Name: saturated fatty acids induce ceramide-associated macrophage cell death
Uploaded: 2017-10-31T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Saturated Fatty Acids Induce Ceramide-associated Macrophage Cell Death at JoVE.com

Dette arbeidet ble delvis støttet av universitetet i Louisville oppstart midlene og National Cancer Institute (Bethesda, MD) gir R01CA177679, R01CA180986.

protokollen ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) på Universitetet i Louisville.
 1. musen benmarg avledet makrofager (BMDMs) <ol><li>Euthanize en 6 - til 8-uke-gamle, sunn vill-type mus ved hjelp av CO 2. Feste det til et skum bord og spray den med 70% etanol før det er gjennomvåt. Fjerne tibia/femur Ben med tang og saks. Legg dem i en Petriskål med 5 mL 1 x fosfat-bufret saltvann (PBS). Utfører alle prosedyrer under sterile forhold.</li>
	<l...

<ol>
	<li>Martins de Lima, T., Cury-Boaventura, M. F., Giannocco, G., Nunes, M. T., Curi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+toxicity+of+fatty+acids+on+a+macrophage+cell+line+(J774).">Comparative toxicity of fatty acids on a macrophage cell line (J774).</a> Clin Sci (Lond). 111 (5), 307-317 (2006).</li><li>Simard, J. R., Zunszain, P. A., Hamilton, J. A., Curry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location+of+high+and+low+affinity+fatty+acid+binding+sites+on+human+serum+albumin+revealed+by+NMR+drug-competition+analysis.">Location of high and low affinity fatty acid binding sites on human serum albumin revealed by NMR drug-competition analysis.</a> J Mol Biol. 361 (2), 336-351 (2006).</li><li>Penn, A. H., Dubick, M. A., Torres Filho, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+Acid+Saturation+of+Albumin+Used+in+Resuscitation+Fluids+Modulates+Cell+Damage+in+Shock:+In+Vitro+Results+Using+a+Novel+Technique+to+Measure+Fatty+Acid+Binding+Capacity.">Fatty Acid Saturation of Albumin Used in Resuscitation Fluids Modulates Cell Damage in Shock: In Vitro Results Using a Novel Technique to Measure Fatty Acid Binding Capacity.</a> Shock. , (2017).</li><li>Vusse, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Albumin+as+fatty+acid+transporter.">Albumin as fatty acid transporter.</a> Drug Metab Pharmacokinet. 24 (4), 300-307 (2009).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+Fatty+Acid+Binding+Protein+Promotes+Saturated+Fatty+Acid-Induced+Macrophage+Cell+Death+through+Enhancing+Ceramide+Production.">Adipose Fatty Acid Binding Protein Promotes Saturated Fatty Acid-Induced Macrophage Cell Death through Enhancing Ceramide Production.</a> J Immunol. 198 (2), 798-807 (2017).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+Fatty+Acid+binding+protein+promotes+skin+inflammation+induced+by+high-fat+diet.">Epidermal Fatty Acid binding protein promotes skin inflammation induced by high-fat diet.</a> Immunity. 42 (5), 953-964 (2015).</li><li>Wen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid-induced+NLRP3-ASC+inflammasome+activation+interferes+with+insulin+signaling.">Fatty acid-induced NLRP3-ASC inflammasome activation interferes with insulin signaling.</a> Nat Immunol. 12 (5), 408-415 (2011).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid-binding+protein+E-FABP+restricts+tumor+growth+by+promoting+IFN-beta+responses+in+tumor-associated+macrophages.">Fatty acid-binding protein E-FABP restricts tumor growth by promoting IFN-beta responses in tumor-associated macrophages.</a> Cancer Res. 74 (11), 2986-2998 (2014).</li><li>Ulloth, J. E., Casiano, C. A., De Leon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitic+and+stearic+fatty+acids+induce+caspase-dependent+and+-independent+cell+death+in+nerve+growth+factor+differentiated+PC12+cells.">Palmitic and stearic fatty acids induce caspase-dependent and -independent cell death in nerve growth factor differentiated PC12 cells.</a> J Neurochem. 84 (4), 655-668 (2003).</li><li>Weischenfeldt, J., Porse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+Marrow-Derived+Macrophages+(BMM):+Isolation+and+Applications.">Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications.</a> CSH Protoc. , (2008).</li><li>Dansen, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-affinity+binding+of+very-long-chain+fatty+acyl-CoA+esters+to+the+peroxisomal+non-specific+lipid-transfer+protein+(sterol+carrier+protein-2).">High-affinity binding of very-long-chain fatty acyl-CoA esters to the peroxisomal non-specific lipid-transfer protein (sterol carrier protein-2).</a> Biochem J. 339 (Pt 1), 193-199 (1999).</li><li>Ulloth, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+methyl-beta-cyclodextrin+toxicity+in+NGF-differentiated+PC12+cell+death.">Characterization of methyl-beta-cyclodextrin toxicity in NGF-differentiated PC12 cell death.</a> Neurotoxicology. 28 (3), 613-621 (2007).</li></ol>

