Name: analysis of immune cells in single sciatic nerves and dorsal root ganglion from a single mouse using flow cytometry
Uploaded: 2017-12-06T14:00:00
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इस अध्ययन ड्यूश Forschungsgemeinschaft द्वारा समर्थित किया गया था (DFG; SFB1118) । लेखक विच्छेदन के सबसे प्रदर्शन और सहायक इस ज्ञान संचारण के लिए एक्सल Erhardt शुक्रिया अदा करना चाहूंगा, और प्रवाह cytometer के तकनीकी पहलू में सहायता के लिए डॉ Volker Eckstein ।

वंय-प्रकार C57BL/6 चूहों (नर; 10-12 सप्ताह) मानक 12 ज प्रकाश/अंधेरे चक्र में रखा गया था और मानक चाउ आहार और पानी के लिए मुफ्त पहुंच प्रदान की गई । सभी पशु प्रयोगों स्थानीय पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा संबंधित द?...

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	<li>DeFrancesco-Lisowitz, A., Lindborg, J. A., Niemi, J. P., Zigmond, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuroimmunology+of+degeneration+and+regeneration+in+the+peripheral+nervous+system.">The neuroimmunology of degeneration and regeneration in the peripheral nervous system.</a> Neuroscience. 302, 174-203 (2014).</li><li>Sica, A., Erreni, M., Allavena, P., Porta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+polarization+in+pathology.">Macrophage polarization in pathology.</a> Cell. Mol. Life Sci. 72, 4111-4126 (2015).</li><li>Vergadi, E., Ieronymaki, E., Lyroni, K., Vaporidi, K., Tsatsanis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akt+Signaling+Pathway+in+Macrophage+Activation+and+M1/M2+Polarization.">Akt Signaling Pathway in Macrophage Activation and M1/M2 Polarization.</a> J. Immunol. 198, 1006-1014 (2017).</li><li>Perrin, F. E., Lacroix, S., Avil&#233;s-Trieueros, M., David, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+monocyte+chemoattractant+protein-1,+macrophage+inflammatory+protein-1alpha+and+interleukin-1beta+in+Wallerian+degeneration.">Involvement of monocyte chemoattractant protein-1, macrophage inflammatory protein-1alpha and interleukin-1beta in Wallerian degeneration.</a> Brain. 128, 854-866 (2005).</li><li>Niemi, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Critical+Role+for+Macrophages+Near+Axotomized+Neuronal+Cell+Bodies+in+Stimulating+Nerve+Regeneration.">A Critical Role for Macrophages Near Axotomized Neuronal Cell Bodies in Stimulating Nerve Regeneration.</a> J Neurosci. 33, 16236-16248 (2013).</li><li>Mokarram, N., Merchant, A., Mukhatyar, V., Patel, G., Bellamkonda, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+modulating+macrophage+phenotype+on+peripheral+nerve+repair.">Effect of modulating macrophage phenotype on peripheral nerve repair.</a> Biomaterials. 33, 8793-8801 (2012).</li><li>Martini, R., Willison, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroinflammation+in+the+peripheral+nerve:+Cause,+modulator,+or+bystander+in+peripheral+neuropathies?.">Neuroinflammation in the peripheral nerve: Cause, modulator, or bystander in peripheral neuropathies?.</a> Glia. 64, 475-486 (2016).</li><li>Carriel, V., Garz&#243;n, I., Alaminos, M., Cornelissen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+assessment+in+peripheral+nerve+tissue+engineering.">Histological assessment in peripheral nerve tissue engineering.</a> Neural Regen. Res. 9, 1657-1660 (2014).</li><li>Leong, T. Y. -. M., Leong, A. S. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+does+antigen+retrieval+work?.">How does antigen retrieval work?.</a> Adv. Anat. Pathol. 14, 129-131 (2007).</li><li>Barrette, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+myeloid+cells+for+axon+regeneration.">Requirement of myeloid cells for axon regeneration.</a> J. Neurosci. 28, 9363-9376 (2008).</li><li>Liu, L., Yin, Y., Li, F., Malhotra, C., Cheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+analysis+of+inflammatory+cells+isolated+from+the+sciatic+nerve+and+DRG+after+chronic+constriction+injury+in+mice.">Flow cytometry analysis of inflammatory cells isolated from the sciatic nerve and DRG after chronic constriction injury in mice.</a> J. Neurosci. Methods. 284, 47-56 (2017).</li><li>Pannell, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+transfer+of+M2+macrophages+reduces+neuropathic+pain+via+opioid+peptides.">Adoptive transfer of M2 macrophages reduces neuropathic pain via opioid peptides.</a> J. Neuroinflammation. 13, 262 (2016).</li><li>Hidmark, A. S., Nawroth, P. P., Fleming, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STZ+causes+depletion+of+immune+cells+in+sciatic+nerve+and+dorsal+root+ganglion+in+experimental+diabetes.">STZ causes depletion of immune cells in sciatic nerve and dorsal root ganglion in experimental diabetes.</a> J. Neuroimmunol. 306, 76-82 (2017).</li></ol>

