Name: simultaneous mapping and quantitation of ribonucleotides in human mitochondrial dna
Uploaded: 2017-11-14T13:00:00
Duration: 12 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Mapping and Quantitation of Ribonucleotides in Human Mitochondrial DNA at JoVE.com

هذه الدراسة وأيده "المجلس السويدي للبحوث" (www.vr.se) ويمنح للقوس (2014-6466 و "المؤسسة السويدية" "البحوث الاستراتيجية" (www.stratresearch.se) للقوس (ICA14-0060). جامعة تشالمرز للتكنولوجيا دعما ماليا إلى مكمي أثناء هذا العمل. وكان الممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات والتحليل، وقرار نشر أو إعداد المخطوطة.

<ol>
	<li>Traut, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+Concentrations+of+Purines+and+Pyrimidines.">Physiological Concentrations of Purines and Pyrimidines.</a> Mol. Cell. Biochem. 140, 1-22 (1994).</li><li>McElhinny, S. A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abundant+ribonucleotide+incorporation+into+DNA+by+yeast+replicative+polymerases.">Abundant ribonucleotide incorporation into DNA by yeast replicative polymerases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 4949-4954 (2010).</li><li>Williams, J. S., Lujan, S. A., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+ribonucleotides+incorporated+during+eukaryotic+DNA+replication.">Processing ribonucleotides incorporated during eukaryotic DNA replication.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 17, 350-363 (2016).</li><li>Clausen, A. R., Zhang, S., Burgers, P. M., Lee, M. Y., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonucleotide+incorporation,+proofreading+and+bypass+by+human+DNA+polymerase+delta.">Ribonucleotide incorporation, proofreading and bypass by human DNA polymerase delta.</a> DNA Repair. 12, 121-127 (2013).</li><li>Potenski, C. J., Klein, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+the+misincorporation+of+ribonucleotides+into+genomic+DNA+can+be+both+harmful+and+helpful+to+cells.">How the misincorporation of ribonucleotides into genomic DNA can be both harmful and helpful to cells.</a> Nucleic Acids Res. 42, 10226 (2014).</li><li>Vengrova, S., Dalgaard, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNase-sensitive+DNA+modification(s)+initiates+S.+pombe+mating-type+switching.">RNase-sensitive DNA modification(s) initiates S. pombe mating-type switching.</a> Gene. Dev. 18, 794-804 (2004).</li><li>Lujan, S. A., Williams, J. S., Clausen, A. R., Clark, A. B., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonucleotides+Are+Signals+for+Mismatch+Repair+of+Leading-Strand+Replication+Errors.">Ribonucleotides Are Signals for Mismatch Repair of Leading-Strand Replication Errors.</a> Mol. Cell. 50, 437-443 (2013).</li><li>Ghodgaonkar, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonucleotides+Misincorporated+into+DNA+Act+as+Strand-Discrimination+Signals+in+Eukaryotic+Mismatch+Repair.">Ribonucleotides Misincorporated into DNA Act as Strand-Discrimination Signals in Eukaryotic Mismatch Repair.</a> Mol. Cell. 50, 323-332 (2013).</li><li>DeRose, E. F., Perera, L., Murray, M. S., Kunkel, T. A., London, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+Structure+of+the+Dickerson+DNA+Dodecamer+Containing+a+Single+Ribonucleotide.">Solution Structure of the Dickerson DNA Dodecamer Containing a Single Ribonucleotide.</a> Biochemistry. 51, 2407-2416 (2012).</li><li>Li, Y. F., Breaker, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+RNA+degradation+by+specific+base+catalysis+of+transesterification+involving+the+2+'-hydroxyl+group.">Kinetics of RNA degradation by specific base catalysis of transesterification involving the 2 '-hydroxyl group.</a> J. Am. Chem. Soc. 121, 5364-5372 (1999).</li><li>McElhinny, S. A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+instability+due+to+ribonucleotide+incorporation+into+DNA.">Genome instability due to ribonucleotide incorporation into DNA.</a> Nat. Chem. Biol. 6, 774-781 (2010).</li><li>Berglund, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+pools+dictate+the+identity+and+frequency+of+ribonucleotide+incorporation+in+mitochondrial+DNA.">Nucleotide pools dictate the identity and frequency of ribonucleotide incorporation in mitochondrial DNA.</a> Plos Genet. 13, (2017).</li><li>Brown, J. A., Suo, Z. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlocking+the+Sugar+"Steric+Gate"+of+DNA+Polymerases.">Unlocking the Sugar "Steric Gate" of DNA Polymerases.</a> Biochemistry. 50, 1135-1142 (2011).</li><li>Sparks, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNase+H2-Initiated+Ribonucleotide+Excision+Repair.">RNase H2-Initiated Ribonucleotide Excision Repair.</a> Mol. Cell. 47, 980-986 (2012).</li><li>Miyabe, I., Kunkel, T. A., Carr, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Major+Roles+of+DNA+Polymerases+Epsilon+and+Delta+at+the+Eukaryotic+Replication+Fork+Are+Evolutionarily+Conserved.">The Major Roles of DNA Polymerases Epsilon and Delta at the Eukaryotic Replication Fork Are Evolutionarily Conserved.</a> Plos Genet. 7, (2011).</li><li>Clausen, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+replication+enzymology+in+vivo+by+genome-wide+mapping+of+ribonucleotide+incorporation.">Tracking replication enzymology in vivo by genome-wide mapping of ribonucleotide incorporation.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 22, 185-191 (2015).</li><li>Koh, K. D., Balachander, S., Hesselberth, J. R., Storici, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribose-seq:+global+mapping+of+ribonucleotides+embedded+in+genomic+DNA.">Ribose-seq: global mapping of ribonucleotides embedded in genomic DNA.</a> Nat. Methods. 12, 251 (2015).</li><li>Keszthelyi, A., Daigaku, Y., Ptasinska, K., Miyabe, I., Carr, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+ribonucleotides+in+genomic+DNA+and+exploring+replication+dynamics+by+polymerase+usage+sequencing+(Pu-seq).">Mapping ribonucleotides in genomic DNA and exploring replication dynamics by polymerase usage sequencing (Pu-seq).</a> Nat. Protoc. 10, 1786-1801 (2015).</li><li>Ding, J., Taylor, M. S., Jackson, A. P., Reijns, M. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mapping+of+embedded+ribonucleotides+and+other+noncanonical+nucleotides+using+emRiboSeq+and+EndoSeq.">Genome-wide mapping of embedded ribonucleotides and other noncanonical nucleotides using emRiboSeq and EndoSeq.</a> Nat. Protoc. 10, 1433-1444 (2015).</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17, 10-12 (2011).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biol. 10, (2009).</li></ol>