Riktig utarbeidelse av fettsyre løsning er av avgjørende betydning å studere biologiske funksjonen av fettsyrer. Nøytralisering av fettsyrer øker løselighet i vandig løsning. Natrium salter av fettsyrer, spesielt mettede fettsyrer, er imidlertid fortsatt av lav oppløselighet i vann eller PBS vi observert. En metode er å bruke 95-100% etanol til å oppløse fettsyrer1. Bruker denne metoden, kan høyere toksisitet celler sees selv i lave konsentrasjoner for mindre giftige umettede fettsyrer...

Fettsyrer spille en avgjørende rolle i energi metabolisme og syntese av membran fosfolipider i forskjellige celler. Fettsyrer har en lav vandig oppløselighet. Aktuelle utarbeidelse av fettsyre er av avgjørende betydning for å studere biologiske funksjoner av fettsyrer i pattedyrceller. Når fettsyrer er forberedt med etanol, kan mange fettsyrer viser deres giftige såpe (vaskemiddel) effekt på cellemembranen, selv i relativt lave konsentrasjoner1. Som en naturlig, store transporter for frie fettsyrer i serum, serum albumin er ansett som en god transportør for fettsyrer levering i vitro fettsyrer funksjonen analyser2,3,4. Detaljer om utarbeidelse av fettsyre og serum albumin konjugert er imidlertid vanligvis ikke tilgjengelig selv om mange oppgaver ved hjelp av fettsyrer har blitt publisert.
Makrofager uttrykke svært epidermal fettsyrer-bindende protein og adipose fettsyrer-bindende protein5,6,7,8. De aktivt opptak mettet og umettede fettsyrer som kan regulere deres immun funksjoner. For å studere virkningen av fettsyrer makrofager og andre celler, var forskjellige metoder for fettsyrer forberedelse anvendt1,7,9. Bruke riktig forberedt fettsyrer/serum albumin conjugates for å undersøke virkningen av fettsyrer på macrophage funksjon er av avgjørende betydning i å skaffe biologisk meningsfull data. Studier av effekten av fettsyrer på macrophage funksjon kan gi grunnleggende kunnskaper og potensielle terapeutiske mål knyttet til metabolismen av fettsyrer i macrophage-involvert sykdommer.

<table width="828">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:357px;height:20px;">CPX Ultrasonic Bath&#160;</td>
			<td style="width:208px;">Bransonic</td>
			<td style="width:153px;">Model 2800</td>
			<td style="width:111px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium palmitate (PA)</td>
			<td>Nu-Chek Prep, Inc.</td>
			<td>S-1109</td>
			<td>M.W. 278</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium stearate (SA)</td>
			<td>Nu-Chek Prep, Inc.</td>
			<td>S-1111</td>
			<td>M.W. 306</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine serum albumin (BSA), fatty acid-free</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mouse macrophage colony stimulating factor (mM-CSF)&#160;</td>
			<td>Cell Signaling Technology,&#160; Inc.</td>
			<td>5228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RPMI 1640</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>71002-878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Annexin V, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A13201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">7-AAD</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>559925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Monoclonal anti-ceramide antibody (mouse IgM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8104-50TST</td>
			<td>Clone: MID 15B4</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Goat Anti-Mouse IgM Antibody, &#181; chain, FITC conjugate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>AP128F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fixation buffer</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Permeabilization buffer</td>
			<td>Ebioscience</td>
			<td>4307693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Red Blood Cell Lysis Buffer&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11814389001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Annexin V Binding Buffer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>556454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L929 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Corning&#160;Cell Lifter&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:357px;height:21px;">Note: M.W. is for molecular weight.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

