Name: lens-free video microscopy for the dynamic and quantitative analysis of adherent cell culture
Uploaded: 2018-02-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture at JoVE.com

Los autores no tienen nada que agradecer.

1. célula cultura control adquisición
<ol><li>Cultivar células HeLa en DMEM + glutamina (p. ej., GlutaMAX) suplementado con 10% (v/v) ternera fetal inactivado por calor del suero y el 1% penicilina y estreptomicina.</li>
	<li>Capa 6-pozo cristal placas inferior con fibronectina (25 μg/mL) durante 1 hora. Entonces la semilla 2 x 104 células por pocillo.</li>
	<li>Durante la adquisición, cambiar el medio cada 3 días.</li>
	<li>Para la adquisición de Time-lapse, utilizar el microscopio lente gr...

<ol>
	<li>Zangle, T. A., Teitell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+mass+profiling:+an+emerging+approach+in+quantitative+biophysics.">Live-cell mass profiling: an emerging approach in quantitative biophysics.</a> Nat Methods. 11 (12), 1221-1228 (2014).</li><li>Popescu, G., Park, K., Mir, M., Bashir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+technologies+for+measuring+single+cell+mass.">New technologies for measuring single cell mass.</a> Lab Chip. 14 (4), 646-652 (2014).</li><li>Reed, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+massively+parallel+single-cell+drug+response+measurements+via+live+cell+interferometry.">Rapid, massively parallel single-cell drug response measurements via live cell interferometry.</a> Biophys J. 101 (5), 1025-1031 (2011).</li><li>Mir, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+measurement+of+cycle-dependent+cell+growth.">Optical measurement of cycle-dependent cell growth.</a> Proc Natl Acad Sci. USA. 108 (32), 13124-13129 (2011).</li><li>Girshovitz, P., Shaked, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generalized+cell+morphological+parameters+based+on+interferometric+phase+microscopy+and+their+application+to+cell+life+cycle+characterization.">Generalized cell morphological parameters based on interferometric phase microscopy and their application to cell life cycle characterization.</a> Biomed Opt Express. 3 (8), 1757-1773 (2012).</li><li>Kemper, B., Bauwens, A., Vollmer, A., Ketelhut, S., Langehanenberg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+quantitative+cell+division+monitoring+of+endothelial+cells+by+digital+holographic+microscopy.">Label-free quantitative cell division monitoring of endothelial cells by digital holographic microscopy.</a> J Biomed Opt. 15 (3), (2010).</li><li>Mir, M., Bergamaschi, A., Katzenellenbogen, B. S., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+quantitative+imaging+for+monitoring+single+cancer+cell+growth+kinetics+and+drug+response.">Highly sensitive quantitative imaging for monitoring single cancer cell growth kinetics and drug response.</a> PLoS One. 9 (2), 1-8 (2014).</li><li>Bon, P., Savatier, J., Merlin, M., Wattellier, B., Monneret, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+detection+and+measurement+of+living+cell+morphometric+features+with+single-shot+quantitative+phase+microscopy.">Optical detection and measurement of living cell morphometric features with single-shot quantitative phase microscopy.</a> J Biomed Opt. 17 (7), (2012).</li><li>Aknoun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Living+cell+dry+mass+measurement+usinq+quantitative+phase+imaging+with+quadriwave+lateral+shearing+interferometry:+an+accuracy+and+sensitivity+discussion.">Living cell dry mass measurement usinq quantitative phase imaging with quadriwave lateral shearing interferometry: an accuracy and sensitivity discussion.</a> J Biomed Opt. 20 (1), 1-4 (2015).</li><li>Cotte, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marker-free+phase+nanoscopy.">Marker-free phase nanoscopy.</a> Nature Photonics. 7 (2), 113-117 (2013).</li><li>Choi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomographic+phase+microscopy.">Tomographic phase microscopy.</a> Nat Methods. 4 (9), 717-719 (2007).</li><li>Kesavan, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+monitoring+of+major+cell+functions+by+means+of+lensfree+video+microscopy.">High-throughput monitoring of major cell functions by means of lensfree video microscopy.</a> Sci Rep. 4, 1-11 (2014).</li><li>Zheng, G., Lee, S. A., Antebi, Y., Elowitz, M. B., Yang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ePetri+dish,+an+on-chip+cell+imaging+platform+based+on+subpixel+perspective+sweeping+microscopy+(SPSM).">The ePetri dish, an on-chip cell imaging platform based on subpixel perspective sweeping microscopy (SPSM).</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108 (41), 16889-16894 (2011).</li><li>Pushkarsky, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+single-cell+motility+analysis+on+a+chip+using+lensfree+microscopy.">Automated single-cell motility analysis on a chip using lensfree microscopy.</a> Sci Rep. 4, 4717 (2014).