Name: use of synaptic zinc histochemistry to reveal different regions and laminae in the developing and adult brain
Uploaded: 2017-10-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Synaptic Zinc Histochemistry to Reveal Different Regions and Laminae in the Developing and Adult Brain at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por subvenciones del centro nacional para recursos de investigación (2G12RR03060-26A1); El Instituto Nacional de salud de minorías y disparidades en la salud (8G12MD007603-27) de los institutos nacionales de salud; Profesional personal Universidad de Congreso-ciudad de Nueva York (PSC-CUNY); y Facultad investigación Grant (RFA II) de la Universidad Americana de Sharjah. Agradecemos a Vidyasagar Sriramoju para introducirnos a estos métodos.

el siguiente protocolo sigue las pautas de cuidado de los animales establecidas por el cuidado Animal institucional y Comité uso (IACUC) en la Universidad de Nueva York, que se ajustan a todos los estado adecuado y las pautas federales. Anestesia es apropiada para hurones y debe modificarse según la especie estudiada.
 <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56547/56547fig1.jpg" /> figura 1: esquematización de los pasos más...

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	<li>Nakashima, A., Dyck, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+and+cortical+plasticity.">Zinc and cortical plasticity.</a> Brain Res. Rev. 59, 347-373 (2009).</li><li>Frederickson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurobiology+of+zinc+and+zinc-containing+neurons.">Neurobiology of zinc and zinc-containing neurons.</a> Int Rev Neurobiol. 31, 145-238 (1989).</li><li>Beaulieu, C., Dyck, R., Cynader, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+glutamate+in+zinc-containing+terminals+of+the+cat+visual+cortex.">Enrichment of glutamate in zinc-containing terminals of the cat visual cortex.</a> NeuroReport. 3 (10), 861-864 (1992).</li><li>Martinez-Guijarro, F. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoarchitecture+and+staining+for+acetylcholinesterase+and+zinc+in+the+visual+cortex+of+the+Parma+wallaby+(Macropus+parma).">Cytoarchitecture and staining for acetylcholinesterase and zinc in the visual cortex of the Parma wallaby (Macropus parma).</a> Brain Behav Evol. 43 (3), 162-172 (1994).</li><li>Dyck, R., Cynader, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+interdigitated+columnar+mosaic+of+cytochrome+oxidase,+zinc,+and+neurotransmitter-related+molecules+in+cat+and+monkey+visual+cortex.">An interdigitated columnar mosaic of cytochrome oxidase, zinc, and neurotransmitter-related molecules in cat and monkey visual cortex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. (90), 9066-9069 (1993).</li><li>Land, P. W., Akhtar, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience-dependent+alteration+of+synaptic+zinc+in+rat+somatosensory+barrel+cortex.">Experience-dependent alteration of synaptic zinc in rat somatosensory barrel cortex.</a> Somatosens Mot Res. 16 (2), 139-150 (1999).</li><li>Danscher, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+selenium+in+the+brain:+a+histochemical+technique+for+light+and+electron+microscopic+localization+of+catalytic+selenium+bonds.">Exogenous selenium in the brain: a histochemical technique for light and electron microscopic localization of catalytic selenium bonds.</a> Histochemistry. 76, 281-293 (1982).</li><li>Danscher, G., Howell, G., Perez-Clausell, J., Hertel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dithizone,+Timm's+sulphide+silver+and+the+selenium+methods+demonstrate+a+chelatable+pool+of+zinc+in+CNS:+a+proton+activation+(PIXE)+analysis+of+carbon+tetrachloride+extracts+from+rat+brains+and+spinal+cords+intravitall+treated+with+dithizone.">The dithizone, Timm's sulphide silver and the selenium methods demonstrate a chelatable pool of zinc in CNS: a proton activation (PIXE) analysis of carbon tetrachloride extracts from rat brains and spinal cords intravitall treated with dithizone.