Name: simultaneous mapping and quantitation of ribonucleotides in human mitochondrial dna
Uploaded: 2017-11-14T13:00:00
Duration: 12 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Mapping and Quantitation of Ribonucleotides in Human Mitochondrial DNA at JoVE.com

इस अध्ययन के द्वारा समर्थित किया गया स्वीडिश अनुसंधान परिषद (www.vr.se) एआरसी को अनुदान (2014-6466 और स्वीडन फाउंडेशन के लिए सामरिक अनुसंधान (www.stratresearch.se) एआरसी (ICA14-0060). Chalmers यूनिवर्सिटी ऑफ टेक्नोलॉजी ने इस कार्य के दौरान MKME को वित्तीय सहायता प्रदान की. funders अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि की तैयारी में कोई भूमिका नहीं थी ।

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	<li>Traut, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+Concentrations+of+Purines+and+Pyrimidines.">Physiological Concentrations of Purines and Pyrimidines.</a> Mol. Cell. Biochem. 140, 1-22 (1994).</li><li>McElhinny, S. A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abundant+ribonucleotide+incorporation+into+DNA+by+yeast+replicative+polymerases.">Abundant ribonucleotide incorporation into DNA by yeast replicative polymerases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 4949-4954 (2010).</li><li>Williams, J. S., Lujan, S. A., Kunkel, T. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlocking+the+Sugar+"Steric+Gate"+of+DNA+Polymerases.">Unlocking the Sugar "Steric Gate" of DNA Polymerases.</a> Biochemistry. 50, 1135-1142 (2011).</li><li>Sparks, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNase+H2-Initiated+Ribonucleotide+Excision+Repair.">RNase H2-Initiated Ribonucleotide Excision Repair.</a> Mol. Cell. 47, 980-986 (2012).</li><li>Miyabe, I., Kunkel, T. A., Carr, A. 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लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

यहां हम एक तकनीक वर्तमान के लिए एक साथ नक्शा और gDNA में ribonucleotides मात्रा, और विशेष रूप से mtDNA, डीएनए दरार की सरल परिचय द्वारा जीनोम में अनुक्रम विशिष्ट साइटों में स्थापित HydEn-seq प्रोटोकॉल के लिए एक अतिरिक्त के रूप में । हालांकि यह अध्ययन मानव mtDNA पर केंद्रित है, मूल रूप से HydEn-seq विधि Saccharomyces cerevisiaeमें विकसित किया गया था, अन्य जीवों के लिए विधि का अनुवाद12illustrating,16.
विश्वसनीय परिणाम इस दृष्टिकोण से प्राप्त करने के लिए, कुछ महत्वपूर्ण कदम नोट किया जाना चाहिए: (क) sequencing एडेप्टर ligate सभी उपलब्ध 5 ´-सिरों के बाद से, यह अत्यधिक बरकरार डीएनए के साथ काम करने के लिए महत्वपूर्ण है । डीएनए अलग किया जाना चाहिए और पुस्तकालयों अधिमानतः डीएनए अलगाव के बाद तुरंत किया जाना चाहिए, या डीएनए-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है । यह अनुशंसित नहीं है कि लंबे समय तक डीएनए को फ्रिज में स्टोर कर कर रखें या बार में फ्रीज करके उसे गल जाए । (ख) इस विधि के साथ उपयुक्त पुस्तकालयों उत्पंन करने के लिए, यह एक मशीन ओवन में डीएनए के KOH उपचार प्रदर्शन महत्वपूर्ण है, बल्कि एक हीटिंग ब्लॉक से, पूरे नमूने और मात्रात्मक hydrolysis के समरूप हीटिंग आश्वस्त । (ग) इसके अलावा, यह पूलिंग और अनुक्रमण से पहले पुस्तकालयों की गुणवत्ता को नियंत्रित करने के लिए महत्वपूर्ण है । डीएनए मात्रा और एक स्वचालित ट्रो प्रणाली का उपयोग कर पुस्तकालय डीएनए की पर्याप्त मात्रा में सुनिश्चित करने के लिए विश्लेषण किया जाना चाहिए, उचित टुकड़ा आकार की पुष्टि करें, और प्राइमरी dimers के लिए जांच करें ।
