Name: saturated fatty acids induce ceramide-associated macrophage cell death
Uploaded: 2017-10-31T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Saturated Fatty Acids Induce Ceramide-associated Macrophage Cell Death at JoVE.com

Detta arbete var stöds delvis av University of Louisville start-up fonderna och National Cancer Institute (Bethesda, MD) beviljar R01CA177679, R01CA180986.

protokollet godkändes av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) av University of Louisville.
 1. mus benmärgen härrör makrofager (BMDMs) <ol><li>Euthanize en 6-8 vecka-gamla, friska vilda typ mus använda CO 2. Fästa den ner till en skum ombord och spraya den med 70% etanol tills den är blöt. Ta bort tibia/lårbenet ben med pincett och sax. Lägg dem i en petriskål med 5 mL 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Utför alla procedurer under steri...

<ol>
	<li>Martins de Lima, T., Cury-Boaventura, M. F., Giannocco, G., Nunes, M. T., Curi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+toxicity+of+fatty+acids+on+a+macrophage+cell+line+(J774).">Comparative toxicity of fatty acids on a macrophage cell line (J774).</a> Clin Sci (Lond). 111 (5), 307-317 (2006).</li><li>Simard, J. R., Zunszain, P. A., Hamilton, J. A., Curry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location+of+high+and+low+affinity+fatty+acid+binding+sites+on+human+serum+albumin+revealed+by+NMR+drug-competition+analysis.">Location of high and low affinity fatty acid binding sites on human serum albumin revealed by NMR drug-competition analysis.</a> J Mol Biol. 361 (2), 336-351 (2006).</li><li>Penn, A. H., Dubick, M. A., Torres Filho, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+Acid+Saturation+of+Albumin+Used+in+Resuscitation+Fluids+Modulates+Cell+Damage+in+Shock:+In+Vitro+Results+Using+a+Novel+Technique+to+Measure+Fatty+Acid+Binding+Capacity.">Fatty Acid Saturation of Albumin Used in Resuscitation Fluids Modulates Cell Damage in Shock: In Vitro Results Using a Novel Technique to Measure Fatty Acid Binding Capacity.</a> Shock. , (2017).</li><li>Vusse, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Albumin+as+fatty+acid+transporter.">Albumin as fatty acid transporter.</a> Drug Metab Pharmacokinet. 24 (4), 300-307 (2009).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+Fatty+Acid+Binding+Protein+Promotes+Saturated+Fatty+Acid-Induced+Macrophage+Cell+Death+through+Enhancing+Ceramide+Production.">Adipose Fatty Acid Binding Protein Promotes Saturated Fatty Acid-Induced Macrophage Cell Death through Enhancing Ceramide Production.</a> J Immunol. 198 (2), 798-807 (2017).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+Fatty+Acid+binding+protein+promotes+skin+inflammation+induced+by+high-fat+diet.">Epidermal Fatty Acid binding protein promotes skin inflammation induced by high-fat diet.</a> Immunity. 42 (5), 953-964 (2015).</li><li>Wen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid-induced+NLRP3-ASC+inflammasome+activation+interferes+with+insulin+signaling.">Fatty acid-induced NLRP3-ASC inflammasome activation interferes with insulin signaling.</a> Nat Immunol. 12 (5), 408-415 (2011).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid-binding+protein+E-FABP+restricts+tumor+growth+by+promoting+IFN-beta+responses+in+tumor-associated+macrophages.">Fatty acid-binding protein E-FABP restricts tumor growth by promoting IFN-beta responses in tumor-associated macrophages.</a> Cancer Res. 74 (11), 2986-2998 (2014).</li><li>Ulloth, J. E., Casiano, C. A., De Leon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitic+and+stearic+fatty+acids+induce+caspase-dependent+and+-independent+cell+death+in+nerve+growth+factor+differentiated+PC12+cells.">Palmitic and stearic fatty acids induce caspase-dependent and -independent cell death in nerve growth factor differentiated PC12 cells.</a> J Neurochem. 84 (4), 655-668 (2003).</li><li>Weischenfeldt, J., Porse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+Marrow-Derived+Macrophages+(BMM):+Isolation+and+Applications.">Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications.</a> CSH Protoc. , (2008).</li><li>Dansen, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-affinity+binding+of+very-long-chain+fatty+acyl-CoA+esters+to+the+peroxisomal+non-specific+lipid-transfer+protein+(sterol+carrier+protein-2).">High-affinity binding of very-long-chain fatty acyl-CoA esters to the peroxisomal non-specific lipid-transfer protein (sterol carrier protein-2).</a> Biochem J. 339 (Pt 1), 193-199 (1999).</li><li>Ulloth, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+methyl-beta-cyclodextrin+toxicity+in+NGF-differentiated+PC12+cell+death.">Characterization of methyl-beta-cyclodextrin toxicity in NGF-differentiated PC12 cell death.</a> Neurotoxicology. 28 (3), 613-621 (2007).</li></ol>

