Name: characterization of cell membrane extensions and studying their roles in cancer cell adhesion dynamics
Uploaded: 2018-03-26T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Cell Membrane Extensions and Studying Their Roles in Cancer Cell Adhesion Dynamics at JoVE.com

Ohse Grant Foundation finansiert dette arbeidet.

1. celle forlengelsen egenskaper
<ol><li>Opprettholde SW-13, SW-Neo og SW-DKK3 celler i en standard fuktet inkubator ved 37.0 ° C og 5% CO2 i Dulbeccos endret Eagle Medium supplert med 10% fosterets bovin serum og 10.000 U/mL penicillin og streptomycin (betegnet som 'vekst medium').<ol>
<li>Telle celler ved hjelp av en hemocytometer, og plate 5000 celler per brønn for SW-13, SW-Neo og SW-DKK3 linjer i separate 6-vel plater og vokse over natten i vekst medium på sterilt glass coverslips.</li>
	</ol>
</li>
...

<ol>
	<li>Libe, R., Fratticci, A., Bertherat, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adrenocortical+cancer:+pathophysiology+and+clinical+management.">Adrenocortical cancer: pathophysiology and clinical management.</a> Endocrine-related cancer. 14 (1), 13-28 (2007).</li><li>Veeck, J., Dahl, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+Wnt+pathway+in+cancer:+the+emerging+role+of+Dickkopf-3.">Targeting the Wnt pathway in cancer: the emerging role of Dickkopf-3.</a> Biochimica et biophysica acta. 1825 (1), 18-28 (2012).</li><li>Friedl, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+migration+in+morphogenesis,+regeneration+and+cancer.">Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (7), 445-457 (2009).</li><li>Jacquemet, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-type+calcium+channels+regulate+filopodia+stability+and+cancer+cell+invasion+downstream+of+integrin+signalling.">L-type calcium channels regulate filopodia stability and cancer cell invasion downstream of integrin signalling.</a> Nat Commun. 7, 13297 (2016).</li><li>Machesky, L. M., Li, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fascin:+Invasive+filopodia+promoting+metastasis.">Fascin: Invasive filopodia promoting metastasis.</a> Commun Integr Biol. 3 (3), 263-270 (2010).</li><li>Petrie, R. J., Harlin, H. M., Korsak, L. I., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+the+nuclear+piston+mechanism+of+3D+migration+in+tumor+cells.">Activating the nuclear piston mechanism of 3D migration in tumor cells.</a> J Cell Biol. 216 (1), 93-100 (2017).</li><li>Korah, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+silencing+of+RASSF1A+deregulates+cytoskeleton+and+promotes+malignant+behavior+of+adrenocortical+carcinoma.">Epigenetic silencing of RASSF1A deregulates cytoskeleton and promotes malignant behavior of adrenocortical carcinoma.</a> Molecular cancer. 12, 87 (2013).</li><li>Cheng, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+FOXO1-mediated+dedifferentiation+blocking+role+for+DKK3+in+adrenocortical+carcinogenesis.">A novel FOXO1-mediated dedifferentiation blocking role for DKK3 in adrenocortical carcinogenesis.</a> BMC cancer. 17 (1), 164 (2017).</li><li>Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+source+software+for+quantification+of+cell+migration,+protrusions,+and+fluorescence+intensities.">Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities.</a> J Cell Biol. 209 (1), 163-180 (2015).</li><li>Cliffe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+3D+analysis+of+complex+single+border+cell+behaviors+in+coordinated+collective+cell+migration.">Quantitative 3D analysis of complex single border cell behaviors in coordinated collective cell migration.</a> Nat Commun. 8, 14905 (2017).</li></ol>

Her beskriver vi en i vitro kvantitativ metode betegner celle extensions med letthet, noen pit-falls og pålitelig reproduserbarhet som kan brukes for ulike testforhold. Videre kan enkelt, målbare vedheft og/eller motilitet analyser utføres samtidig for å sammenligne potensielle funksjonelle betydningen av observerte endringer i cellemembranen utvidelser.
Men kan disse metodene presentere noen potensielle begrensninger. Først kriteriene angitt her å identifisere ulike typer celle...