Sciatic नसों लिपिड के एक बड़े अनुपात होते हैं, जैसे कोलेस्ट्रॉल, axons के आसपास myelin की सामग्री के कारण. तापमान के साथ लिपिड परिवर्तन के गुण के बाद से विभिन्न तापमान पर विभिन्न परिणाम प्राप्त किया जा सकता है । सेल ?...

प्रतिरक्षा कोशिकाओं जो संचलन से पीएन दर्ज करें, के रूप में CD45 और CD11b की अभिव्यक्ति द्वारा परिभाषित, तंत्रिका की अखंडता को बनाए रखने और पुनर्जनन और अध...1में एक भूमिका दोनों खेलने में मदद । मैक्रोफेज (माउस में CD68 की उनकी अभिव्यक्ति द्वारा परिभाषित) एक भड़काऊ phenotype की ओर टेढ़ा किया जा सकता है, अधिक MHC वर्ग द्वितीय और CD86 उनकी सतह (M1) पर व्यक्त, या एक विरोधी भड़काऊ phenotype के प्रति, अधिक intracellular CD206 व्यक्त (M2)2 . macrophage phenotype के विषम एक गतिशील प्रक्रिया के माध्यम से विनियमित है3संकेतन, रोगजनकों के खिलाफ रक्षा में मैक्रोफेज के विभिंन कार्यों को दर्शाती है (M1) और ऊतक पुनर्जनन (M2) में भूमिका । एक घायल तंत्रिका के उत्थान पहले तंत्रिका4,5में मैक्रोफेज द्वारा myelin मलबे की phagocytosis की आवश्यकता है, और विरोधी भड़काऊ (CD68+CD206+) M2 मैक्रोफेज में axon वृद्धि को बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया है पीएन6. कम भर्ती या पीएन, या phagocytosis के लिए ख़राब क्षमता के लिए मैक्रोफेज बिगड़ा पुनर्जनन और तंत्रिका अखंडता के रखरखाव में परिणाम हो सकता है । भड़काऊ M1 मैक्रोफेज, MHC वर्ग द्वितीय व्यक्त, M2 मैक्रोफेज से phagocytosis के कम सक्षम हैं, और कई रोगजनन रोगों के neurodegenerative में न्यूरॉन सूजन फंसाया जाता है7.
परिवर्तन है कि क्षति का एक परिणाम के रूप में तंत्रिका निवासी प्रतिरक्षा प्रणाली के लिए हो सकता है मात्रात्मक, CD45 के नुकसान में प्रकट+ ल्यूकोसाइट्स (या मामले में सूजन CD45+ ल्यूकोसाइट्स की वृद्धि हुई घुसपैठ), या गुणात्मक, जैसे macrophage phenotype का परिवर्तन M2 से M1 phenotype. पीएन की प्रतिरक्षा कोशिकाओं को परंपरागत रूप से अगर के माध्यम से विश्लेषण किया गया है, जमे हुए वर्गों या आयल-एंबेडेड सामग्री का उपयोग कर8। यदि ब्याज की कोशिकाओं के स्थानीयकरण का निर्धारण करने के लिए आवश्यक है । हालांकि, अगर अक्सर ऊतक के एक संकीर्ण अनुभाग में कोशिकाओं की एक अपेक्षाकृत छोटी संख्या की गिनती पर निर्भर करता है का उपयोग कर, ठहराव ठहराव चयन पूर्वाग्रह के लिए अविश्वसनीय और कमजोर बना रही है । प्रतिरक्षा कोशिकाओं के विशिष्ट सबसेट की पहचान के लिए, extracellular और/या intracellular मार्कर के एक साथ का पता लगाने की आवश्यकता है, whilst macrophage phenotype के निर्धारण कम से कम दो मार्करों की आवश्यकता है, विशेष रूप से CD206 और MHC द्वितीय श्रेणी । के रूप में सबसे अधिक से अधिक उपलब्ध सूक्ष्मदर्शी fluorescein isothiocyanate (FITC) और phycoerythrin (पीई), प्रतिरक्षा कोशिकाओं के विशिष्ट सबसेट के लक्षण वर्णन के रूप में अगर सीमित और अधूरा हो सकता है, की आवश्यकता के रूप में कम से कम दो रंग चैनल, एकाधिक स्लाइड, ब्याज की एक ही क्षेत्र है, जो दाग और समानांतर में विश्लेषण कर रहे है से व्युत्पंन की जरूरत है । इस समय उपभोक्ता पहलू इसलिए आवश्यक नहीं है खुद को बड़े नमूना सेट के विश्लेषण के लिए उधार दे । इसके अलावा, के रूप में ब्याज की मार्कर के सबसे extracellular हैं, ऊतक में पता लगाने, जो या तो तेल या cryoconserved में एंबेड किया गया है, झिल्ली अखंडता के विघटन और epitopes के मास्किंग के कारण समस्याग्रस्त किया जा सकता है, के रूप में अच्छी तरह के रूप में के नुकसान एसीटोन और मेथनॉल9जैसे सॉल्वैंट्स के उपयोग से ब्याज की एंटीजन ।
इसके विपरीत, प्रवाह cytometry, जो निलंबन में एकल कोशिकाओं के ऑप्टिकल और प्रतिदीप्ति विशेषताओं के उपाय के रूप में वे प्रकाश की एक किरण के माध्यम से पारित, सेल आबादी के विश्लेषण के लिए एक और अधिक व्यावहारिक और व्यापक साधन प्रदान करता है । प्रवाह cytometry, बजाय ऊतक के एक डिजिटल छवि का निर्माण, सेट मापदंडों, जो एक सेल रिश्तेदार आकार और चिंतनशील सूचकांक शामिल है की एक स्वचालित ठहराव प्रदान करता है, आगे तितर बितर (FSC) के रूप में निर्दिष्ट, दानेदार/ साइड-कैटरिंग (SSC), और सापेक्ष प्रतिदीप्ति तीव्रता प्रदान करने वाले, सेल को एक उपयुक्त fluorophore के साथ लेबल किया गया है, जैसे कि संयुग्मित एंटीबॉडी. एक ठेठ प्रवाह cytometer दो, एयर कूल्ड पराबैंगनीकिरण के होते हैं; एक आर्गन लेजर ४८८ एनएम पर नीले प्रकाश का उत्पादन और एक हीलियम-नियॉन लेजर ६३३ एनएम पर प्रकाश पैदा करता है । इस संयोजन का पता लगाने और माप के लिए अनुमति देता है, इसके साथ ही, या तो सतह पर या intracellular डिब्बे के भीतर कम से कम पांच लक्ष्यों की । अधिक उन्नत प्रवाह cytometers कई पराबैंगनीकिरण से मिलकर बना सकते हैं, जो एक बार में आठ विभिन्न fluorochromes तक का पता लगाने के लिए अनुमति देते हैं, जो कि चयनित fluorochromes के पीक उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य को महत्वपूर्ण रूप से ओवरलैप नहीं करते हैं ।
