Name: characterization of cell membrane extensions and studying their roles in cancer cell adhesion dynamics
Uploaded: 2018-03-26T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Cell Membrane Extensions and Studying Their Roles in Cancer Cell Adhesion Dynamics at JoVE.com

Ohse Grant stiftelsen finansierat detta arbete.

1. cell filändelsen egenskaper
<ol><li>Underhålla SW-13, SW-Neo och SW-DKK3 celler i en standard befuktade inkubator vid 37,0 ° C och 5% CO2 i Dulbeccos modifierade Eagle Medium kompletteras med 10% fetalt bovint serum och 10.000 U/mL penicillin och streptomycin (betecknas som 'odlingsmedium').<ol>
<li>Räkna celler som använder en hemocytometer, och platta 5 000 celler per brunn för SW-13, SW-Neo och SW-DKK3 linjer i separata 6-bra plattor och växer över natten i odlingsmedium på sterilt glas covers...

<ol>
	<li>Libe, R., Fratticci, A., Bertherat, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adrenocortical+cancer:+pathophysiology+and+clinical+management.">Adrenocortical cancer: pathophysiology and clinical management.</a> Endocrine-related cancer. 14 (1), 13-28 (2007).</li><li>Veeck, J., Dahl, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+Wnt+pathway+in+cancer:+the+emerging+role+of+Dickkopf-3.">Targeting the Wnt pathway in cancer: the emerging role of Dickkopf-3.</a> Biochimica et biophysica acta. 1825 (1), 18-28 (2012).</li><li>Friedl, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+migration+in+morphogenesis,+regeneration+and+cancer.">Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (7), 445-457 (2009).</li><li>Jacquemet, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-type+calcium+channels+regulate+filopodia+stability+and+cancer+cell+invasion+downstream+of+integrin+signalling.">L-type calcium channels regulate filopodia stability and cancer cell invasion downstream of integrin signalling.</a> Nat Commun. 7, 13297 (2016).</li><li>Machesky, L. M., Li, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fascin:+Invasive+filopodia+promoting+metastasis.">Fascin: Invasive filopodia promoting metastasis.</a> Commun Integr Biol. 3 (3), 263-270 (2010).</li><li>Petrie, R. J., Harlin, H. M., Korsak, L. I., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+the+nuclear+piston+mechanism+of+3D+migration+in+tumor+cells.">Activating the nuclear piston mechanism of 3D migration in tumor cells.</a> J Cell Biol. 216 (1), 93-100 (2017).</li><li>Korah, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+silencing+of+RASSF1A+deregulates+cytoskeleton+and+promotes+malignant+behavior+of+adrenocortical+carcinoma.">Epigenetic silencing of RASSF1A deregulates cytoskeleton and promotes malignant behavior of adrenocortical carcinoma.</a> Molecular cancer. 12, 87 (2013).</li><li>Cheng, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+FOXO1-mediated+dedifferentiation+blocking+role+for+DKK3+in+adrenocortical+carcinogenesis.">A novel FOXO1-mediated dedifferentiation blocking role for DKK3 in adrenocortical carcinogenesis.</a> BMC cancer. 17 (1), 164 (2017).</li><li>Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+source+software+for+quantification+of+cell+migration,+protrusions,+and+fluorescence+intensities.">Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities.</a> J Cell Biol. 209 (1), 163-180 (2015).</li><li>Cliffe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+3D+analysis+of+complex+single+border+cell+behaviors+in+coordinated+collective+cell+migration.">Quantitative 3D analysis of complex single border cell behaviors in coordinated collective cell migration.</a> Nat Commun. 8, 14905 (2017).</li></ol>

Här beskriver vi en in vitro- kvantitativ metod för att karakterisera cell tillägg med lätthet, några pit-faller och tillförlitlig reproducerbarhet som kan tillämpas för olika förhållanden. Dessutom kan enkel, kvantifierbara vidhäftning eller motilitet analyser utföras samtidigt för att korrelera potentiella funktionell betydelse av observerade förändringar i cellmembranet filändelser.
Dessa metoder kan dock medföra vissa potentiella begränsningar. Först, de kriteri...