एक सार्थक डेटा विश्लेषण के लिए, यह भी ध्यान दें कि इस विधि के जानकारीपूर्ण मूल्य पृष्ठभूमि गिनती और अनुक्रम या किनारा पूर्वाग्रहों का आकलन करने के लिए उपयुक्त नियंत्रण पर निर्भर है महत्वपूर्ण है । हम नियमित रूप से ७०% के करीब के KCl नमूनों में एक मानचित्रण दक्षता प्राप्त जब केवल अनुक्रम विशिष्ट endonuclease के साथ पचा (चित्र b, बाएं पैनलों) । इसके अलावा, यह पुष्टि करने के लिए महत्वपूर्ण है कि endonuclease उपचार HincII इलाज और अनुपचारित नमूनों (चित्र बी) की तुलना द्वारा शामिल ribonucleotides का समग्र पता लगाने को प्रभावित नहीं कर रहा है। इन प्रयोगों में, हम HincII उपयोग किया है साइट विशिष्ट कटौती परिचय, हालांकि अंय उच्च निष्ठा प्रतिबंध एंजाइमों भी इस्तेमाल किया जा सकता है ।
प्रोटोकॉल के लिए डीएनए घावों कि 5 ´-फॉस्फेट या 5 ´-ओह समाप्त होता है संसाधित किया जा सकता है के अंय प्रकार के अध्ययन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । परिणामों की सटीकता प्रसंस्करण की विशिष्टता पर निर्भर है और सत्यापन के लिए उपयुक्त नियंत्रण (जैसे, जंगली प्रकार या अनुपचारित) की आवश्यकता है । इसके अलावा, जब अन्य अनुप्रयोगों के लिए या अन्य जीवों के साथ उपयोग करने के लिए इस विधि के अनुकूल है, एक विचार करना चाहिए कि अपने वर्तमान सेटअप में विधि डीएनए के बारे में 1 µ जी जो एक पुस्तकालय के लिए संसाधित है की आवश्यकता है । सिरों की संख्या के बाद से एम्बेडेड ribonucleotides की संख्या पर निर्भर है, जो जीव या उत्परिवर्ती पर निर्भर करता है, ribonucleotides की एक कम संख्या सहित नमूने अधिक इनपुट डीएनए की आवश्यकता होती है में समाप्त होता है की एक पर्याप्त संख्या उत्पन्न करने के लिए बाद में पुस्तकालय निर्माण । इसी तरह, यदि डीएनए नमूनों ribonucleotides की एक बहुत अधिक संख्या है, यह भी कम इनपुट डीएनए का उपयोग करने के लिए बंधाव, दूसरा किनारा संश्लेषण के लिए इष्टतम स्थिति प्राप्त करने की आवश्यकता होगी, और पीसीआर प्रवर्धन । यह उल्लेखनीय है कि इस प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में पुस्तकालय निर्माण भी परमाणु जीनोम को कवर डेटा उत्पंन (जैसा कि चित्र 2dमें प्रदर्शित) और केवल डेटा विश्लेषण mtDNA पर ध्यान केंद्रित किया गया । यह दिखाता है कि मामूली कम ribonucleotide आवृत्तियों के साथ बड़े जीनोम भी इस विधि द्वारा कब्जा कर रहे हैं ।
जब इस विधि पर विचार, कुछ सीमाओं को ध्यान में रखा जाना चाहिए: हालांकि इस विधि चाहिए, सिद्धांत रूप में, वस्तुतः किसी भी जीव के लिए लागू हो, एक उपयुक्त संदर्भ जीनोम पढ़ता के संरेखण के लिए आवश्यक है । इसके अलावा, हमारे प्रोटोकॉल से प्राप्त परिणामों का प्रतिनिधित्व कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या से पढ़ता है । कक्षों के सबसेट की विशिष्ट ribonucleotide निगमन प्रतिमान इस approach द्वारा पहचाना नहीं जा सकता । यदि ribonucleotides ribonucleotides की एक बहुत कम संख्या के साथ बड़े जीनोम में मैप कर रहे हैं, यह यादृच्छिक निक से भेदभाव ribonucleotides के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है और उचित नियंत्रण इसलिए की जरूरत है ।
विधि हम यहां का वर्णन है, जैसे HydEn-Seq16, Ribose-Seq17, पु-Seq18, या emRiboSeq19के रूप में vivo तकनीकों में उपलब्ध फैली हुई है । इन दृष्टिकोणों को क्षारीय या RNase H2 उपचार के लिए एंबेडेड ' ribonucleotides संवेदनशीलता का लाभ ले, क्रमशः, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण को रोजगार के लिए ribonucleotides जीनोम की पहचान चौड़ा है, जो उनके मानचित्रण और की तुलना की अनुमति देता है संबंधित शामिल है । डीएनए अनुक्रम सट द्वारा विशेष रूप से, के रूप में ऊपर वर्णित है, एंबेडेड ribonucleotides में alkaline hydrolysis के अलावा, ribonucleotides के लिए पढ़ता उन दरार साइटों को सामान्यीकृत किया जा सकता है, न केवल पहचान और मानचित्रण की अनुमति ribonucleotides, लेकिन यह भी एक डीएनए अणु के लिए उनके quantitation । डीएनए प्रतिकृति, डीएनए की मरंमत, और TLS से संबंधित रोगों के संदर्भ में हमारी तकनीक का आवेदन सामांय में अंतर्निहित आणविक तंत्र और जीनोम अखंडता में ribonucleotides की भूमिका की गहरी समझ प्रदान कर सकता है ।

