Name: lens-free video microscopy for the dynamic and quantitative analysis of adherent cell culture
Uploaded: 2018-02-23T14:00:00
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Os autores não têm nada de reconhecer.

1. celular cultura monitoramento aquisição
<ol><li>Desenvolvem-se células HeLa em DMEM + glutamina (por exemplo, GlutaMAX) suplementado com 10% (v/v) bezerro fetal-inactivados por calor, soro e 1% penicilina e estreptomicina.</li>
	<li>Revestimento de placas de cultura de fundo de vidro 6-poços com fibronectina (25 µ g/mL) por 1h. Então as sementes 2 x 104 células por poço.</li>
	<li>Durante a aquisição, mude o meio em 3 dias.</li>
	<li>Para a aquisição de lapso de tempo, use o vídeo li...

<ol>
	<li>Zangle, T. A., Teitell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+mass+profiling:+an+emerging+approach+in+quantitative+biophysics.">Live-cell mass profiling: an emerging approach in quantitative biophysics.</a> Nat Methods. 11 (12), 1221-1228 (2014).</li><li>Popescu, G., Park, K., Mir, M., Bashir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+technologies+for+measuring+single+cell+mass.">New technologies for measuring single cell mass.</a> Lab Chip. 14 (4), 646-652 (2014).</li><li>Reed, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+massively+parallel+single-cell+drug+response+measurements+via+live+cell+interferometry.">Rapid, massively parallel single-cell drug response measurements via live cell interferometry.</a> Biophys J. 101 (5), 1025-1031 (2011).</li><li>Mir, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+measurement+of+cycle-dependent+cell+growth.">Optical measurement of cycle-dependent cell growth.</a> Proc Natl Acad Sci. USA. 108 (32), 13124-13129 (2011).</li><li>Girshovitz, P., Shaked, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generalized+cell+morphological+parameters+based+on+interferometric+phase+microscopy+and+their+application+to+cell+life+cycle+characterization.">Generalized cell morphological parameters based on interferometric phase microscopy and their application to cell life cycle characterization.</a> Biomed Opt Express. 3 (8), 1757-1773 (2012).</li><li>Kemper, B., Bauwens, A., Vollmer, A., Ketelhut, S., Langehanenberg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+quantitative+cell+division+monitoring+of+endothelial+cells+by+digital+holographic+microscopy.">Label-free quantitative cell division monitoring of endothelial cells by digital holographic microscopy.</a> J Biomed Opt. 15 (3), (2010).</li><li>Mir, M., Bergamaschi, A., Katzenellenbogen, B. S., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+quantitative+imaging+for+monitoring+single+cancer+cell+growth+kinetics+and+drug+response.">Highly sensitive quantitative imaging for monitoring single cancer cell growth kinetics and drug response.</a> PLoS One. 9 (2), 1-8 (2014).</li><li>Bon, P., Savatier, J., Merlin, M., Wattellier, B., Monneret, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+detection+and+measurement+of+living+cell+morphometric+features+with+single-shot+quantitative+phase+microscopy.">Optical detection and measurement of living cell morphometric features with single-shot quantitative phase microscopy.</a> J Biomed Opt. 17 (7), (2012).</li><li>Aknoun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Living+cell+dry+mass+measurement+usinq+quantitative+phase+imaging+with+quadriwave+lateral+shearing+interferometry:+an+accuracy+and+sensitivity+discussion.">Living cell dry mass measurement usinq quantitative phase imaging with quadriwave lateral shearing interferometry: an accuracy and sensitivity discussion.</a> J Biomed Opt. 20 (1), 1-4 (2015).</li><li>Cotte, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marker-free+phase+nanoscopy.">Marker-free phase nanoscopy.</a> Nature Photonics. 7 (2), 113-117 (2013).</li><li>Choi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomographic+phase+microscopy.">Tomographic phase microscopy.</a> Nat Methods. 4 (9), 717-719 (2007).</li><li>Kesavan, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+monitoring+of+major+cell+functions+by+means+of+lensfree+video+microscopy.">High-throughput monitoring of major cell functions by means of lensfree video microscopy.</a> Sci Rep. 4, 1-11 (2014).</li><li>Zheng, G., Lee, S. A., Antebi, Y., Elowitz, M. B., Yang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ePetri+dish,+an+on-chip+cell+imaging+platform+based+on+subpixel+perspective+sweeping+microscopy+(SPSM).">The ePetri dish, an on-chip cell imaging platform based on subpixel perspective sweeping microscopy (SPSM).</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108 (41), 16889-16894 (2011).</li><li>Pushkarsky, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+single-cell+motility+analysis+on+a+chip+using+lensfree+microscopy.">Automated single-cell motility analysis on a chip using lensfree microscopy.</a> Sci Rep. 4, 4717 (2014).