Name: characterization of cell membrane extensions and studying their roles in cancer cell adhesion dynamics
Uploaded: 2018-03-26T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Cell Membrane Extensions and Studying Their Roles in Cancer Cell Adhesion Dynamics at JoVE.com

Ohse Grant Foundation finansieret dette arbejde.

1. udvidelse cellebanker
<ol><li>Vedligeholde SW-13, SW-Neo og SW-DKK3 celler i en standard befugtet inkubator ved 37.0 ° C og 5% CO2 i Dulbeccos modificerede Eagle Medium suppleret med 10% føtal bovint serum og 10.000 U/mL penicillin og streptomycin (udpeget som 'vækstmediet').<ol>
<li>Tælle celler ved hjælp af en hemocytometer og plade 5.000 celler pr. brønd til SW-13, SW-Neo og SW-DKK3 linjer i separate 6-godt plader og vokse natten over i vækstmediet på sterilt glas coverslips.</li>
	</ol>
</li>
...

<ol>
	<li>Libe, R., Fratticci, A., Bertherat, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adrenocortical+cancer:+pathophysiology+and+clinical+management.">Adrenocortical cancer: pathophysiology and clinical management.</a> Endocrine-related cancer. 14 (1), 13-28 (2007).</li><li>Veeck, J., Dahl, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+Wnt+pathway+in+cancer:+the+emerging+role+of+Dickkopf-3.">Targeting the Wnt pathway in cancer: the emerging role of Dickkopf-3.</a> Biochimica et biophysica acta. 1825 (1), 18-28 (2012).</li><li>Friedl, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+migration+in+morphogenesis,+regeneration+and+cancer.">Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (7), 445-457 (2009).</li><li>Jacquemet, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-type+calcium+channels+regulate+filopodia+stability+and+cancer+cell+invasion+downstream+of+integrin+signalling.">L-type calcium channels regulate filopodia stability and cancer cell invasion downstream of integrin signalling.</a> Nat Commun. 7, 13297 (2016).</li><li>Machesky, L. M., Li, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fascin:+Invasive+filopodia+promoting+metastasis.">Fascin: Invasive filopodia promoting metastasis.</a> Commun Integr Biol. 3 (3), 263-270 (2010).</li><li>Petrie, R. J., Harlin, H. M., Korsak, L. I., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+the+nuclear+piston+mechanism+of+3D+migration+in+tumor+cells.">Activating the nuclear piston mechanism of 3D migration in tumor cells.</a> J Cell Biol. 216 (1), 93-100 (2017).</li><li>Korah, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+silencing+of+RASSF1A+deregulates+cytoskeleton+and+promotes+malignant+behavior+of+adrenocortical+carcinoma.">Epigenetic silencing of RASSF1A deregulates cytoskeleton and promotes malignant behavior of adrenocortical carcinoma.</a> Molecular cancer. 12, 87 (2013).</li><li>Cheng, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+FOXO1-mediated+dedifferentiation+blocking+role+for+DKK3+in+adrenocortical+carcinogenesis.">A novel FOXO1-mediated dedifferentiation blocking role for DKK3 in adrenocortical carcinogenesis.</a> BMC cancer. 17 (1), 164 (2017).</li><li>Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+source+software+for+quantification+of+cell+migration,+protrusions,+and+fluorescence+intensities.">Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities.</a> J Cell Biol. 209 (1), 163-180 (2015).</li><li>Cliffe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+3D+analysis+of+complex+single+border+cell+behaviors+in+coordinated+collective+cell+migration.">Quantitative 3D analysis of complex single border cell behaviors in coordinated collective cell migration.</a> Nat Commun. 8, 14905 (2017).</li></ol>

Her beskriver vi en in vitro- kvantitativ metode for at karakterisere celle extensions med lethed, par pit-falls og pålidelige reproducerbarhed, der kan anvendes til forskellige prøvningsbetingelser. Derudover kan simple, kvantificerbare vedhæftning og/eller motilitet assays udføres samtidigt for at korrelere potentielle funktionel betydning af observerede ændringer i cellens membran udvidelser.
Disse metoder kan fremsætte nogle potentielle begrænsninger. Først, de kriterier, ...