एक युकेरियोटिक कोशिका में, ribonucleotides (rNTPs) की एकाग्रता deoxyribonucleotides (dNTPs)1की एकाग्रता की तुलना में बहुत अधिक है । डीएनए ribonucleotides के खिलाफ भेदभाव polymerases, लेकिन यह भेदभाव सही नहीं है और, एक परिणाम के रूप में, ribonucleotides के बजाय deoxyribonucleotides डीएनए प्रतिकृति के दौरान जीनोम में शामिल किया जा सकता है । Ribonucleotides सबसे आम गैर-विहित न्यूक्लियोटाइड जीनोम में शामिल किया जा सकता है2। इन ribonucleotides से अधिकांश Okazaki टुकड़ा परिपक्वता के दौरान RNase H2 शुरू ribonucleotide उत्पाद शुल्क मरंमत (RER) द्वारा या तोपोइसोमेरसे 1 (संदर्भ में समीक्षित3) हटा रहे हैं । Ribonucleotides कि हटाया नहीं जा सकता है छुरा डीएनए2,4 में शामिल किया है और यह दोनों हानिकारक और लाभप्रद तरीके में प्रभावित (समीक्षा की समीक्षा की5में) हो सकता है । इसके अलावा सकारात्मक संकेतों के रूप में कार्य करने में सक्षम किया जा रहा है, उदाहरण के लिए में संभोग प्रकार स्विच में Schizosaccharomyces pombe6 और बेमेल मरंमत के दौरान नवजात डीएनए किनारा अंकन (एमएमआर)7,8, ribonucleotides को प्रभावित संरचना9 और आसपास के 2 ´-हाइड्रॉक्सिल समूह के कारण डीएनए की स्थिरता उनके ribose10, प्रतिकृति तनाव और जीनोम अस्थिरता में जिसके परिणामस्वरूप11. जीनोमिक डीएनए में ribonucleotides की बहुतायत (gDNA) और प्रतिकृति और मरंमत तंत्र में उनकी प्रासंगिकता, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जीनोम स्थिरता के लिए निहितार्थ, कारण उनके सटीक घटना और एक जीनोम में व्यापक तरीके से आवृत्ति की जांच दे ।
RNase H2 गतिविधि मानव mitochondria में नहीं पाया गया है और ribonucleotides इसलिए कुशलतापूर्वक mitochondrial डीएनए (mtDNA) में नहीं हटा रहे हैं । कई रास्ते मानव mitochondria को न्यूक्लियोटाइड की आपूर्ति में शामिल है और जांच करने के लिए कि mitochondrial न्यूक्लियोटाइड पूल में गड़बड़ी मानव ribonucleotides में mtDNA का एक ऊंचा संख्या का कारण है, हम नक्शे और quantitate के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित मानव mtDNA में ये ribonucleotides fibroblasts, हेला कोशिकाओं, और रोगी कोशिका लाइनों12से पृथक ।
इन विट्रो में अधिकांश दृष्टिकोण (समीक्षा13में) डीएनए polymerases ' selectivity के खिलाफ rNTPs का निर्धारण करने के लिए एकल ribonucleotide प्रविष्टि या प्राइमर विस्तार प्रयोगों पर आधारित है जहां प्रतिस्पर्धा rNTPs प्रतिक्रिया में शामिल हैं मिश्रण, कम डीएनए में पहचान या ribonucleotide निगमन के रिश्तेदार quantitation टेंपलेट्स की अनुमति । कम दृश्यों पर मात्रात्मक दृष्टिकोण dNTP और rNTP पूल सेलुलर सांद्रता पर प्रतिबिंबित नहीं हो सकता है और इसलिए पोलीमरेज़ selectivity में अंतर्दृष्टि प्रदान लेकिन सीमित पूरे जीनोम के बारे में महत्व के हैं । यह दिखाया गया है कि एक लंबे समय तक डीएनए टेम्पलेट, जैसे एक प्लाज्मिड, की प्रतिकृति के दौरान शामिल ribonucleotides की सापेक्ष मात्रा radiolabeled dNTPs का उपयोग कर एक sequencing जेल पर visualized किया जा सकता और एक क्षारीय hydrolyzing में डीएनए वातावरण14. इसके अलावा, gDNA दक्षिणी दाग पर क्षारीय hydrolysis निंनलिखित विश्लेषण किया गया है, कतरा-विशिष्ट जांच और vivo15में ribonucleotide निगमन की निरपेक्ष दरों के निर्धारण की अनुमति । इन दृष्टिकोणों निगमन आवृत्ति के एक रिश्तेदार की तुलना लेकिन स्थिति या शामिल ribonucleotides की पहचान में कोई अंतर्दृष्टि देने की अनुमति देते हैं । HydEn-Seq16, Ribose-Seq17, पु-Seq18, या emRiboSeq19, जैसे vivo मेंgDNA में ribonucleotide सामग्री का विश्लेषण करने के लिए नवीनतम approaches एंबेडेड ribonucleotides का लाभ उठाएं ' क्षारीय या RNase H2 उपचार के लिए संवेदनशीलता, क्रमशः, और ribonucleotides जीनोम चौड़ा की पहचान करने के लिए अगली पीढ़ी अनुक्रमण को रोजगार । इन विधियों का पता लगाया ribonucleotides के निरपेक्ष शामिल आवृत्ति में अंतर्दृष्टि प्रदान नहीं करते । HydEn-seq प्रोटोकॉल के अनुक्रम विशिष्ट एंजाइमी दरार के कदम जोड़कर, विधि हम यहाँ का वर्णन आसानी से जानकारी एक अनुक्रमण दृष्टिकोण से प्राप्त फैली हुई है, एक साथ मानचित्रण और quantitation की अनुमति एम्बेडेड ribonucleotides12. इस पद्धति को वस्तुतः किसी भी जीव दिया है कि अत्यधिक बरकरार डीएनए निष्कर्षों और उत्पंन किया जा सकता है एक उपयुक्त संदर्भ जीनोम उपलब्ध है लागू है । विधि quantitate के लिए अनुकूलित किया जा सकता है और किसी भी घाव है कि एक nuclease द्वारा पचा जा सकता है और एक 5 ´-फॉस्फेट या एक 5 ´-ओह अंत पत्ते के स्थान का निर्धारण ।