</a> Histochemistry. 83, 419-422 (1985).</li><li>Gallyas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+staining+of+myelin+by+means+of+physical+development.">Silver staining of myelin by means of physical development.</a> Neurol Res. 1 (2), 203-209 (1979).</li><li>Wong-Riley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+visual+system+of+monocularly+sutured+or+enucleated+cats+demonstrable+with+cytochrome+oxidase+histochemistry.">Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry.</a> Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).</li><li>Mir&#243;-Berni&#233;, N., Ichinohe, N., Perez-Clausell, J., Rockland, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc-rich+transient+vertical+modules+in+the+rat+retrosplenial+cortex+during+postnatal+development.">Zinc-rich transient vertical modules in the rat retrosplenial cortex during postnatal development.</a> J Neurosci. 138 (2), 523-535 (2006).</li><li>Ichinohe, N., Rockland, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+synaptic+zinc+in+the+macaque+monkey+amygdala.">Distribution of synaptic zinc in the macaque monkey amygdala.</a> J Comp Neurol. 489 (2), 135-147 (2005).</li><li>Innocenti, G. M., Manger, P. R., Masiello, I., Colin, I., Tettoni, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+and+callosal+connections+of+visual+areas+17,+18,+19+and+21+in+the+ferret+(Mustela+putorius).">Architecture and callosal connections of visual areas 17, 18, 19 and 21 in the ferret (Mustela putorius).</a> Cereb Cortex. 12 (4), 411-422 (2002).</li><li>Khalil, R., Levitt, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+histochemistry+reveals+circuit+refinement+and+distinguishes+visual+areas+in+the+developing+ferret+cerebral+cortex.">Zinc histochemistry reveals circuit refinement and distinguishes visual areas in the developing ferret cerebral cortex.</a> Brain Struct Funct. 218, 1293-1306 (2013).</li><li>Manger, P. R., Masiello, I., Innocenti, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Areal+organization+of+the+posterior+parietal+cortex+of+the+ferret+(Mustela+putorius).">Areal organization of the posterior parietal cortex of the ferret (Mustela putorius).</a> Cereb Cortex. 12, 1280-1297 (2002).</li><li>Wong, P., Kaas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architectonic+subdivisions+of+neocortex+in+the+gray+squirrel+(Sciurus+carolinensis.).">Architectonic subdivisions of neocortex in the gray squirrel (Sciurus carolinensis.).</a> The anatomical record. 291, 1301-1333 (2008).</li><li>Land, P. W., Shamalla-Hannah, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience-dependent+plasticity+of+zinc-containing+cortical+circuits+during+a+critical+period+of+postnatal+development.">Experience-dependent plasticity of zinc-containing cortical circuits during a critical period of postnatal development.</a> J Comp Neurol. 447 (1), 43-56 (2002).</li><li>Czupryn, A., Skangiel-Kramska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+synaptic+zinc+in+the+developing+mouse+somatosensory+barrel+cortex.">Distribution of synaptic zinc in the developing mouse somatosensory barrel cortex.</a> J Comp Neurol. 386, 652-660 (1997).</li><li>Timm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zur+Histochemie+der+Schwermetalle.+Das+Sulfid-Silber-Verfahren.">Zur Histochemie der Schwermetalle. Das Sulfid-Silber-Verfahren.</a> Dtsch Z ges gerichtl Med. 46, 706-711 (1958).</li></ol>

El presente estudio emplea una técnica histoquímica basada en una versión modificada de la Danscher (1982) método10, por el que localización sináptica cinc puede ser detectado y visualizado en el cerebro. Esencialmente, este método funciona mediante la inyección el animal con el selenito de sodio quelante cinc (Na2SeO3) (15 mg/kg). Después de la inyección, la selenita viaja al cerebro y se une al zinc libre que se localiza en las vesículas presinápticas de zinc qu...