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

وهنا يقدم تقنية الخريطة وقياس ريبونوكليوتيديس في جدنا، ومتدنا على وجه الخصوص، بمقدمة بسيطة من الانقسام الحمض النووي في مواقع محددة تسلسل الجينوم كإضافة إلى البروتوكول seq يتميز المنشأة في الوقت نفسه. بينما تركز هذه الدراسة على متدنا البشرية، أصلاً وضع الأسلوب يتميز seq في Saccharomyces cerevisiae، توضح الترجمة الأسلوب إلى12،الكائنات الحية الأخرى16.
لموثوقية النتائج المتحصل عليها من هذا النهج، ينبغي الإشارة إلى بعض الخطوات الهامة: (أ) نظراً لسد محولات التسلسل لينتهي 5´ المتاحة في كل، من الأهمية بمكان للعمل مع الحمض النووي سليما جداً. الحمض النووي ينبغي أن تكون معزولة والمكتبات ينبغي أن يفضل مباشرة بعد عزل الحمض النووي، أو يمكن تخزين الحمض النووي في-20 درجة مئوية. لا ينصح لتخزين الحمض النووي في الثلاجة لفترة طويلة أو مرارا تجميد وإذابة الجليد في ذلك. (ب) لإنشاء مكتبات مناسبة مع هذا الأسلوب، من الأهمية بمكان القيام بمعاملة كوه من الحمض النووي في فرن حضانة، بدلاً من كتلة تدفئة، وضمان تدفئة متجانسة عينة كاملة والتحلل المائي الكمي. (ج) علاوة على ذلك، من المهم مراقبة نوعية المكتبات قبل تجميع وترتيب. الحمض النووي ينبغي أن يكون كمياً وتحليلها باستخدام نظام التفريد الآلي لضمان كميات كافية من مكتبة الحمض النووي، وتأكيد الأحجام بلغة مناسبة، والتحقق من مبلمر.
لتحليل بيانات ذات مغزى، من المهم أيضا أن نلاحظ أن قيمة إعلامية من هذا الأسلوب يعتمد على ضوابط ملائمة لتقييم معلومات أساسية تهم والتحيزات القائمة على التسلسل أو حبلا. نحقق بشكل روتيني من كفاءة تعيين في عينات بوكل من ما يقرب من 70% عند هضم فقط مع اندونوكليسي تسلسل معين (الشكل 2B، لوحات الأيسر). وبالإضافة إلى ذلك، من المهم التأكد من أن معاملة اندونوكليسي لا تؤثر على مجمل الكشف عن ريبونوكليوتيديس مدمجة بمقارنة هينسي تعامل ودون علاج عينات (الشكل 3B). في هذه التجارب، قد استخدمت هينسيي لإدخال تخفيضات موقع معين، على الرغم من إنزيمات التقييد أخرى عالية الدقة يمكن أن تستخدم أيضا.
البروتوكول يمكن تكييفها وفقا لدراسة أنواع أخرى من الآفات الحمض النووي التي يمكن معالجتها بفوسفات 5´ أو 5´--أوه ينتهي. دقة النتائج تعتمد على الطابع الخاص للتجهيز ويتطلب ضوابط مناسبة (مثل نوع البرية أو غير المعالجة) للتحقق. وعلاوة على ذلك، عند تكييف هذا الأسلوب إلى تطبيقات أخرى أو لاستخدامها مع الكائنات الأخرى، ينبغي النظر أن الأسلوب في أن الإعداد الحالي يتطلب حوالي 1 ميكروغرام من الحمض النووي الذي يجري تجهيزه بمكتبة. نظراً لعدد الغايات تعتمد على عدد ريبونوكليوتيديس المضمنة، التي تختلف تبعاً للكائن أو متحولة، العينات، بما في ذلك انخفاض عدد ribonucleotides سيتطلب أكثر الإدخال الحمض النووي لتوليد عدد كاف من الغايات في بناء مكتبة اللاحقة. وبالمثل، إذا كانت عينات الحمض النووي لديها عدد أكبر من ريبونوكليوتيديس، كما سيتطلب استخدام الحمض النووي أقل الإدخال للحصول على الظروف المثلى لربط والثانية حبلا التوليف والتضخيم PCR. جدير بالذكر أن بناء المكتبة كما هو موضح في هذا البروتوكول أيضا إنشاء البيانات تغطي الجينوم النووي (كما هو معروض في الشكل 2D) وركز فقط تحليل البيانات على متدنا. وهذا يوضح أن الجينوم أكبر مع ترددات متوسطة أقل من ريبونوكليوتيدي كما يتم التقاطها بواسطة هذا الأسلوب.
وعند النظر في هذا الأسلوب، بعض القيود ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار: على الرغم من أن هذا الأسلوب، من الناحية النظرية، ينبغي تطبيقها على أي كائن حي، جينوم إشارة مناسبة ضروري للمواءمة بين ما يلي. وعلاوة على ذلك، تمثل النتائج التي تم الحصول عليها من موقعنا البروتوكول على ما يلي من عدد كبير من الخلايا. لا يمكن تحديد أنماط التأسيس ريبونوكليوتيدي محددة لمجموعة فرعية خلايا بهذا النهج. إذا كان يتم تعيين ريبونوكليوتيديس في جينومات أكبر مع عدد قليل جداً من ريبونوكليوتيديس، فإنه يمكن أن يكون تحديا لتميز ريبونوكليوتيديس من نيكس عشوائي ولذلك هناك حاجة إلى ضوابط ملائمة.
ويمتد الأسلوب يصف لنا هنا، التقنيات المتاحة في فيفو مثل Seq يتميز16أو Seq الريبوز17Seq بو18امريبوسيق19. هذه النهج الاستفادة من حساسية ribonucleotides المضمنة القلوية أو معاملة H2 رناسي، على التوالي، تستخدم تسلسل الجيل القادم لتحديد ريبونوكليوتيديس على نطاق الجينوم، الذي يسمح رسم الخرائط والمقارنة إدراج النسبي. طريق ناهضة تسلسل الحمض النووي على وجه التحديد، كما هو موضح أعلاه، بالإضافة إلى التحلل القلوية في ribonucleotides المضمنة، يمكن تطبيع على ما يلي ريبونوكليوتيديس إلى تلك المواقع الانقسام، يسمح ليس فقط بتحديد ورسم خرائط ريبونوكليوتيديس، ولكن أيضا على كوانتيتيشن لكل جزيء الحمض النووي. تطبيق لدينا التقنية في سياق الأمراض المتصلة بتكرار الحمض النووي، يمكن أن توفر إصلاح الحمض النووي، و TLS فهم أعمق لدور ريبونوكليوتيديس في الكامنة وراء الآليات الجزيئية وسلامة الجينوم بشكل عام.

