Name: saturated fatty acids induce ceramide-associated macrophage cell death
Uploaded: 2017-10-31T15:00:00
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Questo lavoro è stato sostenuto parzialmente dai fondi di Start-up Università di Louisville e National Cancer Institute (Bethesda, MD) concede R01CA177679, R01CA180986.

il protocollo è stato approvato dalla istituzionale Animal Care and uso Committee (IACUC) della University of Louisville.
 1. macrofagi derivati del midollo osseo di topo (BMDMs) <ol><li>Euthanize un mouse di tipo selvaggio a 8-week-old 6, sano usando CO 2. Aggiungerla a un bordo della gomma piuma e spruzzarlo con etanolo al 70%, fino a quando è bagnato. Togliere le ossa tibia/femore con pinze e le forbici. Metterli in una capsula di Petri con 5 mL 1 x tampone fosfato salino (P...

<ol>
	<li>Martins de Lima, T., Cury-Boaventura, M. F., Giannocco, G., Nunes, M. T., Curi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+toxicity+of+fatty+acids+on+a+macrophage+cell+line+(J774).">Comparative toxicity of fatty acids on a macrophage cell line (J774).</a> Clin Sci (Lond). 111 (5), 307-317 (2006).</li><li>Simard, J. R., Zunszain, P. A., Hamilton, J. A., Curry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location+of+high+and+low+affinity+fatty+acid+binding+sites+on+human+serum+albumin+revealed+by+NMR+drug-competition+analysis.">Location of high and low affinity fatty acid binding sites on human serum albumin revealed by NMR drug-competition analysis.</a> J Mol Biol. 361 (2), 336-351 (2006).</li><li>Penn, A. H., Dubick, M. A., Torres Filho, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+Acid+Saturation+of+Albumin+Used+in+Resuscitation+Fluids+Modulates+Cell+Damage+in+Shock:+In+Vitro+Results+Using+a+Novel+Technique+to+Measure+Fatty+Acid+Binding+Capacity.">Fatty Acid Saturation of Albumin Used in Resuscitation Fluids Modulates Cell Damage in Shock: In Vitro Results Using a Novel Technique to Measure Fatty Acid Binding Capacity.</a> Shock. , (2017).</li><li>Vusse, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Albumin+as+fatty+acid+transporter.">Albumin as fatty acid transporter.</a> Drug Metab Pharmacokinet. 24 (4), 300-307 (2009).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+Fatty+Acid+Binding+Protein+Promotes+Saturated+Fatty+Acid-Induced+Macrophage+Cell+Death+through+Enhancing+Ceramide+Production.">Adipose Fatty Acid Binding Protein Promotes Saturated Fatty Acid-Induced Macrophage Cell Death through Enhancing Ceramide Production.</a> J Immunol. 198 (2), 798-807 (2017).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+Fatty+Acid+binding+protein+promotes+skin+inflammation+induced+by+high-fat+diet.">Epidermal Fatty Acid binding protein promotes skin inflammation induced by high-fat diet.</a> Immunity. 42 (5), 953-964 (2015).</li><li>Wen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid-induced+NLRP3-ASC+inflammasome+activation+interferes+with+insulin+signaling.">Fatty acid-induced NLRP3-ASC inflammasome activation interferes with insulin signaling.</a> Nat Immunol. 12 (5), 408-415 (2011).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid-binding+protein+E-FABP+restricts+tumor+growth+by+promoting+IFN-beta+responses+in+tumor-associated+macrophages.">Fatty acid-binding protein E-FABP restricts tumor growth by promoting IFN-beta responses in tumor-associated macrophages.</a> Cancer Res. 74 (11), 2986-2998 (2014).</li><li>Ulloth, J. E., Casiano, C. A., De Leon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitic+and+stearic+fatty+acids+induce+caspase-dependent+and+-independent+cell+death+in+nerve+growth+factor+differentiated+PC12+cells.">Palmitic and stearic fatty acids induce caspase-dependent and -independent cell death in nerve growth factor differentiated PC12 cells.</a> J Neurochem. 84 (4), 655-668 (2003).</li><li>Weischenfeldt, J., Porse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+Marrow-Derived+Macrophages+(BMM):+Isolation+and+Applications.">Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications.</a> CSH Protoc. , (2008).</li><li>Dansen, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-affinity+binding+of+very-long-chain+fatty+acyl-CoA+esters+to+the+peroxisomal+non-specific+lipid-transfer+protein+(sterol+carrier+protein-2).">High-affinity binding of very-long-chain fatty acyl-CoA esters to the peroxisomal non-specific lipid-transfer protein (sterol carrier protein-2).</a> Biochem J. 339 (Pt 1), 193-199 (1999).</li><li>Ulloth, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+methyl-beta-cyclodextrin+toxicity+in+NGF-differentiated+PC12+cell+death.">Characterization of methyl-beta-cyclodextrin toxicity in NGF-differentiated PC12 cell death.</a> Neurotoxicology. 28 (3), 613-621 (2007).</li></ol>