Dysregulated WNT signalering spiller en afgørende rolle i binyrebarkhormon maligniteter1. De metoder, der anvendes i denne undersøgelse undersøge, om hæmning af DKK3, en negativ regulator af WNT signalering, repræsenterer et dedifferentiation arrangement i binyrebarken og fremmer tumordannelse inden for rammerne af celle-udvidelse repertoire ændringer. DKK3 er en 38 kDa udskilles glycoprotein med en N-terminale signal peptid og tidligere undersøgelser har vist at dens tvungen udtryk resulterede i celle cyklus anholdelse, hæmmede aggressiv ondartet adfærd, og vendt epitel-mesenkymale overgangen2.
Den maligne opførsel af binyrebarkhormon karcinom (ACC) og andre kræftformer er del, påvirket af evne til tumorceller at interface med de omkringliggende overflader, herunder den ekstracellulære matrix, som til gengæld letter tumor celle invasion og migration3. Rollen specifikke cellemembranen udvidelser i kræft progression er demonstreres i stigende grad i forskellige sammenhænge, primært via dannelsen af filopodia. For eksempel har overekspression af L-type calcium kanaler vist sig at fremkalde filopodia dannelse og fremme tumor celle invasion4. Fascin, en actin bindende protein minimalt udtrykt i normalt væv, er ligeledes også overexpressed i kræftceller i forening med filopodia dannelse5. Lobopodia dannelse muliggør ikke-maligne fibroblaster overflytte effektivt gennem det ekstra-cellulære matrix, men det har vist sig at fibrosarcoma celler er afhængige af metalloproteinase aktivitet i stedet for lobopodia til at lette celle migration og invasion6. Vi har vist, at tumor undertrykkerne, herunder Ras association domæne familie 1 isoform en (RASSF1A) og DKK3, kan funktionen til at ændre cytoskeletal elementer og fremme lamellipodia dannelse og styne invasive egenskaber7,8.
Som sådan, er det kritisk at karakterisere effekten af gener involveret i carcinogenese og deres forhold til cellemembranen udvidelse ændringer, specielt vurdering af filopodia, lobopodia og lamellipodia dannelse under prøvningsbetingelser. Nuværende state-of-the-art teknikker omfatter brug af stadig mere avancerede mikroskopi metoder, fluorescerende mærkning, og/eller komplekse edb-algoritmer til dataopsamling og fortolkning. Mens disse metoder til at give nye og stærke analytiske værktøjer, begrænser deres kompleksitet deres udbredte anvendelse og tilpasningsevne i celle biologi eksperimenter. Desuden er præcis kvantificering og observation af ændringer i celle udvidelse morfologi ikke typisk målte9,10. Derimod introducerer vi en teknik, som nøjagtigt kvantificerer celle udvidelse ændringer ved hjælp af standard mikroskopiske teknikker og let fleksibel in vitro- metoder. Disse metoder også kvantificere hver celle forlængelse skrive samtidig for hver celle, analyseres og afgøre overordnede ændringer i cellens membran udvidelse repertoire. Vi viser også, hvordan disse ændringer kan relateres til celle vedhæftning egenskaber.
Som en eksperimenterende eksempel, vil vi bruge en tidligere oprettet cellelinie af SW-13, udpeget SW-DDK3, der har været stabilt transfekteret med pCMV6-post/DKK3 plasmid vektorer og constitutively overexpresses DKK3, en differentiering faktor i binyrerne. Non-transfekteret SW-13 celler og SW-13 celler stabilt transfekteret med tomme vektor (pCMV6-post), udpeget SW-Neo, vil tjene som eksperimentelle kontrolelementer.

<table width="653">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="width:216px;height:63px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:115px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">11965-092</td>
			<td style="width:203px;">Supplemented with fetal bovine serum and penicllin and streptomycin</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">Deulbeco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8537</td>
			<td>1X solution, used directly</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:216px;height:21px;">3.7% formaldehyde&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F8775</td>
			<td>Dilute stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:216px;height:21px;">0.05% crystal violet&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Harleco</td>
			<td style="width:119px;">192-12</td>
			<td>Dilute stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:216px;height:21px;">De-ionized water</td>
			<td style="width:115px;">NA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">Microscope with 400X magnification&#160;</td>
			<td style="width:115px;">NA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="width:216px;height:43px;">Cell dissociation solution non-enzymatic 1X</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C5914&#160;</td>
			<td>1X solution, used directly</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of cell membrane extensions and studying their roles in cancer cell adhesion dynamics

