לשחק תפקיד חיוני לחילוף חומרים של אנרגיה, הסינתזה של קרום phospholipids סוגים שונים של תאים. חומצות שומן יש המסיסות מימית נמוכה. הכנה מתאימה של חומצות שומן יש חשיבות קריטית ללמוד על תפקודים ביולוגיים של חומצות שומן בתאי יונקים. כאשר חומצות שומן מוכנים עם אתנול, חומצות שומן רבים עשוי להראות השפעתם רעילים סבון (דטרגנטים) על קרום התא, אפילו בריכוזים נמוכים יחסית1. בתור נהג טבעי, רס ן עבור חומצות שומן בחינם בהסרום, אלבומין נחשב נשאית טוב של חומצת שומן משלוח במבחנה חומצת שומן פונקציה מבחני2,3,4. עם זאת, הפרטים של הכנת המספר המשלים חומצת שומן, אלבומין בדרך כלל אינם זמינים אף-על-פי פורסמו עבודות מחקר רבות באמצעות חומצות שומן.
מקרופאגים לבטא מאוד אפידרמיס חומצת שומן מחייב חלבון ואת אדיפוז חומצת שומן מחייב חלבון5,6,7,8. הם באופן פעיל ספיגת רווי, חומצות שומן בלתי רוויות אשר ייתכן לווסת פונקציות החיסונית שלהם. לחקור את ההשפעה של חומצות שומן על מקרופאגים ותאים אחרים, שיטות שונות של הכנת חומצות שומן היו יישומית1,7,9. באמצעות חומצת שומן מוכן כראוי/סרום אלבומין conjugates לחקור את ההשפעה של חומצות השומן על תפקוד מקרופאג יש חשיבות קריטית בקבלת נתונים משמעותיים מבחינה ביולוגית. מחקרים על ההשפעה של חומצות השומן על תפקוד מקרופאג יכול לספק ידע בסיסי פוטנציאלים טיפולית הנוגעים מטבוליזם חומצות שומן מעורב מקרופאג מחלות.

<table width="828">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:357px;height:20px;">CPX Ultrasonic Bath&#160;</td>
			<td style="width:208px;">Bransonic</td>
			<td style="width:153px;">Model 2800</td>
			<td style="width:111px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium palmitate (PA)</td>
			<td>Nu-Chek Prep, Inc.</td>
			<td>S-1109</td>
			<td>M.W. 278</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium stearate (SA)</td>
			<td>Nu-Chek Prep, Inc.</td>
			<td>S-1111</td>
			<td>M.W. 306</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine serum albumin (BSA), fatty acid-free</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mouse macrophage colony stimulating factor (mM-CSF)&#160;</td>
			<td>Cell Signaling Technology,&#160; Inc.</td>
			<td>5228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RPMI 1640</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>71002-878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Annexin V, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A13201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">7-AAD</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>559925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Monoclonal anti-ceramide antibody (mouse IgM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8104-50TST</td>
			<td>Clone: MID 15B4</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Goat Anti-Mouse IgM Antibody, &#181; chain, FITC conjugate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>AP128F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fixation buffer</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Permeabilization buffer</td>
			<td>Ebioscience</td>
			<td>4307693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Red Blood Cell Lysis Buffer&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11814389001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Annexin V Binding Buffer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>556454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L929 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Corning&#160;Cell Lifter&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:357px;height:21px;">Note: M.W. is for molecular weight.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

saturated fatty acids induce ceramide-associated macrophage cell death

מקרופאגים לבטא מאוד אפידרמיס חומצת שומן מחייב חלבון ואת אדיפוז חומצת שומן מחייב חלבון. הם באופן פעיל ספיגת רווי, חומצות שומן בלתי רוויות, אשר עשויים לשחק תפקיד קריטי בוויסות פונקציות החיסונית שלהם. מחקרים רבים הראו כי חומצות שומן שונות, רווי או במאי רוויים, בעלי השפעות שונות על צמיחת תאים ותפקוד. עם זאת, הגישות המשמש להכנת חומצת שומן משתנים, אשר עלול להוביל לתוצאות שאינן-פיזיולוגיים. אלבומין, נשאית הטבעי של חומצות שומן בדם היקפי יונקים, מומלצת ויוצרים את המספר המשלים מורכבים עם מלח הנתרן של חומצות שומן כדי לחקור פונקציה חומצת שומן בתאי יונקים, ובכך לחסוך הרעילות של חומצת שומן סבון. לפיכך, פשוט, מהיר יחסית חימום, sonicating שיטה שפותחה, המובאת כאן על היווצרות תרכיב חומצה BSA-שומן. אנו מתארים פרוטוקול באמצעות חומצות שומן רוויות, חומצות סטארית במיוחד כדי לגרום מוות תאי חמור ב העכבר מח נגזר מקרופאגים. נדגים בהמשך כי מות תאים הנוצרות על-ידי חומצות שומן רוויות קשורה באופן חיובי ceramide הסלולר שהצטברו רמות. בשיטה זו ניתן להרחיב ללימודי ההשפעה של חומצות השומן בתאי יונקים אחרים.