मैप करने के लिए और जीनोमिक डीएनए में ribonucleotides quantitate, विधि एक अनुक्रम विशिष्ट endonuclease द्वारा दरार को जोड़ती है और क्षारीय hydrolysis 5 ´-फास्फेट साइटों पर समाप्त होता है जहां endonuclease के लिए विशिष्ट मान्यता अनुक्रम स्थित है और 5 ´- ओह, जहां ribonucleotides स्थित थे पदों पर समाप्त होता है । के बाद से उत्पंन मुक्त समाप्त होता है बाद एडेप्टर के साथ ligated और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण का उपयोग अनुक्रम, यह महत्व का है अत्यधिक बरकरार डीएनए का उपयोग करें और डीएनए निष्कर्षण और पुस्तकालय की तैयारी के दौरान यादृच्छिक विखंडन से बचें । इन पढ़ता का आकलन करने के लिए सामान्यीकृत endonuclease दरार साइटों पर पढ़ता एक साथ quantitation और पता लगाया ribonucleotides के मानचित्रण की अनुमति देता है. नि: शुल्क 5 ´-सिरों नियंत्रण प्रयोगों में पता चला है जहां डीएनए के क्षारीय hydrolysis KCl के साथ इलाज के द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है । अधिग्रहीत डेटा ribonucleotide स्थान और मात्रा में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं और ribonucleotide सामग्री और निगमन आवृत्ति के संबंध में विश्लेषण की अनुमति देता है.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x T4 RNA Ligase Reaction Buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0216L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>Medicago</td>
			<td>09-9400-100</td>
			<td>dissolve 1 tablet in H2O to a final volume of 1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>33539-1L-GL-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2940CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-0610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-Triphosphate (ATP, 10 mM)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P0756S</td>
			<td>dilute with EB to 2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 1000 Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-1504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, Molecular Biology Grade (20 mg/mL)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9000S</td>
			<td>diltue with nuclease-free H2O to 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer EB</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>19086</td>
			<td>referred to as EB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CleanPCR paramagnetic beads</td>
			<td>CleanNA</td>
			<td>CPCR-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix (10 mM each)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0447L</td>
			<td>dilute with EB to 2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61965026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag 96 Side</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12331D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 99.5% analytical grade</td>
			<td>Solveco</td>
			<td>1395</td>
			<td>dilute with milliQ water to 70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA, 0.5 M)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03690-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer pH 8.0 (1 M) sterile BC</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A6906,0125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexammine cobalt(III) chloride (CoCl3(NH3)6)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7891-5G</td>