saturated fatty acids induce ceramide-associated macrophage cell death

Makrofager uttrykke svært epidermal fettsyrer-bindende protein og adipose fettsyrer-bindende protein. De aktivt opptak mettet og umettede fettsyrer, som kan spille en avgjørende rolle i å regulere deres immun funksjoner. Mange studier har vist at ulike fettsyrer, mettet eller umettede, kan ha ulike virkninger på cellevekst og funksjon. Men varierer tilnærmingene brukt for fettsyrer forberedelse, som kan føre til ikke-fysiologiske resultater. Serum albumin, en naturlig operatør for fettsyrer i pattedyr perifert blod, anbefales for å danne en konjugert med salt natrium fatty syren å studere fettsyrer funksjon i pattedyrceller, således minimere toksisitet av fettsyrer såpe. Dermed er en enkel, relativt rask oppvarming og sonicating metoden utviklet og presenteres her for BSA fatty acid konjugat formasjonen. Vi beskriver en protokoll som mettede fettsyrer, spesielt sted syren å indusere alvorlig celledød i musen benmarg avledet makrofager. Videre viser vi at mettede fettsyrer-indusert celledød er positivt assosiert med akkumulert mobilnettet ceramide nivåer. Denne metoden kan utvides for studier av effekten av fettsyrer på andre pattedyrceller.

Fedme øker frie fettsyrer konsentrasjonene i serum. Som profesjonell phagocytes tar makrofager aktivt opp fatty syren å opprettholde vert homeostase. Under disse prosessene, kan overbelastet lipider indusere macrophage celledød. Dette kultivert vi BMDMs i vitro med overvektige kosttilskudd fettsyrer og målt macrophage celledød bruker flyt cytometric flekker. Sammenlignet med kontrollen BSA, mettede fettsyrer, indusert spesielt sted syrer, betydelig celledød BMDMs. døde cel...

Watch this Scientific Journal Video about Saturated Fatty Acids Induce Ceramide-associated Macrophage Cell Death at JoVE.com

Saturated Fatty Acids Induce Ceramide-associated Macrophage Cell Death

Vi illustrerer en rett fram metode til å utlede murine primære makrofager fra benmargen celler og en enkel metode å forberede BSA-fettsyrer conjugates. Deretter viser vi at mettede fettsyrer kan indusere macrophage celledød, og slike celledød er positivt assosiert med mobilnettet akkumulering av ceramide nivåer.

Mettede fettsyrer indusere celledød Ceramide-assosiert Macrophage

Macrophages highly express epidermal fatty acid-binding protein and adipose fatty acid-binding protein. They actively uptake saturated and unsaturated ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

Undersøkelse av Macrophage Polarisering Bruk Bone Marrow makrofager som stammer

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

Determination of Tolerable Fatty Acids and Cholera Toxin Concentrations Using Human Intestinal Epithelial Cells and BALB/c Mouse Macrophages

Fastsettelse av tolerable fettsyrer og koleratoksin Konsentrasjoner med humane Intestinal Epitelceller og BALB / c mus makrofager

The positive role of fatty acids in the prevention and alleviation of non-human and  human diseases have been and continue to be extensively documented. ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Bone Marrow-avledet Macrophage Produksjon

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Visualisere Macrophage ekstracellulære feller bruker AC Confocal mikroskopi

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Deteksjon av Inflammasome aktivisering og Pyroptotic celle død i Murine Ben margtransplantasjon-avledet makrofager

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

An Immunohistopathologic Study to Profile the Folate Receptor Beta Macrophage and Vascular Immune Microenvironment in Giant Cell Arteritis

En Immunohistopathologic studie til folat reseptor Beta Macrophage og vaskulær immun Microenvironment i gigantiske celle arteritt

Giant cell arteritis (GCA) is a chronic immune-mediated disease of medium-to-large sized arteries that affects older adults. GCA manifests with arthritis ...

Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment

Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment

Behandling av lunges tømming Fluid og matchet Blood for Alveolære macrophage og CD4+ T-Cell IMMUNFENOTYPING og HIV Reservoir Assessment

Bronchoscopy is a medical procedure whereby normal saline is injected into the lungs via a bronchoscope and then suction is applied, removing ...

Visualization of Macrophage Lytic Cell Death During Mycobacterial Infection in Zebrafish Embryos via Intravital Microscopy

Visualisering av macrophage lytisk Cell Death under Mykobakterieinfeksjoner infeksjon i sebrafisk embryo via Intravital mikroskopi

Zebrafish is an excellent model organism for studying innate immune cell behavior due to its transparent nature and reliance solely on its innate immune ...