प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण के लिए, ब्याज की ऊतक पहले enzymatically पच, आम तौर पर collagenase के साथ होना चाहिए, एक एकल सेल निलंबन उत्पन्न करने के लिए. murine sciatic नसों का विश्लेषण पहले एक चूहे से प्राप्त ऊतक की छोटी राशि के कारण मुश्किल हो गया है । इसके अलावा, axons के आसपास myelin के उच्च वसा सामग्री सेल वसूली में बाधा और मलबे की बड़ी मात्रा में पैदा करता है । विधि sciatic तंत्रिका तैयारी और पाचन के लिए यहां वर्णित बैरेट एट अल के Schwann सेल अलगाव प्रोटोकॉल से अनुकूलित किया गया था । 7, और प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए व्यक्तिगत चूहों की नसों से पर्याप्त कोशिकाओं को अलग करना है, ताकि चूहों के बीच भिन्नता को कम करने के लिए करना है । कच्चे ऊतक डाइजेस्ट में एकल कोशिकाओं की पहचान के लिए DAPI का उपयोग axon मलबे, जो सामांयतः कोशिका हानि की ओर जाता है हटाने की आवश्यकता को दरकिनार । फैटी मलबे के भीतर फंसे कोशिकाओं की रिहाई में एक डिटर्जेंट युक्त बफर एड्स के साथ कई बार धुलाई, जिससे उपज में वृद्धि । इस प्रोटोकॉल के अनुसार एक ही माउस से दोनों पूर्ण लंबाई sciatic तंत्रिकाओं के पाचन ≥ ३०,००० एकल nucleated घटनाओं और डीआरजी से प्राप्त किया गया था कि संख्या से कम 3 बार उत्पंन करता है । CD45+ ल्यूकोसाइट्स के अनुपात sciatic तंत्रिका डाइजेस्ट में कुल सेल सामग्री का लगभग 5% था और डीआरजी डाइजेस्ट में लगभग 5-10% । sciatic तंत्रिका में CD45+ कोशिकाओं के बहुमत macrophage मार्करों, CD68 और CD206 व्यक्त की है ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>C57BL/6 Mouse</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>C57BL/6NCrl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (+1g/L glucose, Glutamine, Pyruvate)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>31885023</td>
			<td>The source of this material is not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type 4</td>
			<td>Worthington Biochemical Corp., US</td>
			<td>LS004188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease (DNase) I from bovine pancreas I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25-1g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Calf Serum (FCS), heat inactivated</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody against CD11b-PerCP/Cy5.5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101228</td>
			<td>Clone M1/70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody against MHC class II, biotinylated</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>107603</td>
			<td>Clone M5/114.15.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody against CD45-A647</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>107603</td>
			<td>Clone 30-F11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody against CD68-APC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>137007</td>
			<td>Clone FA/11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody against CD206-PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>141706</td>
			<td>Clone C068C2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody against F4/80-PE/Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>123113</td>
			<td>Clone BM8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-PE/Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>405206</td>
			<td>Used to detect MHCII-biotin with CD45-A647 and CDllb-PerCP/Cy5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-PerCP</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>405213</td>
			<td>Used to detect MHCII-biotin with CD68-APC and F4/80-PE/Cy7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542-1MG</td>
			<td>Dilute in PBS to a 50x and store at 4 &#176;C in the dark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell dissociation sieve - tissue grinder kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CD1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-Shaped, 96-well plates</td>
			<td>Greiner/Sigma</td>
			<td>M8185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml polystryene round-bottom tube, 12x75mm</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60x15mm petri dish</td>
			<td>Greiner/Sigma</td>
			<td>Z643084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSR II Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of immune cells in single sciatic nerves and dorsal root ganglion from a single mouse using flow cytometry