La corretta preparazione della soluzione di acido grasso è di importanza critica per studiare la funzione biologica degli acidi grassi. La neutralizzazione degli acidi grassi aumenta la relativa solubilità in soluzione acquosa. Tuttavia, sali di sodio degli acidi grassi, soprattutto acidi grassi saturi, sono ancora di bassa solubilità in acqua o PBS, come abbiamo osservato. Un metodo consiste nell'utilizzare etanolo al 95-100% per aiutare a sciogliere l'acido grasso1. Utilizzando questo metodo,...

Acidi grassi svolgono un ruolo critico nel metabolismo energetico e nella sintesi dei fosfolipidi di membrana in diversi tipi di cellule. Gli acidi grassi hanno una bassa solubilità in acqua. Una preparazione adeguata degli acidi grassi è di importanza critica per studiare le funzioni biologiche degli acidi grassi nelle cellule dei mammiferi. Quando gli acidi grassi sono preparati con etanolo, molti acidi grassi può mostrare il loro effetto tossico sapone (detersivo) sulla membrana cellulare, anche a concentrazioni relativamente basse1. Come un trasportatore naturale, importante per gli acidi grassi liberi nel siero, l'albumina di siero è considerato un buon vettore per acido grasso consegna in vitro per acido grasso funzione analisi2,3,4. Tuttavia, i dettagli della preparazione del coniugato dell'acido grasso e albumina del siero non sono solitamente disponibili anche se sono stati pubblicati molti articoli di ricerca utilizzando gli acidi grassi.
I macrofagi esprimono altamente epidermica dell'acido grasso-proteina e adiposo dell'acido grasso-legante della proteina5,6,7,8. Essi attivamente l'assorbimento saturata e acidi grassi insaturi che possono regolare le loro funzioni immuni. Per studiare l'impatto degli acidi grassi sui macrofagi e altre cellule, diversi metodi di preparazione dell'acido grasso sono stati applicati1,7,9. Usando opportunamente preparato acido grasso/siero albumina coniugati per studiare l'impatto degli acidi grassi sulla funzione del macrofago è di importanza critica nell'ottenere dati biologicamente significativi. Studi sull'impatto degli acidi grassi sulla funzione del macrofago possono fornire conoscenze di base e potenziali bersagli terapeutici relativi al metabolismo dell'acido grasso nelle malattie del macrofago-coinvolti.

<table width="828">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:357px;height:20px;">CPX Ultrasonic Bath&#160;</td>
			<td style="width:208px;">Bransonic</td>
			<td style="width:153px;">Model 2800</td>
			<td style="width:111px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium palmitate (PA)</td>
			<td>Nu-Chek Prep, Inc.</td>
			<td>S-1109</td>
			<td>M.W. 278</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium stearate (SA)</td>
			<td>Nu-Chek Prep, Inc.</td>
			<td>S-1111</td>
			<td>M.W. 306</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine serum albumin (BSA), fatty acid-free</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mouse macrophage colony stimulating factor (mM-CSF)&#160;</td>
			<td>Cell Signaling Technology,&#160; Inc.</td>
			<td>5228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RPMI 1640</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>71002-878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Annexin V, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A13201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">7-AAD</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>559925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Monoclonal anti-ceramide antibody (mouse IgM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8104-50TST</td>
			<td>Clone: MID 15B4</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Goat Anti-Mouse IgM Antibody, &#181; chain, FITC conjugate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>AP128F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fixation buffer</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Permeabilization buffer</td>
			<td>Ebioscience</td>
			<td>4307693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Red Blood Cell Lysis Buffer&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11814389001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Annexin V Binding Buffer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>556454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L929 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Corning&#160;Cell Lifter&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:357px;height:21px;">Note: M.W. is for molecular weight.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