			<td>dissolve in nuclease-free H2O for 10&#160;M solution, sterile filter. CAUTION: carcinogenic, sensitizing and hazardous to aquatic environment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HincII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0103S</td>
			<td>supplied with NEBuffer 3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridiser HB-1D</td>
			<td>Techne</td>
			<td>FHB4DD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK2602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mM EDTA, 20 mM HEPES, NaCl 75 mM, Proteinase K (200 &#181;g/mL), 1% SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tube 1.5 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge 5424R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5404000014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge MiniStar silverline</td>
			<td>VWR</td>
			<td>521-2844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiply&#160;&#181;StripPro 0.2 mL tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.991.992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol &#8211; chloroform &#8211; isoamyl alcohol (25:24:1)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>77617-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>26764.232</td>
			<td>dissolve in nuclease-free H2O for 3&#160;M solution, sterile filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>26668.296</td>
			<td>dissolve in nuclease-free H2O for 3&#160;M solution, sterile filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q33216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay Tubes</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32850</td>
			<td>CAUTION: Contains flammable and toxic components</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32851</td>
			<td>CAUTION: Contains flammable and toxic components</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge 4K15</td>
			<td>Sigma Laboratory Centrifuges</td>
			<td>No. 10740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS Solution, 10%</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15553-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate buffer solution, pH 5.2, 3 M (NaAc)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27810.295</td>
			<td>dissolve in nuclease-free H2O for 5&#160;M solution, sterile filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase (3&#39; phosphatase minus)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0236L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0204L</td>
			<td>supplied with PEG 8000 (50%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 DNA Polymerase (unmodified)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0274S</td>
			<td>supplied with 10x T7 DNA Polymerase Reaction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12090015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer F2.0</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5387000013</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous mapping and quantitation of ribonucleotides in human mitochondrial dna