</li><li>Allier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+dense+cell+cultures+by+multiwavelength+lens-free+video+microscopy.">Imaging of dense cell cultures by multiwavelength lens-free video microscopy.</a> Cytom Part A. 91 (5), 1-10 (2017).</li><li>Su, T. -. W., Seo, S., Erlinger, A., Ozcan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+lensfree+imaging+and+characterization+of+a+heterogeneous+cell+solution+on+a+chip.">High-throughput lensfree imaging and characterization of a heterogeneous cell solution on a chip.</a> Biotechnol Bioeng. 102 (3), 856-868 (2009).</li><li>Delacroix, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrospinal+fluid+lens-free+microscopy:+a+new+tool+for+the+laboratory+diagnosis+of+meningitis.">Cerebrospinal fluid lens-free microscopy: a new tool for the laboratory diagnosis of meningitis.</a> Sci Rep. 7, 39893 (2017).</li><li>Tinevez, J. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrackMate:+an+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking.">TrackMate: an open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2016).</li><li>Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+cell+mass+and+growth+dynamics.">Optical imaging of cell mass and growth dynamics.</a> Am J Physiol Physiol. 295 (2), 538-544 (2008).</li><li>Liu, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+refractive+index+for+cell+biology+and+disease+diagnosis:+past,+present+and+future.">Cell refractive index for cell biology and disease diagnosis: past, present and future.</a> Lab Chip. 16, 634-644 (2016).</li><li>Rapoport, D. H., Becker, T., Mamlouk, A. M., Schicktanz, S., Kruse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+validation+algorithm+allows+for+automated+cell+tracking+and+the+extraction+of+biologically+meaningful+parameters.">A novel validation algorithm allows for automated cell tracking and the extraction of biologically meaningful parameters.</a> PLoS One. 6 (11), e27315 (2011).</li><li>Al-Kofahi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+cell+lineage+construction:+A+rapid+method+to+analyze+clonal+development+established+with+murine+neural+progenitor+cells.">Automated cell lineage construction: A rapid method to analyze clonal development established with murine neural progenitor cells.</a> Cell Cycle. 5 (3), 327-335 (2006).</li><li>Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I., van Cappellen, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+in+cell+and+developmental+biology.">Tracking in cell and developmental biology.</a> Semin Cell Dev Biol. 20 (8), 894-902 (2009).</li><li>Posakony, J. W., England, J. M., Attardi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+growth+and+division+during+the+cell+cycle+in+HeLa+cells.">Mitochondrial growth and division during the cell cycle in HeLa cells.</a> J Cell Biol. 74 (2), 468-491 (1977).</li><li>Zocchi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+CD38+Increases+Intracellular+Calcium+Concentration+and+Reduces+Doubling+Time+in+HeLa+and+3T3+Cells.">Expression of CD38 Increases Intracellular Calcium Concentration and Reduces Doubling Time in HeLa and 3T3 Cells.</a> J Biol Chem. 273 (14), 8017-8024 (1979).</li><li>Reitzer, L. J., Wice, B. M., Kennell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+glutamine,+not+sugar,+is+the+major+energy+source+for+cultured+HeLa+cells.">Evidence that glutamine, not sugar, is the major energy source for cultured HeLa cells.</a> J Biol Chem. 254 (8), 2669-2676 (1979).</li><li>Benedetti, A. D. E., Joshi-barve, S., Rinker-Schaeffer, C., Rhoads, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Antisense+RNA+against+Initiation+Factor+eIF-4E+mRNA+in+HeLa+Cells+Results+in+Lengthened+Cell+Division+Times,+Diminished+Translation+Rates,+and+Reduced+Levels+of+Both+eIF-4E+and+the+p220+Component+of+eIF-4F.">Expression of Antisense RNA against Initiation Factor eIF-4E mRNA in HeLa Cells Results in Lengthened Cell Division Times, Diminished Translation Rates, and Reduced Levels of Both eIF-4E and the p220 Component of eIF-4F.</a> Mol Cell Biol. 11 (11), 5435-5445 (1991).</li><li>Kumei, Y., Nakajima, T., Sato, A., Kamata, N., Enomoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+G1+phase+duration+and+enhancement+of+c-myc+gene+expression+in+HeLa+cells+at+hypergravity.">Reduction of G1 phase duration and enhancement of c-myc gene expression in HeLa cells at hypergravity.</a> J Cell Sci. 93 (2), 221-226 (1989).</li><li>Ginzberg, M. B., Kafri, R., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+being+the+right+(cell)+size.">On being the right (cell) size.</a> Science. 348 (6236), 1245075 (2015).</li><li>Mathieu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+lens-free+imaging+of+cell+migration+in+diverse+physical+microenvironments.">Time-lapse lens-free imaging of cell migration in diverse physical microenvironments.</a> Lab Chip. 16 (17), 3304-3316 (2016).</li></ol>