Dysregulated WNT signalering spelar en avgörande roll i adrenokortikal maligniteter1. De metoder som används i denna studie undersöka om ljuddämpning av DKK3, en negativ regulator av WNT signalering, representerar en Dedifferentiering händelse i binjurebarken och främjar tumörbildning i samband av cell-extension repertoar förändringar. DKK3 är en 38 kDa utsöndras glykoprotein med en N-terminal signal peptid och tidigare studier har visat att dess påtvingade uttryck resulterade i cellcykelarrest, inhiberad aggressiva elakartade beteende och omvänd epitelial-mesenkymala övergången2.
Malignt beteende adrenokortikal carcinom (ACC) och andra cancerformer är, i del, influerad av tumörceller förmåga att samverka med de omgivande ytorna, inklusive den extracellular matrisen, vilket i sin tur underlättar tumör cell invasion och migration3. Rollen för specifika cellmembranet extensions i cancer progression demonstreras alltmer i olika sammanhang, främst via bildandet av filopodia. Överuttryck av L-typ kalciumkanaler har exempelvis visat att framkalla filopodia bildas och främja tumör cell invasion4. Likaså staden, en aktin bindande protein minimalt uttryckt i normal vävnad, är också överuttryckt i cancerceller i samband med filopodia bildning5. Lobopodia bildande möjliggör icke-maligna fibroblaster att migrera effektivt genom extra-cellulära matrisen, det har dock visat att fibrosarkom celler åberopa metalloproteinas aktivitet i stället för lobopodia att underlätta cellmigration och invasion6. Vi har visat att tumören dämpning, inklusive Ras association domän familj 1 isoform en (RASSF1A) och DKK3, kan funktionen för att ändra cytoskeletal element och främja lamellipodia bildning och hämmas invasiva egenskaper7,8.
Som sådan, är det viktigt att karakterisera effekterna av gener involverade i carcinogenes och deras relation till cellmembranet förlängning förändringar, särskilt bedöma filopodia, lobopodia och lamellipodia bildning under provningsförhållanden. Aktuella staten-of-the-art tekniker inkluderar användning av alltmer sofistikerade mikroskopi metoder, fluorescerande märkning eller komplexa datoralgoritmer för datainsamling och tolkning. Medan dessa metoder ger nya och kraftfulla analytiska verktyg, begränsar deras komplexitet deras utbredd användning och anpassningsförmåga i cellbiologi experiment. Dessutom är den exakt kvantifiering och observation av förändringar i cellmorfologi förlängning inte vanligtvis uppmätta9,10. Däremot införa vi en teknik här som exakt kvantifierar cell filändelsen förändringar med standard mikroskopiska tekniker och lätt anpassningsbar in vitro- metoder. Dessa metoder även kvantifiera varje celltyp förlängning samtidigt för varje cell som analyseras och fastställa övergripande förändringar i cellmembranet förlängning repertoar. Vi visar också hur dessa förändringar kan relatera till cell vidhäftningsegenskaper.
Som en experimentell exempel, kommer att vi använda en tidigare skapad cell fodrar SW-13, designerat SW-DDK3, som har transfekterats stabilt med pCMV6-posten/DKK3 plasmid vektorer och konstitutivt overexpresses DKK3, en särskiljande faktorn i binjuren. Icke-transfekterade SW-13 och SW-13 celler stabilt transfekterade med tom vektor (pCMV6-post), designerat SW-Neo, kommer att tjäna som experimentella kontroller.

<table width="653">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="width:216px;height:63px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:115px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">11965-092</td>
			<td style="width:203px;">Supplemented with fetal bovine serum and penicllin and streptomycin</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">Deulbeco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8537</td>
			<td>1X solution, used directly</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:216px;height:21px;">3.7% formaldehyde&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F8775</td>
			<td>Dilute stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:216px;height:21px;">0.05% crystal violet&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Harleco</td>
			<td style="width:119px;">192-12</td>
			<td>Dilute stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:216px;height:21px;">De-ionized water</td>
			<td style="width:115px;">NA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">Microscope with 400X magnification&#160;</td>
			<td style="width:115px;">NA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="width:216px;height:43px;">Cell dissociation solution non-enzymatic 1X</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C5914&#160;</td>
			<td>1X solution, used directly</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of cell membrane extensions and studying their roles in cancer cell adhesion dynamics