परिधीय तंत्रिका तंत्र (पीएन) में तंत्रिका-निवासी प्रतिरक्षा कोशिकाओं को एक स्वस्थ तंत्रिका में ंयूरॉंस अखंडता को बनाए रखने के लिए आवश्यक हैं । पीएन की प्रतिरक्षा कोशिकाओं चोट और रोग से प्रभावित कर रहे हैं, तंत्रिका समारोह को प्रभावित करने और पुनर्जनन के लिए क्षमता । ंयूरॉन प्रतिरक्षा कोशिकाओं सामांयतः इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा विश्लेषण कर रहे है (यदि) । जबकि अगर तंत्रिका में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के स्थान का निर्धारण करने के लिए आवश्यक है, अगर केवल अर्द्ध मात्रात्मक है और विधि मार्करों की संख्या है कि एक साथ विश्लेषण किया जा सकता है और सतह अभिव्यक्ति की डिग्री तक ही सीमित है । इस अध्ययन में, प्रवाह cytometry ल्युकोसैट घुसपैठ के मात्रात्मक विश्लेषण sciatic नसों या पृष्ठीय रूट ganglions (DRGs) में व्यक्तिगत चूहों के लिए इस्तेमाल किया गया था । एकल सेल विश्लेषण DAPI का उपयोग किया गया था और कई प्रोटीन या तो सतह या intracellular अभिव्यक्ति के लिए एक साथ विश्लेषण कर रहे थे । एक माउस से दोनों sciatic नसों कि इस प्रोटोकॉल के अनुसार इलाज किया गया ≥ ३०,००० एकल nucleated घटनाओं उत्पंन । sciatic नसों में ल्यूकोसाइट्स का अनुपात, CD45 की अभिव्यक्ति द्वारा निर्धारित, sciatic तंत्रिका में कुल सेल सामग्री के लगभग 5% और डीआरजी में लगभग 5-10% था । हालांकि इस प्रोटोकॉल पीएन के भीतर प्रतिरक्षा कोशिका जनसंख्या पर मुख्य रूप से केंद्रित है, प्रवाह cytometry का लचीलापन एक साथ मार्करों की संख्या को मापने के लिए एक साथ इसका मतलब है कि अन्य कोशिकाओं Schwann कोशिकाओं के रूप में तंत्रिका के भीतर मौजूद आबादी, pericytes , fibroblasts, और endothelial कोशिकाओं, भी इस पद्धति का उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता है । इस विधि इसलिए पीएन पर प्रणालीगत प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक नया साधन प्रदान करता है, जैसे न्यूरोपैथी के neurotoxicology और आनुवंशिक मॉडल या मधुमेह जैसे पुराने रोगों में.