saturated fatty acids induce ceramide-associated macrophage cell death

I macrofagi esprimono altamente epidermica dell'acido grasso-proteina e proteina-acido grasso adiposa. Essi attivamente l'assorbimento saturata e acidi grassi insaturi, che potrebbe giocare un ruolo critico nella regolazione della loro funzioni immuni. Numerosi studi hanno dimostrato che vari acidi grassi, saturi o insaturi, può possedere diversi impatti sulla crescita delle cellule e la funzione. Tuttavia, gli approcci utilizzati per la preparazione dell'acido grasso variano, che può portare a risultati non-fisiologica. Albumina, un vettore naturale per gli acidi grassi nel sangue periferico dei mammiferi, è consigliabile per la formazione di un coniugato complesso con il sale di sodio degli acidi grassi per studiare la funzione dell'acido grasso in cellule di mammifero, riducendo così al minimo la tossicità dell'acido grasso sapone. Così, un semplice, relativamente rapido riscaldamento e sonicating metodo è sviluppato e presentato qui per la formazione di coniugato acido grasso-BSA. Descriviamo un protocollo utilizzando acidi grassi saturi, soprattutto gli acidi stearico di indurre morte cellulare severa nei macrofagi derivato del midollo osseo del topo. Noi dimostrare ulteriormente che la morte cellulare indotta da acido grasso saturo è associata positivamente con ceramide cellulare accumulato livelli. Questo metodo può essere esteso per lo studio dell'impatto dell'acido grasso sulle altre cellule di mammiferi.

L'obesità aumenta le concentrazioni di acidi grassi liberi nel siero. Come fagociti professionali, macrofagi prendono attivamente gli acidi grassi per mantenere l'omeostasi host. Durante questi processi, Overload lipidi possono indurre la morte delle cellule del macrofago. A tal fine, abbiamo coltivato BMDMs in vitro con obesi livelli di acidi grassi dietetici e morte delle cellule del macrofago misurato usando flusso cytometric macchiatura. Rispetto al controllo di BSA, acidi g...

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Saturated Fatty Acids Induce Ceramide-associated Macrophage Cell Death

Un metodo semplice per preparare BSA-degli acidi grassi coniugati e illustriamo un metodo semplice per derivare macrofagi murini primari da cellule del midollo osseo. Allora dimostriamo che gli acidi grassi saturi può indurre la morte delle cellule del macrofago, e tale morte delle cellule è associato positivamente con accumulo cellulare di ceramide livelli.

Acidi grassi saturi indurre la morte delle cellule del macrofago Ceramide-collegato

Macrophages highly express epidermal fatty acid-binding protein and adipose fatty acid-binding protein. They actively uptake saturated and unsaturated ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Metodi per valutare la morte delle cellule beta Mediata da linfociti T citotossici

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

Indagine di polarizzazione dei macrofagi Utilizzando Bone Marrow macrofagi derivati

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

Determination of Tolerable Fatty Acids and Cholera Toxin Concentrations Using Human Intestinal Epithelial Cells and BALB/c Mouse Macrophages

Determinazione degli acidi grassi tollerabile e Concentrazioni tossina colerica Uso Umano cellule epiteliali intestinali e BALB / c macrofagi del mouse

The positive role of fatty acids in the prevention and alleviation of non-human and  human diseases have been and continue to be extensively documented. ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Derivate dal midollo osseo macrofagi Production

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Visualizzazione del macrofago trappole extracellulari mediante microscopia confocale

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Rilevamento di attivazione Inflammasome e morte delle cellule Pyroptotic in macrofagi murini derivate da midollo osseo

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

An Immunohistopathologic Study to Profile the Folate Receptor Beta Macrophage and Vascular Immune Microenvironment in Giant Cell Arteritis

Uno studio di Immunohistopathologic per profilare il folato recettore Beta macrofago e microambiente vascolare immuni nella arterite a cellule giganti

Giant cell arteritis (GCA) is a chronic immune-mediated disease of medium-to-large sized arteries that affects older adults. GCA manifests with arthritis ...

Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment

Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment

Trattamento del bronchoalveolar Lavage Fluid e del sangue abbinato per il macrofago alveoere e CD4- Immunofenotyping a cellule T e valutazione del serbatoio dell'HIV

Bronchoscopy is a medical procedure whereby normal saline is injected into the lungs via a bronchoscope and then suction is applied, removing ...

Visualization of Macrophage Lytic Cell Death During Mycobacterial Infection in Zebrafish Embryos via Intravital Microscopy

Visualizzazione della morte delle cellule litiche macrofaschi durante l'infezione micobatterica negli embrioni di pesce zebra tramite la microscopia intravitale

Zebrafish is an excellent model organism for studying innate immune cell behavior due to its transparent nature and reliance solely on its innate immune ...