في خلية حقيقية النواة، تركيز ريبونوكليوتيديس (رنتبس) أعلى بكثير من تركيز ديوكسيريبونوكليوتيديس (دنتبس)1. الحمض النووي [بولمرس] تميز ضد ريبونوكليوتيديس، ولكن هذا التمييز لا يتسم بالكمال، ونتيجة لذلك، يمكن إدراج ريبونوكليوتيديس بدلاً من ديوكسيريبونوكليوتيديس في جينومات أثناء النسخ المتماثل للحمض النووي. قد يكون ريبونوكليوتيديس النيوكليوتيدات غير المقبول الأكثر شيوعاً التي تدمج الجينوم2. تتم إزالة معظم هذه ريبونوكليوتيديس أثناء نضج يفتت اوكازاكي H2 رناسي ribonucleotide بدأ إصلاح الختان (RER) أو توبويسوميراسي 1 (استعرض في المرجع3). ريبونوكليوتيديس التي لا يمكن إزالتها بالبقاء ستابلي مدرجة في الحمض النووي2،4 وقد تؤثر على نواح الضارة والمفيدة على حد سواء (استعراض في استعراض5). إضافة إلى كونه قادراً على التصرف كإشارات إيجابية، على سبيل المثال في التزاوج نوع التبديل في شيزوساكتشاروميسيس بومبي6 ووسم حبلا الحمض النووي الوليد أثناء عدم تطابق إصلاح (MMR)7،8، ريبونوكليوتيديس تؤثر هيكل9 والاستقرار من الحمض النووي المحيطة بسبب مجموعة الهيدروكسيل 2´ بهم الريبوز10، أدى عدم الاستقرار الإجهاد والجينوم ريبليكاتيفي11. الوفرة من ريبونوكليوتيديس في الحمض النووي (جدنا) وأهميتها في النسخ المتماثل وإصلاح الآليات، فضلا عن الآثار المترتبة على استقرار المجين، يعطي سببا للتحقيق وقوع دقيقة، والتردد في طريقة على نطاق الجينوم.
لم يتم اكتشاف نشاط H2 رناسي في الميتوكوندريا البشرية وريبونوكليوتيديس ولذلك يتم إزالة عدم كفاءة في الحمض النووي (متدنا). تشترك عدة مسارات في المعروض النيوكليوتيدات إلى الميتوكوندريا البشرية والتحقيق في ما إذا كانت الاضطرابات في بركة النوكليوتيدات المتقدرية يسبب وجود عدد مرتفع من ريبونوكليوتيديس في متدنا البشرية، قمنا بتطوير بروتوكول لخريطة وقوانتيتاتي هذه ريبونوكليوتيديس في متدنا البشرية المعزولة من الليفية، وخلايا هيلا، و خطوط الخلية المريض12.
تستند معظم في المختبر النهج (استعراض في استعراض13) لتحديد الانتقائية الحمض النووي [بولمرس] ضد رنتبس ريبونوكليوتيدي واحد الإدراج أو التمهيدي ملحق التجارب حيث يتم تضمين رنتبس المتنافسة في رد فعل مزيج، السماح بتحديد أو كوانتيتيشن النسبية لإدماج ريبونوكليوتيدي في قوالب الحمض النووي قصيرة. قد لا تعكس تجمعات دنتب ورنتب بتركيزات الخلوية النهج الكمي في تسلسلات قصيرة وذلك توفر نظرة ثاقبة بوليميريز انتقائية بل ذات أهمية محدودة فيما يتعلق بالجينوم كله. فقد ثبت أن مقدار نسبي ribonucleotides إدراجها أثناء النسخ المتماثل من قالب الحمض النووي أطول، مثل بلازميد، يمكن تصور في جل تسلسل باستخدام دنتبس راديولابيليد وهيدروليزينج في الحمض النووي في وسط قلوي14. وعلاوة على ذلك، قد تم تحليلها جدنا في البقع الجنوبية بعد التحلل المائي القلوي، والسماح لسبر حبلا على حدة وتحديد معدلات المطلق لإدماج ريبونوكليوتيدي في فيفو15. تسمح نسبية مقارنة تواتر إدراج هذه النهج لكن تسليم ثاقبة لا موقف أو هوية ribonucleotides مدمجة. نهج أكثر حداثة لتحليل محتوى ريبونوكليوتيدي في جدنا في فيفو، مثل Seq يتميز16Seq الريبوز17، Seq بو18أو19من امريبوسيق، الاستفادة من ribonucleotides المضمنة حساسية القلوية أو معاملة H2 رناسي، على التوالي، وتستخدم تسلسل الجيل القادم لتحديد ريبونوكليوتيديس على نطاق الجينوم. لا توفر هذه الأساليب ثاقبة تواتر إدراج المطلقة ريبونوكليوتيديس تم الكشف عنها. بإضافة خطوة محددة الانقسام الانزيمية تسلسل البروتوكول seq يتميز، الأسلوب يصف لنا هنا مريح يمتد المعلومات المكتسبة من نهج تسلسل، السماح بتعيين واحد وكوانتيتيشن من المضمنة ريبونوكليوتيديس12. هذا الأسلوب ينطبق على أي كائن حي نظراً لأن الغاية سليمة مقتطفات الحمض النووي يمكن أن تتولد ويتوفر جينوم مرجعية مناسبة. الأسلوب يمكن تكييفها مع كوانتيتاتي وتحديد موقع أي الآفة التي يمكن أن يهضم نوكلاس ويترك فوسفات 5´ أو وضع نهاية 5´ يا.
خريطة وكوانتيتاتي ريبونوكليوتيديس في الحمض النووي، يجمع الأسلوب الانقسام قبل endonuclease محددة تسلسل، والتحلل القلوي توليد 5´-الفوسفات ينتهي في المواقع حيث يوجد تسلسل محددة خاصة بالتعرف اندونوكليسي و 5´- أوه وينتهي في المواقع التي توجد فيها ريبونوكليوتيديس. منذ نهايات الحرة التي تم إنشاؤها هي متصلة في وقت لاحق مع محولات والتسلسل باستخدام تسلسل الجيل القادم، أنها ذات أهمية لاستخدام الحمض النووي الغاية سليمة وتجنب تجزئة عشوائي أثناء إعداد مكتبة واستخراج الحمض النووي. يسمح تقييم هذه القراءات تطبيع ليقرأ في مواقع الانقسام اندونوكليسي كوانتيتيشن المتزامن ورسم الخرائط من ريبونوكليوتيديس تم الكشف عنها. يتم الكشف عن 5´ الحرة--ينتهي في تجارب التحكم حيث يتم استبدال التحلل المائي القلوي للحمض النووي بالمعاملة مع بوكل. توفر نظرة ثاقبة موقع ريبونوكليوتيدي وكمية البيانات المكتسبة ويسمح التحاليل فيما يتعلق بتكرار المحتوى ودمج ribonucleotide.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x T4 RNA Ligase Reaction Buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0216L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>Medicago</td>
			<td>09-9400-100</td>
			<td>dissolve 1 tablet in H2O to a final volume of 1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>33539-1L-GL-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2940CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-0610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-Triphosphate (ATP, 10 mM)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P0756S</td>