दोनों पूर्ण लंबाई sciatic नसों और सभी प्रमुख डीआरजी से सेल सस्पेंशन तैयार किया गया, प्रोटोकॉल के अनुसार, छह स्वस्थ C57BL से/6 चूहों और धुंधला के लिए तीन बराबर aliquots में विभाजित । काउंटर DAPI, जो डीएनए दाग क...

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Analysis of Immune Cells in Single Sciatic Nerves and Dorsal Root Ganglion from a Single Mouse Using Flow Cytometry

murine sciatic तंत्रिका के भीतर कोशिका सामग्री का मात्रात्मक विश्लेषण ऊतक की कमी के कारण मुश्किल है । इस प्रोटोकॉल ऊतक पाचन और तैयारी है कि व्यक्तिगत चूहों की नसों से प्रतिरक्षा कोशिका आबादी के प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए पर्याप्त कोशिकाओं को प्रदान करता है के लिए एक विधि का वर्णन ।

एकल Sciatic नसों में प्रतिरक्षा कोशिकाओं का विश्लेषण और एक एकल माउस से पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रंथि प्रवाह का उपयोग कर Cytometry

Nerve-resident immune cells in the peripheral nervous system (PNS) are essential to maintaining neuronal integrity in a healthy nerve. The immune cells of ...