Cellens membran udvidelse repertoire modulerer forskellige maligne opførsel af kræftceller, herunder deres klæbende og vandrende potentialer. Evne til præcist klassificere og kvantificere celle udvidelser og måle effekten på en celle klæbende kapacitet er afgørende for at bestemme hvordan celle signalering begivenheder indvirkning kræft celle adfærd og aggressivitet. Vi beskriver her, in vitro- design og brug af en celle udvidelse kvantificering metode sammen med en vedhæftning kapacitet analyse i en etableret i vitro model for binyrebarkhormon karcinom (ACC). Specifikt, tester vi virkningerne af DKK3, en formodede tumor suppressor og en Pro differentiering faktor, på membran udvidelse Fænotypen af ACC cellelinie, SW-13. Vi foreslår disse assays til giver relativt enkel, pålidelig og let fortolkelige målinger til måler disse egenskaber under forskellige forsøgsbetingelser.

Benytter de ovenfor assays, blev virkningerne af DKK3 overekspression på celle udvidelse morfologi og celle vedhæftning egenskaber testet i den etablerede ACC cellelinie SW-13, in vitro. Celler overekspression DKK3 blev genereret af stabilt transfecting SW-13 celler med Myc-DDK mærket pCMV6-post/DKK3 plasmid vektorer og udpeget som SW-DKK3. Ligeledes blev celler stabilt transfekteret med tomme vektor pCMV6-posten oprettet som en Transfektion og passaging kontrol og defineret s...

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Cell Membrane Extensions and Studying Their Roles in Cancer Cell Adhesion Dynamics at JoVE.com

Characterization of Cell Membrane Extensions and Studying Their Roles in Cancer Cell Adhesion Dynamics

Denne undersøgelse viser den nytte og brugervenlighed kvantitative cellemembranen udvidelse måling og dens sammenhæng med selvklæbende kapacitet af celler. Som et repræsentativt eksempel viser vi her at Dickkopf-relaterede proteiner 3 (DKK3) fremmer øget lobopodia dannelse og celle klæbeevne i binyrebarkhormon karcinom celler i vitro.

Karakterisering af cellemembranen udvidelser og studere deres roller i kræft celle vedhæftning Dynamics

The cell membrane&#39;s extension repertoire modulates various malignant behaviors of cancer cells, including their adhesive and migratory potentials. The ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

En protokol til Rapid Post-mortem Cell Culture af Diffus Intrinsic Pontine gliom (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Target Cell pre berigelse og hele genom forstærkning for enkelt celle Downstream karakterisering

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

3-D Cell Culture System for Studying Invasion and Evaluating Therapeutics in Bladder Cancer

3D-celle kultur System for at studere Invasion og evaluere Therapeutics i blærekræft

Bladder cancer is a significant health problem. It is estimated that more than 16,000 people will die this year in the United States from bladder cancer. ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Mesenkymale stamceller isoleret fra Pulp væv og fælles kultur med kræftceller til at studere deres interaktioner

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Flow Cytometrisk analyse af mitokondrie reaktive oxygen arter i murine hæmatopoietiske stamceller og Progenitorcellerne og MLL-AF9 drevet leukæmi

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Etablering af gastrisk Cancer patient afledte xenograft-modeller og primære cellelinjer

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Semi-automatisk PD-L1 karakterisering og optælling af cirkulerende tumor celler fra ikke-småcellet lunge cancer patienter ved immunofluorescens

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines

Røntgen følsomhed af kræft stamceller i lungekræft cellelinjer

The presence of cancer stem cells (CSCs) has been associated with relapse or poor outcomes after radiotherapy. Studying radioresistant CSCs may provide ...

Comparing Metastatic Clear Cell Renal Cell Carcinoma Model Established in Mouse Kidney and on Chicken Chorioallantoic Membrane

Sammenligning metastatisk klar celle renal celle karcinom model etableret i mus nyre og på Kylling Chorioallantoic Membran

Metastatic clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) is the most common subtype of kidney cancer. Localized ccRCC has a favorable surgical outcome. However, ...

Quantification of Tumor Cell Adhesion in Lymph Node Cryosections

Kvantificering af tumorcellevedhæftning i lymfeknude Cryosektioner

Tumor-draining lymph nodes (LNs) are not merely filters of tumor-produced waste. They are one of the most common regional sites of provisional residence ...