			<td>dilute with EB to 2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 1000 Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-1504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, Molecular Biology Grade (20 mg/mL)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9000S</td>
			<td>diltue with nuclease-free H2O to 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer EB</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>19086</td>
			<td>referred to as EB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CleanPCR paramagnetic beads</td>
			<td>CleanNA</td>
			<td>CPCR-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix (10 mM each)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0447L</td>
			<td>dilute with EB to 2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61965026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag 96 Side</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12331D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 99.5% analytical grade</td>
			<td>Solveco</td>
			<td>1395</td>
			<td>dilute with milliQ water to 70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA, 0.5 M)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03690-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer pH 8.0 (1 M) sterile BC</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A6906,0125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexammine cobalt(III) chloride (CoCl3(NH3)6)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7891-5G</td>
			<td>dissolve in nuclease-free H2O for 10&#160;M solution, sterile filter. CAUTION: carcinogenic, sensitizing and hazardous to aquatic environment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HincII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0103S</td>
			<td>supplied with NEBuffer 3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridiser HB-1D</td>
			<td>Techne</td>
			<td>FHB4DD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK2602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mM EDTA, 20 mM HEPES, NaCl 75 mM, Proteinase K (200 &#181;g/mL), 1% SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tube 1.5 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge 5424R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5404000014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge MiniStar silverline</td>
			<td>VWR</td>
			<td>521-2844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiply&#160;&#181;StripPro 0.2 mL tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.991.992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol &#8211; chloroform &#8211; isoamyl alcohol (25:24:1)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>77617-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>26764.232</td>
			<td>dissolve in nuclease-free H2O for 3&#160;M solution, sterile filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>26668.296</td>
			<td>dissolve in nuclease-free H2O for 3&#160;M solution, sterile filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q33216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay Tubes</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32850</td>
			<td>CAUTION: Contains flammable and toxic components</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32851</td>
			<td>CAUTION: Contains flammable and toxic components</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge 4K15</td>
			<td>Sigma Laboratory Centrifuges</td>
			<td>No. 10740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS Solution, 10%</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15553-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate buffer solution, pH 5.2, 3 M (NaAc)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27810.295</td>
			<td>dissolve in nuclease-free H2O for 5&#160;M solution, sterile filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase (3&#39; phosphatase minus)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0236L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0204L</td>
			<td>supplied with PEG 8000 (50%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 DNA Polymerase (unmodified)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0274S</td>
			<td>supplied with 10x T7 DNA Polymerase Reaction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12090015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer F2.0</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5387000013</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous mapping and quantitation of ribonucleotides in human mitochondrial dna