Korrekt beredning av fettsyra lösning är av avgörande betydelse att studera den biologiska funktionen av fettsyror. Neutralisering av fettsyra ökar dess löslighet i vattenlösning. Natriumsalter av fettsyror, särskilt mättade fettsyror, är dock fortfarande av låg löslighet i vatten eller PBS som vi observerade. En metod är att använda 95-100% etanol för att upplösa fettsyra1. Med den här metoden kan högre toxicitet för celler observeras även vid lägre koncentrationer för mindre...

Fettsyror spelar en avgörande roll i energiomsättningen och i syntesen av fosfolipidmembran i olika typer av celler. Fettsyror har en låg vattenlöslighet. Lämplig preparering av fettsyra är av avgörande betydelse för att studera de biologiska funktionerna av fettsyror i däggdjursceller. När fettsyror är beredda med etanol, kan många fettsyror Visa deras giftiga tvål (tvättmedel) effekt på cellmembranet, även vid relativt låga koncentrationer1. Som en naturlig, större transportör för fria fettsyror i serum anses serum albumin vara en bra bärare för fettsyra leverans i vitro för fettsyra funktion analyser2,3,4. Men är detaljerna i utarbetandet av fettsyra och serumalbumin konjugat oftast inte tillgänglig trots att många forskningsrapporter med fettsyror har publicerats.
Makrofager uttrycker mycket epidermal fettsyra-bindande protein och fett fettsyra-bindande protein5,6,7,8. De aktivt upptag mättade och omättade fettsyror som kan reglera deras immunförsvar fungerar. För att studera effekterna av fettsyror på makrofager och andra celler, var olika metoder för fettsyra beredning tillämpad1,7,9. Använda lämpligt beredda fettsyra/serum albumin konjugat för att undersöka effekterna av fettsyror på makrofag funktion är av avgörande betydelse att få biologiskt meningsfulla data. Studier om effekterna av fettsyror på makrofag funktion kan ge grundläggande kunskaper och potentiella terapeutiska mål avseende fettsyra metabolism i makrofag-inblandade sjukdomar.

<table width="828">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:357px;height:20px;">CPX Ultrasonic Bath&#160;</td>
			<td style="width:208px;">Bransonic</td>
			<td style="width:153px;">Model 2800</td>
			<td style="width:111px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium palmitate (PA)</td>
			<td>Nu-Chek Prep, Inc.</td>
			<td>S-1109</td>
			<td>M.W. 278</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium stearate (SA)</td>
			<td>Nu-Chek Prep, Inc.</td>
			<td>S-1111</td>
			<td>M.W. 306</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine serum albumin (BSA), fatty acid-free</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mouse macrophage colony stimulating factor (mM-CSF)&#160;</td>
			<td>Cell Signaling Technology,&#160; Inc.</td>
			<td>5228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RPMI 1640</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>71002-878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Annexin V, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A13201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">7-AAD</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>559925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Monoclonal anti-ceramide antibody (mouse IgM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8104-50TST</td>
			<td>Clone: MID 15B4</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Goat Anti-Mouse IgM Antibody, &#181; chain, FITC conjugate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>AP128F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fixation buffer</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Permeabilization buffer</td>
			<td>Ebioscience</td>
			<td>4307693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Red Blood Cell Lysis Buffer&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11814389001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Annexin V Binding Buffer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>556454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L929 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Corning&#160;Cell Lifter&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:357px;height:21px;">Note: M.W. is for molecular weight.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