השמנת יתר מגדילה את ריכוז חומצות השומן החופשיות בנסיוב. כמו המקצועי phagocytes, מקרופאגים פעיל לקחת את חומצות השומן כדי לשמור על הומאוסטזיס המארח. במהלך תהליכים אלה, ליפידים עומס יתר עלול לגרום מוות תאי מקרופאג. לשם כך, אנו תרבותי BMDMs במבחנה עם רמות מהשמנת יתר של חומצות שו?...

Watch this Scientific Journal Video about Saturated Fatty Acids Induce Ceramide-associated Macrophage Cell Death at JoVE.com

Saturated Fatty Acids Induce Ceramide-associated Macrophage Cell Death

אנחנו להמחיש שיטה ישר קדימה כדי להפיק מאתר ראשי מקרופאגים מתאי מח עצם, שיטה פשוטה להכנת BSA-חומצות conjugates. ואז נדגים כי חומצות שומן רוויות יכול לגרום מוות תאי מקרופאג, כגון מוות של תאים קשורה באופן חיובי הסלולר הצטברות ceramide רמות.

חומצות שומן רוויות לגרום מוות תאי מקרופאג Ceramide-הקשורים

Macrophages highly express epidermal fatty acid-binding protein and adipose fatty acid-binding protein. They actively uptake saturated and unsaturated ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

שיטות להעריך מתווכת בטא מוות של תאים על ידי לימפוציטים מסוג T ציטוטוקסיות

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

חקירה של קיטוב Macrophage שימוש המקרופאגים נגזרים מח עצם

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

Determination of Tolerable Fatty Acids and Cholera Toxin Concentrations Using Human Intestinal Epithelial Cells and BALB/c Mouse Macrophages

נחישות של חומצות שומן נסבלות וריכוזי רעלן הכולרה שימוש בתאי אפיתל במעי אדם ומקרופאגים עכבר BALB / ג

The positive role of fatty acids in the prevention and alleviation of non-human and  human diseases have been and continue to be extensively documented. ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

מח עצם נגזרות Macrophage הפקה

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

להמחיש מלכודות חוץ-תאי מקרופאג באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

זיהוי של Inflammasome ההפעלה ומוות תא Pyroptotic של מקרופאגים הנגזרות מח עצם מאתר

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

An Immunohistopathologic Study to Profile the Folate Receptor Beta Macrophage and Vascular Immune Microenvironment in Giant Cell Arteritis

מחקר Immunohistopathologic פרופיל חומצה פולית קולטן בטא מקרופאג של כלי הדם Microenvironment המערכת החיסונית ב Arteritis תא ענק

Giant cell arteritis (GCA) is a chronic immune-mediated disease of medium-to-large sized arteries that affects older adults. GCA manifests with arthritis ...

Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment

Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment

עיבוד של ברונמכתשיים נוזלים ומתאימים דם עבור מכתשיים מקרופאג ו CD4+ T-Cell Immunophenotyping קלדה ומאגר HIV הערכה

Bronchoscopy is a medical procedure whereby normal saline is injected into the lungs via a bronchoscope and then suction is applied, removing ...

Visualization of Macrophage Lytic Cell Death During Mycobacterial Infection in Zebrafish Embryos via Intravital Microscopy

ויזואליזציה של מקרופאג Lytic תא המוות במהלך זיהום פטרת העוברים באמצעות מיקרוסקופ אינטרטל

Zebrafish is an excellent model organism for studying innate immune cell behavior due to its transparent nature and reliance solely on its innate immune ...