Dysregulated WNT signalering spiller en avgjørende rolle i adrenocortical malignitet1. Metodene som brukes i denne studien undersøker om stanse DKK3, en negativ regulator WNT signalnettverk, representerer en dedifferentiation hendelse i binyrebarken og fremmer tumor dannelse i sammenheng av celle-utvidelse repertoar endringer. DKK3 er en 38 kDa utskilles glykoprotein med en N-terminal signal peptid og tidligere studier har vist at håndheves uttrykket resulterte i celle syklus arrestasjon, hemmet aggressiv malign atferd og reversert epithelial-mesenchymal overgang2.
Ondartet atferden til adrenocortical karsinom (ACC) og andre kreftformer er, delvis, påvirket av evnen av kreftceller grensesnitt med omkringliggende overflater, inkludert ekstracellulær matrix, som igjen muliggjør svulst celle invasjonen og migrasjon3. Rollen av bestemte cellemembranen filtyper i kreft progresjon blir stadig demonstrert i ulike sammenhenger, hovedsakelig via dannelsen av filopodia. For eksempel har overuttrykte L-type kalsium kanaler blitt funnet å skape filopodia og fremme svulst celle invasjonen4. Tilsvarende Fascin, en utgangen bindende protein minimal uttrykt i normalt vev, er også overexpressed i kreftceller i tilknytning til filopodia dannelse5. Lobopodia formasjon gjør ikke-ondartet fibroblaster overføre effektivt gjennom ekstra-mobile matrix, men det har vist at fibrosarcoma celler er avhengige av metalloproteinase aktivitet i stedet for lobopodia å lette celle migrasjon og invasjonen6. Vi har vist at svulsten suppressors, inkludert Ras association domene familie 1 isoformen en (RASSF1A) og DKK3, kan funksjonen å endre cellen cytoskjelett elementer og fremme lamellipodia formasjon og stymie invasiv egenskaper7,8.
Som sådan, er det avgjørende å karakterisere effekten av gener involvert i kreft og deres forhold til cellemembranen utvidelse endringer, spesielt vurdere filopodia, lobopodia og lamellipodia formasjon under testforhold. Gjeldende state-of-the art teknikker inkluderer bruk av stadig mer sofistikerte mikroskopi metoder, fluorescerende merking eller komplekse datamaskinalgoritmer for datainnsamling og tolkning. Disse metodene gir nye analytiske verktøy, begrenser kompleksitet deres utbredt bruk og tilpasningsevne i cellen biologiske forsøk. Videre er presis kvantifisering og observasjon av endringer i celle forlengelsen morfologi ikke vanligvis målt9,10. I kontrast, introduserer vi en teknikk her som nøyaktig kvantifiserer celle forlengelsen endringer ved hjelp av standard mikroskopiske teknikker og lett tilpasses i vitro metoder. Disse metodene også kvantifisere hver celle forlengelsen type samtidig i hver celle analysert og finne generelle endringer i cellemembranen forlengelsen repertoaret. Vi viser også hvordan disse endringene kan forholde seg til celle vedheft egenskaper.
Eksperimentell eksempel vil vi bruke en tidligere opprettet cellen linje av SW-13, utpekt SW-DDK3, som har vært stabilt transfekterte med pCMV6-oppføringen/DKK3 plasmider vektorer og constitutively overexpresses DKK3, en distinktiv faktor i binyrene. Non-transfekterte SW-13 cellene og SW-13 stabilt transfekterte med Tom vektor (pCMV6-inngang), utpekt SW-Neo, vil tjene som eksperimentelle kontroller.

<table width="653">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="width:216px;height:63px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:115px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">11965-092</td>
			<td style="width:203px;">Supplemented with fetal bovine serum and penicllin and streptomycin</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">Deulbeco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8537</td>
			<td>1X solution, used directly</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:216px;height:21px;">3.7% formaldehyde&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F8775</td>
			<td>Dilute stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:216px;height:21px;">0.05% crystal violet&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Harleco</td>
			<td style="width:119px;">192-12</td>
			<td>Dilute stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:216px;height:21px;">De-ionized water</td>
			<td style="width:115px;">NA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">Microscope with 400X magnification&#160;</td>
			<td style="width:115px;">NA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="width:216px;height:43px;">Cell dissociation solution non-enzymatic 1X</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C5914&#160;</td>
			<td>1X solution, used directly</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of cell membrane extensions and studying their roles in cancer cell adhesion dynamics