The overall goal of this procedure is to obtain enough cells from dorsal root ganglions and sciatic nerves from an individual mouse so as to be able to perform flow cytometry analysis of the cells. Generally, individuals new to this method will struggle because peripheral neuronal material generates large amounts of debris when digested. The main advantage with this method is that several markers can be used simultaneously to identify multiple cell types.The implications of this technique extend towards the diagnosis of inflammation and immunopathology during neuropathy. Whilst this method can provide insight to murine models, it can also be applied to other organisms, such as human and pig nerves, with minor modifications. Generally, individuals new to the method, will struggle due to the large amounts of debris generated by the digestions.Visual demonstration of this method is critical as the dissection and cell dissociation steps are difficult to perform because the neuronal material per mouse is limiting. We first had the idea for this method when we saw a protocol isolating swan cell from sciatic nerve from Steve Lacroix's lab. To begin, prepare the mouse as described in the accompanying text protocol and position it ventral side down while stretching out the lower limbs.Next, use a pair of forceps to bilaterally dissect the whole sciatic nerves. Start by separating the muscle tissue from the upper dorsal thigh and follow the nerve up along the spinal column. Cut the nerve where it exits from the spinal column and immediately above the knee at the other end.Then transfer the excised nerves to a 1.5 milliliter tube containing 1 milliliter of ice cold PBS. Store the nerves on ice. Next, isolate the dorsal root ganglion.Start by cutting the ribs parallel with and close to the spinal column on both sides. Then, transversely cut the spinal column at the level of the femurs on the posterior side and close to the skull on the anterior side. Remove the spinal column and use iris scissors to cut away all muscle, fat, and other soft tissues from the spine.Next, place the spinal column with the ventral side facing up and open it starting with caudal end by sliding one tip of the scissors into the vertebral canal at the 12 o'clock position and snipping the bone. Proceeding until the whole spine is cut, repeat this procedure at the six o'clock position until the spine is halved. Separate the two halves of the spine, then place the sample under a dissection microscope.Remove the spinal cord to expose the spinal nerves, then locate and remove the lumbar dorsal root ganglions by gently tugging on the dorsal root to pull it into the vertebral canals. Next, use iris scissors to clip the nerves and connective tissue around the dorsal root ganglion. Using forceps, transfer the dorsal root ganglions to a 1.5 milliliter tube and store them on ice.To locate the dorsal root ganglions, extract them without damaging them, and free them from the spinal nerve, requires exercise and skill. Prepare a digestion media, supplement it with one hundred micrograms per milliliter of deoxyribonuclease and store it on ice. Then, add 500 microliters of digestion media into each of the tubes with the sciatic nerves and the dorsal root ganglions.For the sciatic nerves, chop the material 15 to 20 times using a pair of spring scissors, and then incubate the tissue suspensions in a shaking incubator at 37 degrees Celsius for 20 minutes with gentle agitation. Following incubation, repeatedly triturate the cells suspension through a 1, 000 microliter pipette tip to mechanically dissociate any incompletely digested tissue. Repeat the trituration through a 1, 000 microliter pipette tip.Then incubate the sample for an additional 10 minutes at 37 degrees celsius with gentle agitation. Prepare the ice cold FACS buffer and use it to rinse and soak a stainless steel screen with a mesh size of 140 microns in a 60 millimeter petri dish on ice. Then, use blunt forceps to hold the 140 micron screen filter over the petri dish and repeatedly pass the tissue suspensions through the filter.Collect the cell suspension from the petri dish and transfer it to the same 1.5 milliliter tube stored on ice. Push any incompletely digested tissue that remains on the filter through by repeated trituration with a 1, 000 microliter pipette tip. Then, rinse the screen filter twice with 500 microliters of FACS buffer and combine it with the cell suspension in the 1.5 milliliter tube.If too much of the sample is incompletely digested and passed through the metal mesh, cell loss may occur and flow cytometry analysis may be impossible. Centrifuge the cell suspensions and discard the supernatant. Then re-suspend the cell pellet in one milliliter of FACS buffer.Repeat this washing step once, re-suspending the final cell pellet in 150 to 350 microliters of FACS buffer. The cells are now ready for staining. At the computer, select the appropriate channels for detection of the fluorophores of interest, the appropriate flow rate of the samples, and the total number of events to be collected per sample.The minimum number of events should be one million. Next, create scatter plots under a global worksheet of the side scatter A versus the Forward Scatter A as well as for each fluorophore of interest versus the Forward Scatter A.Also, create a statistical view that will display the number of events and the mean fluorescent intensity for the selected fluorophores. Determine the parent gate, P1, based on scatter plot from DAPI only staining controls.Attach the sample to flow cytometry and click on acquire. Observe the DAPI versus FSC plot and reduce the voltage of the DNA pacific blue channel until the DAPI+population becomes visible. Using the rectangle gating tool, draw a box around the DAPI+population.This represents the P1 gate. Select the scatter plots for each of the fluorophores and display only the DAPI+events. This represents the background fluorescence for each of the fluorophores.Using the rectangle gating too, draw a box in the scatter plots for each of the fluorophores, starting at 103 on the y-axis. This gate represents the region in which positive events for each of the stated markers should be found. Adjust the voltages for each of the fluorophores using the DAPI only staining controls.Attach the sample to flow cytometry and click on acquire. Observe the position of the DAPI+population for each of the fluorophores and adjust the respective voltages such that the populations fall outside of the rectangle gate. Once the flow cytometer has been set up, run the samples and export the Forward Scatter files for further analysis.Washing out the DAPI stain prior to analysis by flow cytometry decreased the fluorescent intensity of the nonnucleated debris. This allowed the material on the high end of the Forward Scatter axis, which contains incompletely digested tissue, to be excluded in the selection of the singlet population. Overall, more than 30, 000 singlets can be regularly obtained from two full sciatic nerves and more than 200, 000 singlets can be obtained from the dorsal root ganglions.From the sciatic nerves, approximately 5%of the singlets expressed CD45 on their surface, whereas approximately 5%to 10%were found to express it in the dorsal root ganglions thereby defining these cells as leukocytes of hematopoietic origin. A majority of the CD45 positive singlets also expressed MHC class II in a gradual manner. In the dorsal root ganglions, CD11b can be used to detect microglial like cells, however;this microglia population is absent from the sciatic nerves.In the sciatic nerve and dorsal root ganglion, 2%to 5%of the singlets expressed CD68. In the sciatic nerves approximately 60%80%of the CD68 positive macrophages expressed CD206. While a smaller proportion of the CD68 positive co-expressed CD206 in the dorsal root ganglion.While performing this procedure, it's important to keep a consistent temperature in order to ensure a consistent result. After it's development this technique allowed for researchers in the field of diabetes to explore the toxic effects of streptozotocin used to induce diabetes in mice. After watching this video, you should have a good understanding of how to perform flow cytometry on peripheral neuronal tissue.Don't forget that working with paraformaldehyde can be hazardous and precautions should always be taken, such as wearing gloves and safety goggles.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