Cellmembranets förlängning repertoar modulerar olika maligna beteenden av cancerceller, inklusive deras självhäftande och flyttfåglar potential. Förmågan att noggrant klassificera och kvantifiera cell tillägg och mäta effekten på cellens självhäftande kapacitet är avgörande för att fastställa hur cell-signalering händelser inverkan cancercellers beteende och aggressivitet. Vi beskriver här, in vitro- design och en cell filändelsen kvantifiering metod i samband med en vidhäftning kapacitet analys i en etablerad in vitro- modell för adrenokortikal carcinom (ACC). Specifikt, testar vi effekterna av DKK3, en förmodad tumörsuppressor och en Pro differentiering faktor, på membran förlängning fenotypen av raden cell ACC, SW-13. Vi föreslår dessa analyser att ge relativt enkel, tillförlitlig och lätt tolkningsbara mätvärden till åtgärder dessa egenskaper under olika experimentella förhållanden.

Effekterna av DKK3 överuttryck på förlängning cellmorfologi och vidhäftning Cellegenskaper prövades i den etablerade ACC cell fodrar SW-13, in vitro-och använda de ovanstående analyserna. Celler överuttryck av DKK3 genererades av stabilt transfecting SW-13 celler med Myc-DDK märkta pCMV6-posten/DKK3 plasmid vektorer och utsett SW-DKK3. Likaså celler stabilt transfekterade med tom vektor pCMV6-posten skapades som en transfection och passaging kontroll och definieras som...

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Cell Membrane Extensions and Studying Their Roles in Cancer Cell Adhesion Dynamics at JoVE.com

Characterization of Cell Membrane Extensions and Studying Their Roles in Cancer Cell Adhesion Dynamics

Denna studie visar nytta och användarvänlighet kvantitativa cellmembranet förlängning mätning och dess korrelation till självhäftande kapacitet av celler. Som ett typexempel visar vi här det Dickkopf-relaterade proteinet 3 (DKK3) främjar ökad lobopodia bildning och cell vidhäftning i adrenokortikal cancer celler in vitro.

Karakterisering av cellmembranet tillägg och studera deras roller i Cancer Cell Adhesion Dynamics

The cell membrane&#39;s extension repertoire modulates various malignant behaviors of cancer cells, including their adhesive and migratory potentials. The ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

Ett protokoll för Rapid Post mortem Cell Culture av Diffus Intrinsic Pontine Gliom (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Mål Cell före berikning och hela genomet förstärkning för enstaka Cell nedströms karakterisering

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

3-D Cell Culture System for Studying Invasion and Evaluating Therapeutics in Bladder Cancer

3-D cellodlingssystem för att studera Invasion och utvärdera Therapeutics i Cancer i urinblåsan

Bladder cancer is a significant health problem. It is estimated that more than 16,000 people will die this year in the United States from bladder cancer. ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Mesenkymala stamceller isolering från massa vävnad och samtidig kultur med cancerceller för att studera deras interaktioner

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Flödescytometrisk analys av mitokondriella reaktiva syreradikaler i murina hematopoietiska Stem och progenitorceller och MLL-AF9 driven leukemi

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Inrättande av patienter med Ventrikelhärledd xenograft-modell och primära cellinjer

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Semi-automatisk PD-L1 karakterisering och uppräkning av cirkulerande tumörceller från icke-småcellig Lung cancer patienter genom Immunofluorescensering

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines

Radio känslighet av cancer stamceller i Lung cancer cellinjer

The presence of cancer stem cells (CSCs) has been associated with relapse or poor outcomes after radiotherapy. Studying radioresistant CSCs may provide ...

Comparing Metastatic Clear Cell Renal Cell Carcinoma Model Established in Mouse Kidney and on Chicken Chorioallantoic Membrane

Jämföra metastaserande clear cell njurcellscancer modell etablerad i mus njure och på kyckling chorioallantoic membranet

Metastatic clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) is the most common subtype of kidney cancer. Localized ccRCC has a favorable surgical outcome. However, ...

Quantification of Tumor Cell Adhesion in Lymph Node Cryosections

Kvantifiering av tumörcellviddhesion i lymfkörteln Cryosections

Tumor-draining lymph nodes (LNs) are not merely filters of tumor-produced waste. They are one of the most common regional sites of provisional residence ...