saturated fatty acids induce ceramide-associated macrophage cell death

Makrofager uttrycker mycket epidermal fettsyra-bindande protein och fett fettsyra-bindande protein. De aktivt upptag mättade och omättade fettsyror, som kan spela en avgörande roll i regleringen av deras immun funktioner. Många studier har visat att olika fettsyror, mättade eller omättade, kan ha olika effekt på cellernas tillväxt och funktion. Metoder som används för fettsyra förberedelse varierar dock, vilket kan leda till icke-fysiologiskt resultat. Serumalbumin, en naturlig bärare för fettsyror i däggdjur perifert blod, rekommenderas för att bilda ett konjugat komplex med natriumsaltet av fettsyror att studera fettsyra funktion i däggdjursceller, sålunda minimizing toxiciteten av fettsyra tvål. Således, en enkel, relativt snabb uppvärmning och sonicating metod utvecklas och presenteras här för BSA-fatty acid konjugat bildandet. Vi beskriver ett protokoll med mättade fettsyror, särskilt stearinsyra syror att inducera allvarliga celldöd i mus benmärg härrör makrofager. Vi visar vidare att mättade fettsyror-inducerad celldöd är positivt associerade med ackumulerade cellulära ceramid nivåerna. Denna metod kan förlängas för studier av effekterna av fettsyra på andra däggdjursceller.

Fetma ökar koncentrationerna av fria fettsyror i serum. Som professionella fagocyter ta makrofager aktivt upp fettsyror till upprätthålla värd homeostas. Under dessa processer, kan överbelastade lipider inducera makrofag celldöd. I detta syfte odlade vi BMDMs i vitro med feta kosten fettsyror och uppmätta makrofag celldöd använder flöde flödescytometrisk färgning. Jämfört med kontrollen BSA, mättade fettsyror, inducerad i synnerhet stearinsyra syror, betydande cell...

Watch this Scientific Journal Video about Saturated Fatty Acids Induce Ceramide-associated Macrophage Cell Death at JoVE.com

Saturated Fatty Acids Induce Ceramide-associated Macrophage Cell Death

Vi illustrerar en okomplicerad metod för att härleda murina primära makrofager från benmärgsceller och en enkel metod att förbereda BSA-fettsyra konjugat. Då visar vi att mättade fettsyror kan inducera makrofag celldöd, och sådana celldöd är positivt associerad med cellulära ackumulering av ceramid nivåerna.

Mättade fettsyror inducerar Ceramide-associerade makrofag celldöd

Macrophages highly express epidermal fatty acid-binding protein and adipose fatty acid-binding protein. They actively uptake saturated and unsaturated ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Metoder för att bedöma Beta Medierad Celldöd genom Cytotoxiska T-lymfocyter

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

Utredning av Makrofag Polarisering Använda benmärg makrofager

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

Determination of Tolerable Fatty Acids and Cholera Toxin Concentrations Using Human Intestinal Epithelial Cells and BALB/c Mouse Macrophages

Fastställande av tolerabla fettsyror och kolera Koncentrationer Toxin Använda Human tarmepitelceller och BALB / c Macrophages Mouse

The positive role of fatty acids in the prevention and alleviation of non-human and  human diseases have been and continue to be extensively documented. ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Härledd från benmärg Macrophage Production

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Visualisera makrofag extracellulära fällor med konfokalmikroskopi

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Påvisande av Inflammasome aktivering och Pyroptotic celldöd i murina benmärg-derived makrofager

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

An Immunohistopathologic Study to Profile the Folate Receptor Beta Macrophage and Vascular Immune Microenvironment in Giant Cell Arteritis

En Immunohistopathologic studie att profilera den folat Receptor Beta makrofag och vaskulär immun närmiljön i jätte Cell arterit

Giant cell arteritis (GCA) is a chronic immune-mediated disease of medium-to-large sized arteries that affects older adults. GCA manifests with arthritis ...

Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment

Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment

Behandling av bronkoalveolär lavage vätska och matchade blod för alveolära Makrofage och CD4+ T-cell Immunophenotyping och hiv Reservoir Assessment

Bronchoscopy is a medical procedure whereby normal saline is injected into the lungs via a bronchoscope and then suction is applied, removing ...

Visualization of Macrophage Lytic Cell Death During Mycobacterial Infection in Zebrafish Embryos via Intravital Microscopy

Visualisering av makrofagen lytisk celldöd under Mycobakteriell infektion hos Zebrafish embryon via Intravital mikroskopi

Zebrafish is an excellent model organism for studying innate immune cell behavior due to its transparent nature and reliance solely on its innate immune ...