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In Vivo Electrophysiological Measurements on Mouse Sciatic Nerves

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माउस sciatic नसों पर विवो electrophysiological माप में

Electrophysiological studies allow a rational classification of various neuromuscular diseases and are of help, together with neuropathological ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रन्थि आदर्श: कैंसर तंत्रिका आक्रमण की इन विट्रो मॉडलिंग में

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

रीटिनल नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं के परिभाषित सैकट्स के सिंगल-सेल आरएनए-सैक

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रन्थि इंजेक्शन और पृष्ठीय रूट संवेदी अक्षतंतु उत्थान के लिए एक मॉडल के रूप में चोट क्रश

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Laminotomy for Lumbar Dorsal Root Ganglion Access and Injection in Swine

Laminotomy काठ का पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रंथि उपयोग और सूअर में इंजेक्शन के लिए

Dorsal root ganglia (DRG) are anatomically well defined structures that contain all primary sensory neurons below the head. This fact makes DRG attractive ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

जांच स्तनधारी Axon पुनर्जनन: Vivo Electroporation में वयस्क माउस पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रंथि

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...

Use of In Vivo Single-fiber Recording and Intact Dorsal Root Ganglion with Attached Sciatic Nerve to Examine the Mechanism of Conduction Failure

विवो सिंगल-फाइबर रिकॉर्डिंग और अक्षत डोर्सल रूट गुच्छिका में संलग्न Sciatic तंत्रिका के साथ का उपयोग आचार विफलता के तंत्र की जांच करने के लिए

Single-fiber recording has been a classical and effective electrophysiological technique over the last few decades because of its specific application for ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

डोर्सल रूट गंडिका मैक्रोफेज का तेजी से अलगाव

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

In Vitro Myelination of Peripheral Axons in a Coculture of Rat Dorsal Root Ganglion Explants and Schwann Cells

चूहे के पृष्ठीय जड़ नाड़ीग्रन्थि खोजों और श्वान कोशिकाओं के सह-संवर्धन में परिधीय अक्षतंतु का इन विट्रो माइलिनेशन

The process of myelination is essential to enable rapid and sufficient signal transduction in the nervous system. In the peripheral nervous system, ...