एक जीनोम में मौजूद ribonucleotides की संख्या का अनुमान करने के लिए स्थापित दृष्टिकोण लघु सिंथेटिक डीएनए टुकड़े या plasmids के रूप में ribonucleotides का उपयोग कर शामिल की quantitation तक ही सीमित हैं और फिर पूरे करने के लिए परिणाम extrapolating जीनोम. वैकल्पिक रूप से, एक जीनोम में मौजूद ribonucleotides की संख्या alkaline जैल या दक्षिणी दाग का उपयोग कर अनुमान लगाया जा सकता है । अधिक vivo दृष्टिकोण में हाल ही में अगले पीढ़ी ribonucleotides के जीनोम-वाइड मानचित्रण, स्थिति और एंबेडेड ribonucleotides की पहचान प्रदान करने की अनुमति अनुक्रमण काम । हालांकि, वे ribonucleotides जो एक जीनोम में शामिल कर रहे है की संख्या के quantitation की अनुमति नहीं है । यहां हम कैसे एक साथ नक्शा और ribonucleotides जो मानव mitochondrial डीएनए में अगली पीढ़ी के अनुक्रमण द्वारा vivo में शामिल कर रहे है की संख्या quantitate का वर्णन । हम अत्यधिक बरकरार डीएनए का उपयोग करें और यह एक endonuclease के साथ पचा द्वारा अनुक्रम विशिष्ट डबल किनारा टूटता परिचय, बाद में क्षार के साथ ribonucleotides शामिल hydrolyzing । जनरेट किया गया समाप्त होता है एडेप्टर के साथ ligated और इन सिरों पर एक अगली पीढ़ी sequencing मशीन अनुक्रम हैं । ribonucleotides की निरपेक्ष संख्या अनुक्रम विशिष्ट endonuclease के लिए मान्यता साइट पर पढ़ता की औसत संख्या प्रति मान्यता साइट के बाहर पढ़ता की संख्या के रूप में परिकलित किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल को भी नक्शा और डीएनए में quantitate मुक्त निक का उपयोग किया जा सकता है और अनुकूलन के लिए अंय डीएनए घावों कि 5 ´ को संसाधित किया जा सकता है नक्शा करने की अनुमति देता है-ओह समाप्त होता है या 5 ´-फास्फेट समाप्त होता है । इसके अलावा, इस विधि किसी भी जीव को लागू किया जा सकता है, यह देखते हुए कि एक उपयुक्त संदर्भ जीनोम उपलब्ध है । इस प्रोटोकॉल इसलिए डीएनए प्रतिकृति, 5 ´-अंत प्रसंस्करण, डीएनए क्षति, और डीएनए की मरंमत का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान करता है ।

उपर्युक्त पद्धति का वर्णन करते हुए, प्रतिनिधि डेटा हेला कोशिकाओं12से मानव mitochondrial डीएनए का विश्लेषण उत्पंन किया गया । चित्रा बी + KCl उपचार (बाएँ पैनलों) के बाद मानव mtDNA के भारी (एच एस) और प्रकाश कतरा (एलएस) में सभी HincII साइटों पर संक्षेप में पढ़ता है दिखाता है । लगभग ७०% का पता चला 5 ´-सिरों को स्थानीयकरण कट-साइटों, HincII पाचन की उच्च दक्षता का प्रदर्शन । KOH के साथ पुस्तकालयों के इलाज के लिए एंबेडेड ribonucleotides पर डीएनए hydrolyze के बारे में ४०% के लिए HincII साइटों पर पढ़ता है की संख्या घट जाती है (चित्र b, सही पैनल) । इस के बाद से बड़ी संख्या में उंमीद है 5 ´-सिरों ribonucleotide निगमन की साइटों पर उत्पंन कर रहे हैं, और एक पर्याप्त पुस्तकालय गुणवत्ता का संकेत है । चित्रा 2c स्थानीयकरण और 5 ´ की आवृत्ति-सिरों (हरा) KCl उपचार के बाद और HydEn-seq (रानी) द्वारा KOH उपचार के बाद उत्पन्न पढ़ता है, दोनों का पता लगाने के 5 ´-समाप्त होता है और समाप्त होता है ribonucleotides क्षारीय hydrolysis द्वारा उत्पन्न होता है । नि: शुल्क 5 ´-समाप्त होता है और ribonucleotides स्थानीयकरण मानव mtDNA के एच एस करने के लिए छोड़ दिया पैनल में दिखाए जाते हैं और उन स्थानीयकरण रास के लिए सही पैनल में दिखाए जाते हैं. रॉ के सापेक्ष संख्या ribonucleotides पर पढ़ता है (चित्रा 2d, ऊपरी पैनल) या HincII साइटें (लोअर पैनल) पर एच एस और mtDNA दिखाएं, क्रमशः, एक 14 गुना या 31 गुना की मजबूत कवरेज एच एस के सापेक्ष ls, जबकि एक समान पूर्वाग्रह के लिए नहीं देखा गया था परमाणु डीएनए । इस किनारा पूर्वाग्रह दो किस्में के आधार संरचना में अलग अंतर से समझाया जा सकता है और सामांय के महत्व को दिखाता है HincII साइटों पर पढ़ता है ।
HincII को पढ़ने के मायने सामांय mitochondrial जीनोम प्रति ribonucleotides की संख्या का एक मात्रात्मक उपाय देता है (चित्र 3) । के रूप में चित्र 3 बीमें सचित्र, प्रत्येक कतरा के अनुक्रम संरचना को सामान्यीकृत ribonucleotide के लिए KOH उपचार के बाद पढ़ता है एक अनुपात 1 से अलग दिखाने के एक गैर यादृच्छिक वितरण का संकेत है, एक विशिष्ट ribonucleotide सुझाव पैटर्न और एक उच्च पुस्तकालय की गुणवत्ता । यह अनुपात HincII के साथ पिछले पाचन से अप्रभावित है, एंजाइम दरार विशिष्टता की पुष्टि । सामांय HincII दरार साइटों पर उन लोगों के लिए एंबेडेड ribonucleotides की साइटों पर पढ़ता है, साथ ही साथ जीनोम न्यूक्लियोटाइड सामग्री के लिए, प्रत्येक ribonucleotide के कितने के एक मात्रात्मक उपाय उत्पंन १,००० पूरक कुर्सियां प्रति शामिल है ( चित्र 3सी) ।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56551/56551fig1.jpg"> 