Cellemembranens forlengelse repertoar modulerer ulike ondartet atferd av kreftceller, inkludert deres klebende og vandrende potensialer. Nøyaktig klassifisere og kvantifisere celle utvidelser og måle effekten på en celle selvklebende kapasitet er avgjørende for å bestemme hvordan celle signalisering hendelser innvirkningsvirkemåte kreft cellen og aggressivitet. Her beskriver vi i vitro design og bruk av en celle forlengelsen kvantifisering metode i forbindelse med vedheft kapasitet analysen en etablert i vitro modell for adrenocortical karsinom (ACC). Spesielt teste vi effekten av DKK3, en antatte tumor suppressor og en Pro differensiering faktor, på membran forlengelsen fenotypen av ACC celle linjen, SW-13. Vi foreslår disse analyser å gi relativt enkel, pålitelig og lett interpretable beregninger for måler disse egenskapene under ulike eksperimentelle forhold.

Bruker de ovenfor analyser, ble effekten av DKK3 overuttrykte på cellen forlengelsen morfologi og egenskaper for celle vedheft testet i etablerte ACC cellen linje SW-13, i vitro. Celler overexpressing DKK3 ble generert av stabilt transfecting SW-13 celler med Myc-DDK merket pCMV6-oppføringen/DKK3 plasmider vektorer og utpekt som SW-DKK3. Tilsvarende ble celler stabilt transfekterte med Tom vektor pCMV6-oppføringen opprettet som en transfection og passaging og definert som SW-N...

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Cell Membrane Extensions and Studying Their Roles in Cancer Cell Adhesion Dynamics at JoVE.com

Characterization of Cell Membrane Extensions and Studying Their Roles in Cancer Cell Adhesion Dynamics

Denne studien viser av og kvantitative cellemembranen forlengelsen måling og dets sammenheng med selvklebende kapasitet celler. Som et representativt eksempel viser vi her at Dickkopf-relaterte proteiner 3 (DKK3) fremmer økt lobopodia formasjon og celle feste i adrenocortical karsinom celler i vitro.

Karakteristikk av cellemembranen utvidelser og studere deres roller i kreft celle vedheft Dynamics

The cell membrane&#39;s extension repertoire modulates various malignant behaviors of cancer cells, including their adhesive and migratory potentials. The ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

En protokoll for Rapid Post mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Målet cellen pre berikelse og hele genomet forsterkning for enkeltcelle nedstrøms karakteristikk

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

3-D Cell Culture System for Studying Invasion and Evaluating Therapeutics in Bladder Cancer

3-D celle kultur-systemet for å studere invasjonen og evaluere legemiddelselskap i blærekreft

Bladder cancer is a significant health problem. It is estimated that more than 16,000 people will die this year in the United States from bladder cancer. ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Mesenchymal stamceller isolert fra cellulose vev og co kultur kreftceller å studere deres samhandling

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Flow analytiske analyse av mitokondrie reaktive oksygen arter i murine blodkreft stem og stamceller og MLL-AF9 drevet leukemi

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Etablering av magekreft pasient-avledet Xenograft modeller og primær celle Lines

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Semi-automatisk PD-L1 karakterisering og opplisting av sirkulerende tumor celler fra ikke-liten celle Lungekreftpasienter ved Immunofluorescence

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines

Radiosensitivity av kreft stamceller i lungekreft cellelinjer

The presence of cancer stem cells (CSCs) has been associated with relapse or poor outcomes after radiotherapy. Studying radioresistant CSCs may provide ...

Comparing Metastatic Clear Cell Renal Cell Carcinoma Model Established in Mouse Kidney and on Chicken Chorioallantoic Membrane

Sammenligne metastatisk klar celle nyrecelle karsinom modell etablert i mus nyre og på kylling chorioallantoic membran

Metastatic clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) is the most common subtype of kidney cancer. Localized ccRCC has a favorable surgical outcome. However, ...

Quantification of Tumor Cell Adhesion in Lymph Node Cryosections

Kvantifisering av tumorcellevedheft i lymfeknute kryoseksjoner

Tumor-draining lymph nodes (LNs) are not merely filters of tumor-produced waste. They are one of the most common regional sites of provisional residence ...