En este trabajo, mostramos que microscopía lente libre de vídeo puede utilizarse dentro de una incubadora para capturar la cinética de miles de células. Para describir la metodología global nos explicó cómo una adquisición de Time-lapse de 2,7 días de células HeLa en cultura puede ser analizada con algoritmos estándar de seguimiento de la célula. El resultado es un conjunto de datos con 2,2 x 106 células medidas y 10.584 pistas de ciclo celular. Las adquisiciones se realizaron en un cultivo de cé...

Monitoreo de células de mamíferos cultivadas a lo largo de varios ciclos de la célula y medir con precisión la célula tamaño y célula masa seca es una tarea difícil. Varias técnicas de etiqueta-libre ópticas son capaces de realizar esta tarea1,2: desfasaje interferometría3, microscopia holográfica digital (DHM)4,5,6, 7, quadriwave lateral corte interferometría8,9 y fase cuantitativa tomografía10,11. Estos métodos han conducido a muchas nuevas perspectivas en la comprensión del ciclo celular de células de mamíferos. Sin embargo rara vez se juntan con algoritmos de seguimiento automático de la célula y su rendimiento sigue siendo limitada cuando medición de células trayectorias masa1 (N < 20 respectivamente3,4,5 , 6). por lo tanto es necesario un novedoso método óptico para medir trayectorias masa celular con estadísticas grandes (N > 1000).
En este trabajo demostramos la capacidad de microscopía lente libre de vídeo imagen simultáneamente miles de células directamente dentro de la incubadora, y luego cuantificar métricas de unicelular a lo largo de miles de pistas de cada ciclo celular. Lente libre la microscopia es una fase cuantitativa, técnica que permite la adquisición de la imagen de la fase de células densamente sobre un gran campo de visión de la proyección de imagen (normalmente varias decenas de mm2, aquí 29,4 mm2)12,13 ,14,15. Se determinan varias métricas a nivel unicelular, por ejemplo, área de la célula, celular de masa seca, espesor de célula, célula eje mayor longitud y proporción12,15, de cada imagen de la célula. Luego, mediante la aplicación de un algoritmo de seguimiento de la célula, se pueden trazar estas características para cada célula individual en función del experimento tiempo14,15. Además, mediante la detección de la ocurrencia de divisiones celulares en las pistas de la célula, es posible extraer información importante tales como la celda inicial seca masa (justo después de la división de célula), la masa seca de la célula final (justo antes de la división de célula) y la célula ciclo de duración, es decir, el tiempo entre dos divisiones consecutivas15. Todas estas mediciones se pueden computar con muy buenas estadísticas (N > 1000) ya que el gran campo de visión por lo general permitiría el análisis de 200 a 10.000 células en una sola adquisición libre de lentes.
Para explicar esta metodología basada en microscopía lente libre de vídeo, se describe el protocolo para controlar y cuantificar un cultivo celular HeLa de 2,7 días. Análisis de datos es un proceso de cuatro pasos, basado en reconstrucción holográfica de la multi-longitud de onda, seguimiento de células, segmentación de la célula y algoritmos de la división celular. Aquí se demuestra que la resolución espacial y la velocidad de fotogramas relativamente rápido (una adquisición cada 10 minutos) con esta configuración de microscopía lente libre de vídeo es compatible con estándar algoritmos de seguimiento de la célula. El análisis completo de este conjunto de resultados en la medición de 10.584 celular pistas sobre ciclos celulares completos.