चित्रा 1: डीएनए प्रसंस्करण और पुस्तकालय की तैयारी के लिए योजनाबद्ध । (1) पूरे जीनोमिक डीएनए ribonucleotides के बाद के quantitation में सामान्यीकरण के लिए HincII द्वारा सट जाता है, HincII साइटों (ब्लैक ऐरोहेड) पर कुंद समाप्त होता है पैदा. (2) डीएनए ribonucleotide साइटों पर hydrolyze के लिए KOH के साथ इलाज किया है, 2 ´ के लिए अग्रणी, 3 ´-चक्रीय फॉस्फेट (लाल पेंटागन) पर 3 ´-समाप्त होता है और नि: शुल्क 5 ´-ओह समाप्त होता है । (3) 5 ´-ओह समाप्त होता है टी-4 Polynucleotide कळेनासे 3 ´-फॉस्फेट-शूंय से phosphorylated हैं । (4) सभी 5 ´-एक फॉस्फेट समूह ले जाने समाप्त होता है टी 4 आरएनए ligase द्वारा ARC140 oligonucleotide के लिए ligated हैं. (५) दूसरा किनारा T7 डीएनए पोलीमरेज़ और ARC76-७७ oligonucleotides युक्त यादृच्छिक एन६ दृश्यों का उपयोग कर संश्लेषित किया जाता है. (6) पुस्तकालय एक उच्च निष्ठा डीएनए पोलीमरेज़ से परिलक्षित होता है ARC49 का उपयोग कर और ARC78 में से एक के लिए मल्टीप्लेक्सिंग के लिए एक अद्वितीय बारकोड युक्त सूचकांक प्राइमर ARC107 । (7) 5 ´-छोर युग्मित अंत अनुक्रमण द्वारा स्थित हैं । <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56551/56551fig1large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56551/56551fig2.jpg"> 
चित्र 2: विधि मांयता. (एक) प्रतिनिधि electropherograms KOH या KCl के साथ इलाज उत्पंन पुस्तकालयों की गुणवत्ता का निर्धारण करने के लिए एक स्वचालित ट्रो प्रणाली का उपयोग कर उत्पन्न । (ख) भारी (एच एस) और प्रकाश कतरा (एलएस) में HincII साइटों पर संक्षेप संकेत KCl (बाएँ पैनलों) या KOH (सही पैनलों) उपचार के बाद मानव mtDNA । (ग) Circos का आंकड़ा नि: शुल्क 5 ´-सिरों (हरा) और HydEn-Seq (फ्री 5 ´-सिरों और ribonucleotides, रानी) से एच एस (बाएं पैनल) और एलएस (दाएँ पैनल) मानव mtDNA में है । चोटियों प्रति मिलियन पढ़ता है और अधिकतम चोटी HydEn-seq पुस्तकालय के पढ़ता की अधिकतम संख्या के लिए समायोजित किया जाता है के लिए सामान्यीकृत हैं । (घ) संक्षेप में रॉ ribonucleotides पर पढ़ता है (ऊपरी पैनल) और HincII साइटों (निचले पैनल) में भारी (एच) और प्रकाश (एल) मानव mtDNA में कतरा (मिळो.) या रिवर्स में (RV) या अग्रेषित (अग्रेषित करें) कतरा में परमाणु (Nuc.) डीएनए. आंकड़े बी, सी और डी12संदर्भ से अनुकूलित कर रहे हैं । त्रुटि पट्टियां माध्य की मानक त्रुटि दर्शाती हैं । <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56551/56551fig2large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56551/56551fig3.jpg"> 
चित्र 3: प्रतिनिधि परिणाम । (क) ribonucleotides के सापेक्ष संख्या भारी (एच) या प्रकाश (एल) किनारा पर KOH इलाज पुस्तकालयों के लिए HincII साइटों पर पढ़ता सामान्यीकृत । (ख) कोह इलाज के लिए mtDNA जीनोम संरचना के लिए ribonucleotide पहचान का अनुपात (कोह) और HincII (एच) भारी (ज) या प्रकाश (एल) mtDNA के कतरा पर koh इलाज (HincII + koh) पुस्तकालयों के साथ सट । (ग) Ribonucleotide आवृत्ति भारी (एच) या प्रकाश (एल) mtDNA के कतरा पर HincII और KOH इलाज पुस्तकालयों के लिए १,००० पूरक कुर्सियां के लिए सामान्यीकृत । आंकड़े12संदर्भ से अनुकूलित कर रहे हैं । त्रुटि पट्टियां माध्य की मानक त्रुटि दर्शाती हैं । <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56551/56551fig3large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>नाम</td>
			<td colspan="4">अनुक्रम</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC49</td>
			<td colspan="4">AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC76</td>