</li><li>Allier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+dense+cell+cultures+by+multiwavelength+lens-free+video+microscopy.">Imaging of dense cell cultures by multiwavelength lens-free video microscopy.</a> Cytom Part A. 91 (5), 1-10 (2017).</li><li>Su, T. -. W., Seo, S., Erlinger, A., Ozcan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+lensfree+imaging+and+characterization+of+a+heterogeneous+cell+solution+on+a+chip.">High-throughput lensfree imaging and characterization of a heterogeneous cell solution on a chip.</a> Biotechnol Bioeng. 102 (3), 856-868 (2009).</li><li>Delacroix, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrospinal+fluid+lens-free+microscopy:+a+new+tool+for+the+laboratory+diagnosis+of+meningitis.">Cerebrospinal fluid lens-free microscopy: a new tool for the laboratory diagnosis of meningitis.</a> Sci Rep. 7, 39893 (2017).</li><li>Tinevez, J. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrackMate:+an+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking.">TrackMate: an open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2016).</li><li>Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+cell+mass+and+growth+dynamics.">Optical imaging of cell mass and growth dynamics.</a> Am J Physiol Physiol. 295 (2), 538-544 (2008).</li><li>Liu, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+refractive+index+for+cell+biology+and+disease+diagnosis:+past,+present+and+future.">Cell refractive index for cell biology and disease diagnosis: past, present and future.</a> Lab Chip. 16, 634-644 (2016).</li><li>Rapoport, D. H., Becker, T., Mamlouk, A. M., Schicktanz, S., Kruse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+validation+algorithm+allows+for+automated+cell+tracking+and+the+extraction+of+biologically+meaningful+parameters.">A novel validation algorithm allows for automated cell tracking and the extraction of biologically meaningful parameters.</a> PLoS One. 6 (11), e27315 (2011).</li><li>Al-Kofahi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+cell+lineage+construction:+A+rapid+method+to+analyze+clonal+development+established+with+murine+neural+progenitor+cells.">Automated cell lineage construction: A rapid method to analyze clonal development established with murine neural progenitor cells.</a> Cell Cycle. 5 (3), 327-335 (2006).</li><li>Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I., van Cappellen, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+in+cell+and+developmental+biology.">Tracking in cell and developmental biology.</a> Semin Cell Dev Biol. 20 (8), 894-902 (2009).</li><li>Posakony, J. W., England, J. M., Attardi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+growth+and+division+during+the+cell+cycle+in+HeLa+cells.">Mitochondrial growth and division during the cell cycle in HeLa cells.</a> J Cell Biol. 74 (2), 468-491 (1977).</li><li>Zocchi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+CD38+Increases+Intracellular+Calcium+Concentration+and+Reduces+Doubling+Time+in+HeLa+and+3T3+Cells.">Expression of CD38 Increases Intracellular Calcium Concentration and Reduces Doubling Time in HeLa and 3T3 Cells.</a> J Biol Chem. 273 (14), 8017-8024 (1979).</li><li>Reitzer, L. J., Wice, B. M., Kennell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+glutamine,+not+sugar,+is+the+major+energy+source+for+cultured+HeLa+cells.">Evidence that glutamine, not sugar, is the major energy source for cultured HeLa cells.</a> J Biol Chem. 254 (8), 2669-2676 (1979).</li><li>Benedetti, A. D. E., Joshi-barve, S., Rinker-Schaeffer, C., Rhoads, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Antisense+RNA+against+Initiation+Factor+eIF-4E+mRNA+in+HeLa+Cells+Results+in+Lengthened+Cell+Division+Times,+Diminished+Translation+Rates,+and+Reduced+Levels+of+Both+eIF-4E+and+the+p220+Component+of+eIF-4F.">Expression of Antisense RNA against Initiation Factor eIF-4E mRNA in HeLa Cells Results in Lengthened Cell Division Times, Diminished Translation Rates, and Reduced Levels of Both eIF-4E and the p220 Component of eIF-4F.</a> Mol Cell Biol. 11 (11), 5435-5445 (1991).</li><li>Kumei, Y., Nakajima, T., Sato, A., Kamata, N., Enomoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+G1+phase+duration+and+enhancement+of+c-myc+gene+expression+in+HeLa+cells+at+hypergravity.">Reduction of G1 phase duration and enhancement of c-myc gene expression in HeLa cells at hypergravity.</a> J Cell Sci. 93 (2), 221-226 (1989).</li><li>Ginzberg, M. B., Kafri, R., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+being+the+right+(cell)+size.">On being the right (cell) size.</a> Science. 348 (6236), 1245075 (2015).</li><li>Mathieu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+lens-free+imaging+of+cell+migration+in+diverse+physical+microenvironments.">Time-lapse lens-free imaging of cell migration in diverse physical microenvironments.</a> Lab Chip. 16 (17), 3304-3316 (2016).</li></ol>