Para resumir, microscopía lente libre de vídeo es una herramienta poderosa para monitorizar automáticamente miles de sincronización, sin etiqueta y sin modificar las células por experimento; cada célula rastrean varios ciclos de la célula. Nuestras mediciones ofrecen el valor medio de varios parámetros de la celda, pero más importante aún, la variabilidad inter-célula sobre una gran población de células.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="675">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:231px;">Cytonote lens-free video microscope&#160;</td>
			<td style="width:208px;">Iprasense</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Horus acquisition software</td>
			<td>Iprasense</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">6-well glass bottom culture plates</td>
			<td>MatTek corporation</td>
			<td>Part No: P06G-0-14-F&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM + GlutaMAX medium&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">heat-inactivated fetal calf serum&#160;</td>
			<td>Eurobio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">penicillin and streptomycin&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fibronectin&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matlab, image processing toolbox&#160;</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lens-free video microscopy for the dynamic and quantitative analysis of adherent cell culture

Aquí, demostramos que video gratis lente microscopía nos permite capturar simultáneamente la cinética de miles de células directamente dentro de la incubadora y que es posible supervisar y cuantificar las células a lo largo de varios ciclos de la célula. Describimos el protocolo completo usado para monitorear y cuantificar un cultivo celular HeLa de 2,7 días. En primer lugar, se realiza adquisición de cultura de célula con un microscopio de lente-libre de vídeo, y luego los datos son analizados siguiendo un proceso de cuatro pasos: detección de segmentación y división celular de celular rastreo de celular, reconstrucción holográfica de la multi-longitud de onda, algoritmos. Como resultado, mostramos que es posible reunir un conjunto de datos cuenta con más de 10.000 pistas de ciclo celular y las mediciones de más de 2 x 106 células morfológica.

Para el proceso de reconstrucción holográfica, el campo de la luz se describe por un campo escalar A (donde <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56580/56580eq4v3.jpg"> es el complejo valor de A en el plano de la distancia z de la posición de la muestra y el lateral <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/56580/56580eq5v3.jpg"> y en la longitud de onda λ). Propagación de la luz es modelada por la teoría de Huygens-Fresnel que proporciona un nú...

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Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture

Microscopía lente libre de vídeo nos permite supervisar cultivos celulares directamente dentro de la incubadora. Aquí describimos el protocolo completo utilizado para adquirir y analizar una adquisición largo 2,7 días de cultivos de células HeLa, conduce a un conjunto de datos de 2.2 x 106 mediciones de morfología de la célula individual y ciclo celular 10584 pistas.

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Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator ...

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