النهج المتبعة لتقدير عدد ريبونوكليوتيديس موجودة في جينوم تقتصر على كوانتيتيشن ريبونوكليوتيديس إدراج استخدام أجزاء الحمض النووي الاصطناعية قصيرة أو والبلازميدات كقوالب واستقراء النتائج بأكملها ثم الجينوم. بدلاً من ذلك، يمكن تقدير عدد ريبونوكليوتيديس الموجودة في جينوم استخدام المواد الهلامية القلوية أو البقع الجنوبية. استخدام نهج أكثر حداثة في فيفو تسلسل الجيل التالي يسمح لرسم خرائط الجينوم على نطاق المنظومة ل ribonucleotides، توفير موقف وهوية ribonucleotides جزءا لا يتجزأ. ومع ذلك، لا تسمح كوانتيتيشن عدد من ريبونوكليوتيديس التي تدمج جينوم. هنا ونحن تصف كيفية خريطة وكوانتيتاتي عدد ريبونوكليوتيديس التي أدرجت في البشرية الميتوكوندريا الحمض النووي في فيفو بتسلسل الجيل المقبل في الوقت نفسه. نحن نستخدم الحمض النووي الغاية سليمة وإدخال تسلسل حبلا مزدوجة محددة فواصل بهضم ذلك مع اندونوكليسي، ريبونوكليوتيديس إدراج الترشيح في وقت لاحق مع القلوي. الغايات التي تم إنشاؤها هي متصلة مع محولات، وهذه الغايات هي متسلسلة على جهاز تسلسل جيل القادم. ويمكن حساب العدد المطلق ل ribonucleotides كعدد القراءات خارج الموقع الاعتراف الواحدة ومتوسط عدد القراء في موقع التسليم ل endonuclease محددة في التسلسل. هذا البروتوكول قد استخدمت أيضا لوضع خريطة وكوانتيتاتي نيكس مجاناً في الحمض النووي ويتيح تكييف لتعيين سائر الآفات الحمض النووي الذي يمكن معالجته إلى 5´--أوه الأهداف أو الغايات فوسفات 5´. وعلاوة على ذلك، يمكن تطبيق هذا الأسلوب لأي كائن حي، نظراً إلى أن يتوفر جينوم مرجعية مناسبة. ولذلك يوفر هذا البروتوكول أداة هامة دراسة تكرار الحمض النووي، وتجهيز 5´-نهاية، وتلف الحمض النووي، وإصلاح الحمض النووي.