Neste trabalho, mostramos que essa lente livre de microscopia pode ser usada dentro de uma incubadora para capturar a cinética de milhares de células. A fim de descrever a metodologia global, que nós explicamos como uma aquisição de lapso de tempo dia 2,7 de células HeLa em cultura pode ser analisada com algoritmos de controle de célula padrão. O resultado é um conjunto de dados com 2,2 x 106 medidas de célula e 10.584 faixas do ciclo celular. As aquisições foram realizadas sobre uma cultura de cé...

Células de mamíferos cultivadas ao longo de vários ciclos de célula de monitoramento e medição com precisão de pilha tamanho e célula massa seca é uma tarefa desafiadora. Várias técnicas de etiqueta livre ópticas são capazes de realizar esta tarefa1,2: fase de mudança interferometria3, microscopia holográfica digital (DHM)4,5,6, 7, quadriwave lateral corte interferometria8,9 e de10,de tomografia computadorizada quantitativa fase11. Esses métodos têm levado a muitos novos insights sobre a compreensão do ciclo celular de células de mamíferos. No entanto, eles raramente são acoplados com célula automática de algoritmos de controle e sua taxa de transferência permanece limitada, quando a medição da pilha trajetórias massa1 (N < 20 em respectivamente3,4,5 , 6). daí um método óptico romance é necessário medir trajetórias de massa celular com estatísticas grandes (N > 1000).
Neste trabalho, podemos demonstrar a capacidade da lente livre de microscopia imagem simultaneamente milhares de células diretamente dentro da incubadora, e então quantificar métricas de célula única ao longo de milhares de faixas individuais ciclo celular. Microscopia de lente-livre é uma fase quantitativa de imagem técnica que permite a aquisição de imagem da fase de células densamente em um grande campo de visão (tipicamente de várias dezenas de mm2, aqui 29,4 mm2)12,13 de14, ,15. Várias métricas no nível da célula única são determinadas, por exemplo, área de célula, massa seca, célula espessura, comprimento do eixo principal de célula de célula e12,de proporção15, de cada imagem de célula. Então, aplicando um algoritmo de rastreamento de celular, estas características podem ser plotadas para cada célula em função do tempo experimento14,15. Além disso, ao detectar a ocorrência de divisões celulares em faixas a célula, é possível extrair outras informações importantes, tais como a célula inicial secar massa (logo após a divisão celular), a massa seca celular final (antes da divisão celular) e a célula ciclo de duração, ou seja, o tempo entre duas divisões consecutivas15. Todas estas medidas podem ser computadas com muito boas estatísticas (N > 1000) desde que o grande campo de visão normalmente permitiria a análise de 200 a 10.000 células em uma única lente livre aquisição.
Para explicar esta metodologia baseada na lente livre de microscopia, descrevemos o protocolo para monitorar e quantificar uma cultura de célula HeLa 2,7 dias. Análise de dados é um processo de quatro etapas, com base em múltiplos de comprimento de onda reconstrução holográfica, rastreamento de celular, segmentação de célula e algoritmos de divisão celular. Aqui é mostrado que a resolução espacial e a taxa de quadros relativamente rápida (uma aquisição a cada 10 minutos), obtidos com esta configuração de lente livre de microscopia é compatível com algoritmos de controle de célula padrão. A análise completa deste dataset resulta na medição de 10.584 célula faixas sobre ciclos completos de célula.