Manchas histológicas se han utilizado tradicionalmente para ayudar en la identificación de áreas corticales en varias especies por revelar las diferencias en características arquitectónicas. El uso combinado de técnicas histoquímicas como gránulos de Nissl, citocromo oxidasa (CO) reactividad o mielina puede resultar fructífero como revelan límites áreas similares en el cerebro adulto. Sin embargo, estas manchas histoquímicas no revelan siempre adecuadamente límites claros entre áreas corticales y las capas del cerebro inmaduro.
En el sistema nervioso central, zinc tiene varias funciones esenciales que incluyen estabilización de la estructura del ADN, actuando como un cofactor enzimático, participa en numerosas funciones reguladoras y actúan como un neuromodulador a través de su presencia en vesículas sinápticas 1. zinc sináptica es única ya que puede visualizarse mediante métodos histológicos, mientras que el cinc protein-bound se puede visualizar2. Esta característica ha sido aprovechada para revelar el patrón de cinc sináptica en diferentes regiones corticales, e histoquímica de zinc sináptica se ha utilizado en varios estudios. Un subconjunto de neuronas glutamatérgica en la corteza cerebral contiene zinc en las vesículas presinápticas en su axon terminales3,4. Estudios histoquímicos han revelado una distribución heterogénea de zinc sináptica en la corteza cerebral5,6,7. Parece haber una distribución areal y laminar diferentes de zinc histochemically reactiva en diferentes regiones corticales (p. ej., visual y Corteza somatosensorial), o en capas (por ejemplo, los niveles de zinc en el supragranular y infragranular capas de la corteza visual primaria son substancialmente más altas que en la capa de entrada talamocorticales IV con niveles relativamente bajos de zinc sináptica)5,8,9. La heterogeneidad en zinc sináptica la coloración observada en la corteza es especialmente ventajosa como facilita la identificación areal y laminar.
Aquí presentamos una descripción detallada de un procedimiento histoquímico de zinc sináptica, que es una versión modificada del Danscher 1982 método10. Este método utiliza selenio inyectado por vía intraperitoneal (IP) en los animales como un agente quelante. La selenita viaja al cerebro a reaccionar con piscinas de zinc libre encuentran en las vesículas de un subconjunto de las sinapsis glutamatérgica en el cerebro. Esta reacción produce un precipitado que se puede ampliar posteriormente el desarrollo plata2,10,11.
Este procedimiento revela patrones laminares y areal de tinción sináptica zinc. Análisis densitométricos pueden utilizarse para evaluar estos patrones cualitativa y cuantitativamente en el cerebro adulto y no maduro para estudiar efectos de otras intervenciones, como manipulaciones sensoriales, ambientales, farmacológicas o genéticas. Además, uno también puede desear evaluar potenciales cambios de desarrollo en la distribución de zinc sináptica en otras estructuras corticales o subcorticales en otros sistemas del modelo. La información cuantitativa que proporciona análisis densitométrico en este método puede ser ventajosa para el siguiente desarrollo del cerebro en el tiempo. Este protocolo proporciona un compañero y otras inmuno - marcadores histoquímicos para revelar los límites laminares y areal.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Euthasol (Euthanasia solution)</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>710101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium selenite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine (Ketaved)</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>48858</td>
			<td>100 mg/ml injectables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine (Anased)</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>33198</td>
			<td>100 mg/ml injectables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td>Dilute to 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gum arabic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9752-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W302600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroquinone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver lactate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fish gelatine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochrome c</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2506</td>
			<td>(Type III, from equine heart)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Domino</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X5P-1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SP15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A406-20</td>
			<td>Used for dehydration prior to slide mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Brain Research Laboratories</td>
			<td>#3660-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted unsubbed slides</td>
			<td>Brain Research Laboratories</td>
			<td>#3875-FR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>American Optical Company</td>
			<td>860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adope Photoshop</td>
			<td>Adobe Systems, San Jose, CA</td>
			<td></td>
			<td>To assemble images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/</td>
			<td></td>
			<td>For densometric measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tray</td>
			<td>Any standard plastic tray may be used</td>
			<td></td>
			<td>to immerse slides in developer solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Any standard hotplate may be used</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of synaptic zinc histochemistry to reveal different regions and laminae in the developing and adult brain