توضيح المنهجية التي تم إنشاؤها البيانات الوارد وصفها أعلاه، والممثل بتحليل الحمض النووي البشري من هيلا الخلايا12. الشكل 2B يبين ما يلي موجز في جميع المواقع هينسيي في الثقيلة (HS) وحبلا الخفيفة (LS) من متدنا البشرية بعد العلاج بوكل (لوحات الأيسر). حوالي 70% من 5´ الكشف عن جميع-ينتهي المعربة بالقص المواقع، مما يدل على كفاءة عالية من هضم هينسي. علاج المكتبات مع كوه يتحلل الحمض النووي في ريبونوكليوتيديس جزءا لا يتجزأ يقلل عدد القراءات في مواقع هينسيي إلى حوالي 40% (الشكل 2B، لوحات الحق). هذا من المتوقع نظراً لإعداد كبيرة من 5´-ينتهي يتم إنشاؤها في مواقع ريبونوكليوتيدي التأسيس، ويدل على نوعية المكتبة كافية. الشكل 2 يوضح التعريب والتردد 5´-الغايات (الأخضر) بعد العلاج بوكل وما يلي: إنشاء التي يتميز-seq (أرجواني) بعد العلاج كوه، كشف نهايات 5´ الحرة والغايات التي تولدها التحلل القلوية في ريبونوكليوتيديس. ينتهي 5´ الحرة وإضفاء الطابع المحلي على النظام المنسق للبشرية متدنا ribonucleotides تظهر في اللوحة اليسرى وتلك الترجمة LS تظهر في اللوحة اليسرى. الإعداد النسبية ليقرأ الخام في ريبونوكليوتيديس (الشكل 2D، اللوحة العلوية) أو مواقع هينسيي (أسفل اللوحة) على النظام المنسق و LS متدنا تظهر، على التوالي، على تغطية أقوى معدل أو 31-fold لليرة بالنسبة إلى النظام المنسق، بينما لم يلاحظ وجود تحيز مماثلة الحمض النووي. يمكن تفسير ذلك بفرق واضح في تكوين قاعدة من شقين هذا التحيز حبلا ويوضح أهمية التطبيع ليقرأ في مواقع هينسي.
تطبيع قراءة التهم ليعطي هينسي مقياس كمي لعدد ريبونوكليوتيديس كل الجينوم المتقدرية (الشكل 3A). كما هو موضح في الشكل 3 (ب)، على ما يلي بعد تطبيع كوه في المعاملة لكل ريبونوكليوتيدي لتكوين تسلسل كل حبلا إظهار نسبة مختلفة من 1، مما يشير إلى توزيع غير عشوائي من اقتراح ribonucleotide متميزة على ما يلي نمط ونوعية عالية من مكتبة. هذه النسبة لا تتأثر بالهضم السابقة مع هينسي، التحقق من الانقسام وخصوصية إنزيم. تطبيع على ما يلي في مواقع ريبونوكليوتيديس المضمنة في مواقع الانقسام هينسيي، وكذلك مضمون النوكليوتيدات الجينوم، ينشئ مقياس كمي لإدراج كم من كل ريبونوكليوتيدي كل قواعد تكميلية 1,000 ( 3 الشكل).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56551/56551fig1.jpg"> 
رقم 1: التخطيطي للحمض النووي تجهيز وإعداد مكتبة. (1) هو المشقوق الحمض النووي كل من هينسي للتطبيع في كوانتيتيشن اللاحقة من ribonucleotides، توليد نهايات حادة في مواقع هينسي (السهم الأسود). (2 الحمض النووي) يتم التعامل مع كوه يتحلل في مواقع ريبونوكليوتيدي، مما يؤدي إلى 2´، فوسفات 3´ دوري (أحمر البنتاجون) في 3´-ينتهي وتنتهي أوه 5´ الحرة. (3) ينتهي 5´--يا هي فوسفوريلاتيد من T4 بولينوكليوتيدي كيناز 3´-الفوسفاتيز-ناقص. (4) جميع الغايات 5´ تحمل مجموعة فوسفات هي متصلة إلى اليغنوكليوتيد ARC140 بالحمض النووي الريبي T4 ليجاسى. (5) الطريقة الثانية يتم تصنيعه استخدام T7 دنا بوليميريز والنوكليوتيد ARC76-77 التي تحتوي على تسلسلات6 N عشوائي. (6) مكتبة يتم تضخيمه من قبل بوليميريز الحمض النووي عالية الدقة استخدام ARC49 ومن ARC78 إلى ARC107 الإشعال الفهرس الذي يحتوي على رمز شريطي فريد للإرسال المتعدد. (7) وتقع 5´-ينتهي من إقران نهاية التسلسل. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56551/56551fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56551/56551fig2.jpg"> 
رقم 2: أسلوب التحقق من الصحة- اليكتروفيروجرامس الممثل (A) التي تم إنشاؤها باستخدام نظام التفريد الآلي لتحديد النوعية إنشاء مكتبات تعامل مع إشارة كوه أو بوكل. (ب) سوماريزيد في مواقع هينسي الثقيلة (HS) وحبلا الخفيفة (LS) متدنا البشرية بعد بوكل (لوحات اليسار) أو العلاج كوه (لوحات الحق). سيركوس (ج) الرقم مجاناً 5´-الغايات (الأخضر) ومن يتميز-Seq (ينتهي 5´ الحرة و ribonucleotides، أرجواني) في النظام المنسق (اللوحة اليمنى) ومتدنا البشرية ليرة سورية (اللوحة اليمنى). تطبيع الذروة لكل القراءات مليون ويتم ضبط الذروة القصوى للحد الأقصى لعدد القراءات المكتبة يتميز seq. (د) سوماريزيد الخام يقرأ في ريبونوكليوتيديس (اللوحة العلوية) ومواقع هينسي (أسفل اللوحة) في الثقيلة (ح) والضوء (L) حبلا في متدنا البشرية (ميتو.) أو في الاتجاه المعاكس (RV) أو حبلا (مهاجم) إلى الأمام في النووي (نشاط). الحمض النووي. الأشكال ب وج ود مقتبسة من مرجع12. أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للوسط. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56551/56551fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56551/56551fig3.jpg"> 
الشكل 3: نتائج الممثل. (أ) نسبة عدد ribonucleotides تطبيعها بما يلي في مواقع هينسيي للمكتبات كوه تعامل الثقيلة (ح) أو حبلا الضوء (L). (ب) نسبة الهوية ريبونوكليوتيدي لتكوين جينوم متدنا لكوة تعامل (كوه) وهينسيي المشقوق مع كوه تعامل (هينسيي + كوه) مكتبات في الثقيلة (ح) أو الخفيفة (L) حبلا من متدنا. (ج) تواتر Ribonucleotide تطبيع إلى 1,000 قواعد مكملة للتعامل مع المكتبات على الثقيلة (ح) أو حبلا الضوء (L) من متدنا هينسيي وكوه. والأرقام مقتبسة من مرجع12. أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للوسط. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56551/56551fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>الاسم</td>
			<td colspan="4">التسلسل</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC49</td>
			<td colspan="4">آتجاتاكجكجاككاككجاجاتكتاكاكتكتتكككتاكاكجاكجكتكتككجاتكت</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC76</td>
			<td colspan="4">جتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكتNNNN * N * N</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC77</td>
			<td colspan="4">أجاتكجاجاجكاكاكجتكتجاكتككاجتك * أ * ج</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC78</td>
			<td colspan="4">كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتكجتجاتجتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC84</td>
			<td colspan="4">كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتأكاتكججتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC85</td>
			<td colspan="4">كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتجككتاجتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC86</td>
			<td colspan="4">كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتتجتكاجتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC87</td>
			<td colspan="4">كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتكاكتجتجتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجا</td></tr></tbody></table>TCT
		