			<td colspan="4">GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNN * n * n</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC77</td>
			<td colspan="4">AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTC * क * ग</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC78</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC84</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC85</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC86</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC87</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGA</td></tr></tbody></table>tct
		
		<tr>
			<td>ARC88</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC89</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC90</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC91</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC93</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC94</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGCCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC95</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC96</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGTTGACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC97</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACGGAACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC98</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCTGACATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC99</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGGACGGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC100</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTGCGGACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC101</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTTTCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC102</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGGCCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC103</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCCGAAACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC104</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACGTACGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC105</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCCACTCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC106</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATATCAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC107</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAAGGAATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC140</td>
			<td colspan="4">/5AmMC6/ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
	

तालिका 1: Oligonucleotides । सूचीबद्ध oligonucleotides HydEn-Seq के लिए उपयोग किया जाता है । बोल्ड चेहरा अनुक्रमण इंगित करता है । * एक phosphorothioate बंधन को इंगित करता है । ARC140 एक 5 ´-अमीनो समूह के बजाय एक 5 ´-ओह समूह, एक सी 6 linker के साथ संयोजन में शामिल हैं । इस संशोधन बंधाव के दौरान ARC140 concatemers के गठन को कम कर देता है ।

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Simultaneous Mapping and Quantitation of Ribonucleotides in Human Mitochondrial DNA

मानव Mitochondrial डीएनए में Ribonucleotides की एक साथ मैपिंग और Quantitation

यहाँ हम एक साथ एक ही quantitate और जीनोम चौड़ा नक्शा ribonucleotides में अत्यधिक बरकरार डीएनए में एक-न्यूक्लियोटाइड संकल्प के लिए उत्तरदायी विधि का वर्णन, अपने alkaline जीनोमिक और बाद में 5 hydrolysis के अंत के साथ ´ डीएनए के एंजाइमी दरार के संयोजन अनुक्रमण.

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