Caracterización de la organización anatómica y funcional del cerebro y desarrollo requiere la identificación precisa de circuitos neuronales distintos y regiones en el cerebro inmaduro y adulto. Aquí describimos un procedimiento de tinción histoquímica de cinc que revela las diferencias en los patrones de tinción entre los diferentes estratos y regiones del cerebro. Otros han utilizado este procedimiento no sólo para revelar la distribución de las neuronas que contienen cinc y circuitos en el cerebro, sino también para delinear correctamente límites areal y laminares en el cerebro en desarrollo y adultos en varias especies. Aquí ilustramos esto procedimiento con imágenes del desarrollo de la coloración y los cerebros de adultos ferret. Revelan un patrón de coloración de zinc que sirve como un marcador anatómico de las zonas y capas y puede usarse confiablemente para distinguir áreas visuales corticales en la corteza visual en desarrollo y adultos. El objetivo principal de este protocolo es presentar un método histoquímico que permite la identificación exacta de las capas y regiones en el cerebro en desarrollo y adultos donde otros métodos no lo hacen. En segundo lugar, en combinación con el análisis densitométrico de la imagen, este método permite evaluar la distribución de zinc sináptica para revelar posibles cambios a lo largo de desarrollo. Este protocolo describe en detalle los reactivos, herramientas y pasos necesarios para teñir sucesivamente secciones del cerebro congelado. Aunque este protocolo es descrito usando tejido de cerebro de ferret, fácilmente puede ser adaptado para su uso en roedores, gatos o monos, así como en otras regiones del cerebro.

Los pasos principales implicados en este protocolo de tinción de secciones del cerebro para zinc sináptica se presentan en un diagrama de flujo en la figura 1. El protocolo puede dividirse en tres fases: 1) perfusión y colección de tejido, preparación de tejido 2) coloración e histoquímica 3) Zinc. Brevemente, durante la primera fase del Protocolo, el animal está anestesiado e inyectado IP con la dosis apropiada de selenito de sodio. Después de un pe...

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Use of Synaptic Zinc Histochemistry to Reveal Different Regions and Laminae in the Developing and Adult Brain

Uso de Zinc sináptica histoquímica para revelar las diferentes regiones y láminas en el cerebro en desarrollo y adulto

Describimos un procedimiento histoquímico que revela características zinc laminar y areal manchas patrones en regiones diferentes del cerebro. El patrón de coloración de zinc puede utilizarse en conjunto con otros marcadores anatómicos distinguir confiablemente las capas y regiones en el cerebro en desarrollo y adultos.

Characterization of anatomical and functional brain organization and development requires accurate identification of distinct neural circuits and regions ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

Seguimiento de los cambios en la concentración de calcio intracelular y la eficacia sináptica en el molusco<em&gt; Aplysia</em

It has been suggested that changes in intracellular calcium mediate the induction of a number of important forms of synaptic plasticity (e.g., ...

Investigación

Neurociencias

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Fast Micro-iontoforesis de glutamato y GABA: una herramienta útil para investigar la integración sináptica

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

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Cultivo de células madre neurales de Regiones convencionales y no convencionales del cerebro adulto de roedores

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High Resolution Quantitative Synaptic Proteome Profiling of Mouse Brain Regions After Auditory Discrimination Learning

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Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

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Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

Cuantificar la distribución heterogénea de una proteína sináptica en el cerebro de ratón mediante inmunofluorescencia

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Mapping the motor cortex with transcranial magnetic stimulation (TMS) has potential to interrogate motor cortex physiology and plasticity but carries ...