		<tr>
			<td>ARC88</td>
			<td colspan="4">كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتأتتجكجتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC89</td>
			<td colspan="4">كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتجاتكتججتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC90</td>
			<td colspan="4">كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتتكاجتجتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC91</td>
			<td colspan="4">كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتكتجاتكجتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC93</td>
			<td colspan="4">كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتآجكتاجتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC94</td>
			<td colspan="4">كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتجتاجككجتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC95</td>
			<td colspan="4">كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتتاكاججتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC96</td>
			<td colspan="4">كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتتجتجاكتجتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC97</td>
			<td colspan="4">كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتأكجاكتجتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC98</td>
			<td colspan="4">كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتتكتجاكاتجتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC99</td>
			<td colspan="4">كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتكججاكججتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC100</td>
			<td colspan="4">كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتجتجكجاكجتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC101</td>
			<td colspan="4">كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتكجتتكاكجتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC102</td>
			<td colspan="4">كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتآجككاكجتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC103</td>
			<td colspan="4">كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتتككجااكجتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC104</td>
			<td colspan="4">كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتتاكجتاكججتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC105</td>
			<td colspan="4">كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتأتككاكتكجتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC106</td>
			<td colspan="4">كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتأتاتكاجتجتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC107</td>
			<td colspan="4">كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتآآجاتجتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC140</td>
			<td colspan="4">/5AmMC6/أكاكتكتتكككتاكاكجاكجكتكتككجاتكت</td>
		</tr>
	