Para resumir, a lente livre de microscopia é uma ferramenta poderosa para monitorar automaticamente milhares de sem rótulo, não sincronizado e células não modificadas por experiência; cada célula sendo controlada ao longo de vários ciclos de célula. Nossas medições, portanto, fornecem o valor médio dos vários parâmetros de célula, mas mais importante, a variabilidade inter celular sobre uma grande população de células.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="675">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:231px;">Cytonote lens-free video microscope&#160;</td>
			<td style="width:208px;">Iprasense</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Horus acquisition software</td>
			<td>Iprasense</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">6-well glass bottom culture plates</td>
			<td>MatTek corporation</td>
			<td>Part No: P06G-0-14-F&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM + GlutaMAX medium&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">heat-inactivated fetal calf serum&#160;</td>
			<td>Eurobio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">penicillin and streptomycin&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fibronectin&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matlab, image processing toolbox&#160;</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lens-free video microscopy for the dynamic and quantitative analysis of adherent cell culture

Aqui, demonstramos a lente livre vídeo microscopia nos permite capturar simultaneamente a cinética de milhares de células diretamente dentro da incubadora, e que é possível monitorar e quantificar células únicas ao longo de vários ciclos de célula. Descrevemos o protocolo completo usado para monitorar e quantificar uma cultura de célula HeLa 2,7 dias. Primeiro, aquisição de cultura de células é realizada com um microscópio lente livre de e, em seguida, os dados são analisados seguindo um processo de quatro etapas: comprimento de onda multi reconstrução holográfica, rastreamento de celular, celular segmentação e divisão celular deteção algoritmos. Como resultado, mostramos que é possível reunir um conjunto de dados apresentando mais de 10.000 faixas do ciclo celular e mais de 2 x 106 células morfológica medições.

Para o processo de reconstrução holográfica, o campo de luz é descrito por um campo escalar um (onde <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56580/56580eq4v3.jpg"> é o valor complexo de A no avião em distância z da posição de amostra e lateral <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/56580/56580eq5v3.jpg"> e no comprimento de onda λ). Propagação de luz é modelada pela teoria de Huygens-Fresnel, que fornece um kernel propagador <img alt="Equ...

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Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture

Lente livre de microscopia nos permite monitorar culturas celulares diretamente dentro da incubadora. Aqui descrevemos o protocolo completo usado para adquirir e analisar uma aquisição de 2,7 dia longo de culturas de células de HeLa, levando a um conjunto de dados de 2,2 x 106 medições de morfologia de célula individual e 10584 ciclo celular rastreia.

Lente livre de microscopia para a dinâmica e a análise quantitativa de cultura de células aderentes

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator ...

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