الجدول 1: النوكليوتيد. وترد النوكليوتيد المستخدمة لما يليها يتميز الوجه غامق يشير إلى الفهرسة. * يشير إلى سند فوسفوروثيواتي. ARC140 تحتوي على مجموعة أمينية 5´ بدلاً من مجموعة 5´--أوه، بالاقتران مع رابط C6. ويقلل هذا التعديل تشكيل كونكاتيميرس ARC140 أثناء عملية ربط.

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Mapping and Quantitation of Ribonucleotides in Human Mitochondrial DNA at JoVE.com

Simultaneous Mapping and Quantitation of Ribonucleotides in Human Mitochondrial DNA

المتزامن لرسم الخرائط وكوانتيتاتيون من ريبونوكليوتيديس في الحمض النووي البشري

هنا يصف لنا طريقة قابلة كوانتيتاتي في نفس الوقت وخريطة الجينوم المنظومة ريبونوكليوتيديس في الحمض النووي سليمة جداً في قرار واحد-النوكليوتيدات، الجمع بين الانقسام الانزيمية للحمض النووي بالتحلل المائي القلوي واللاحقة في نهاية 5´ التسلسل.

Established approaches to estimate the number of ribonucleotides present in a genome are limited to the quantitation of incorporated ribonucleotides using ...

Research

JoVE Journal

Biology

Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

سبر للنشاط مجمع الميتوكوندريا في خلايا المنشأ الجنينية البشرية

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

رسم مصير الخلايا الجذعية الجنينية البشرية من خلال تكوين ورم مسخي

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Tissue Samples

الكميات بؤر γH2AX في عينات الأنسجة

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

انتقائية لقطة من hydroxymethylcytosine-5 من الحمض النووي الجيني

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

عزل Myocytes الأذيني الإنسان للقياسات في وقت واحد من الكالسيوم<sup&gt; 2 +</sup&gt; العابرون والتيارات غشاء

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

التصوير في الوقت الحقيقي من واحدة المهندسة رنا النصوص في الخلايا الحية عن طريق Ratiometric ثنائي الجزيء منارات

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

الكميات من البطانية الإلتصاق الخليوي<em&gt; في المختبر</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

على صعيد رسم الخرائط الجينوم من المخدرات-DNA التفاعلات في الخلايا مع COSMIC (يشابك من الجزيئات الصغيرة لعزل لونين)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

DamID وما يليها: رسم خرائط الجينوم على نطاق التفاعلات البروتين DNA بواسطة إنتاجية عالية تسلسل شظايا الحمض النووي ميثليته الأدينين

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...