Name: looking for driver pathways of acquired resistance to targeted therapy: drug resistant subclone generation and sensitivity restoring by gene knock-down
Uploaded: 2017-12-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Looking for Driver Pathways of Acquired Resistance to Targeted Therapy: Drug Resistant Subclone Generation and Sensitivity Restoring by Gene Knock-down at JoV

저자 박사 베로니카 Zanoni 원고를 편집 하는 것을 감사 하 고 싶습니다.

참고:이 프로토콜은 특별히 조정 되었습니다 그녀의 긍정적인 위 암 세포 선의 trastuzumab 인수 저항을 기본 메커니즘의 분석에 대 한. 필요한 모든 실험실 계기는 자료의 테이블에에서 보고 됩니다.
1입니다. 타겟된 치료 저항 Subclones 세대
참고: 이것은 가장 중요 하 고 어려운 사실은 다른 셀 라인 수 전시 하지 다른 감도 타겟된 치료 억제제를 ?...

<ol>
	<li>Gerber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+therapies:+a+new+generation+of+cancer+treatments.">Targeted therapies: a new generation of cancer treatments.</a> Am Fam Physician. 77 (3), 311-319 (2008).</li><li>Zhang, J., Yang, P. L., Gray, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cancer+with+small+molecule+kinase+inhibitors.">Targeting cancer with small molecule kinase inhibitors.</a> Nat Rev Cancer. 9 (1), 28-39 (2009).</li><li>Nelson, A. L., Dhimolea, E., Reichert, J. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trastuzumab+in+combination+with+chemotherapy+versus+chemotherapy+alone+for+treatment+of+HER2-positive+advanced+gastric+or+gastro-oesophageal+junction+cancer+(ToGA):+a+phase+3,+open-label,+randomised+controlled+trial.">Trastuzumab in combination with chemotherapy versus chemotherapy alone for treatment of HER2-positive advanced gastric or gastro-oesophageal junction cancer (ToGA): a phase 3, open-label, randomised controlled trial.</a> Lancet. 376 (9742), 687-697 (2010).</li><li>Shimoyama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+trastuzumab+and+lapatinib+inefficiency+in+gastric+cancer:+Future+steps+(Review).">Unraveling trastuzumab and lapatinib inefficiency in gastric cancer: Future steps (Review).</a> Mol Clin Oncol. 2 (2), 175-181 (2014).</li><li>Kelly, C. M., Janjigian, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genomics+and+therapeutics+of+HER2-positive+gastric+cancer-from+trastuzumab+and+beyond.">The genomics and therapeutics of HER2-positive gastric cancer-from trastuzumab and beyond.</a> J Gastrointest Oncol. 7 (5), 750-762 (2016).</li><li>Wong, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+landscape+and+genetic+heterogeneity+in+gastric+adenocarcinoma+revealed+by+whole-genome+sequencing.">Genomic landscape and genetic heterogeneity in gastric adenocarcinoma revealed by whole-genome sequencing.</a> Nat Commun. 5, 5477 (2014).</li><li>Oshima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lapatinib+sensitivities+of+two+novel+trastuzumab-resistant+HER2+gene-amplified+gastric+cancer+cell+lines.">Lapatinib sensitivities of two novel trastuzumab-resistant HER2 gene-amplified gastric cancer cell lines.</a> Gastric Cancer. 17 (3), 450-462 (2014).</li><li>Pignatta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+exposure+to+(R)-bicalutamide+generates+a+LNCaP+subclone+with+alteration+of+mitochondrial+genome.">Prolonged exposure to (R)-bicalutamide generates a LNCaP subclone with alteration of mitochondrial genome.</a> Mol Cell Endocrinol. 382 (1), 314-324 (2014).</li></ol>

맞춤 및 타겟 치료 성장 열정을 elicited 있다, 전통적인 화학 요법 약물, 즉, 약물 내성의 신속 하 고 예측할 수 없는 인수 같은 주요 장애물을 직면 하는이 소위 '스마트' 치료. 타겟된 치료의 결과 개선 하기 위해, 그들을 일으키는 원인이 되는 메커니즘의 더 나은 이해를 통해 약물 저항 문제를 해결 해야 합니다. 여기, 우리는 방법론을 광범위 하 게 액세스할 수 있는 시험관에 암 세포...

분자와 세포 생물학에 있는 중요 한 발견에 따라, 새로운 합성된 항 암 분자 수 선택적으로 종양 종류의 광범위 한 배열에 종양 신호 경로 대상으로 개발 되었습니다. 특히, 타겟된 치료제 종양학에서 독특한 속성의 두 가지 범주, 즉 합성 화학 화합물 및 재조합 단일 클론 항 체, 임상 성공 및 극적으로 변경 된 암 치료에서 달성 하는 것으로 알려져 있습니다. 최근 수십 년간1,2,3.
그럼에도 불구 하 고, 치료에 그들의 인상적인 초기 대응에도 불구 하 고 암 환자의 대부분 모든 타겟된 치료제, 단일 클론 항 체와 kinase 억제제 약물 저항을 개발 했습니다. 결과적으로, 약물 내성, 고전적인 항 암 약4에 대 한 주요 장애물은 여전히 신흥 표적으로 한 치료5,6에 대 한 큰 도전.
타겟된 치료에 저항을 내장 될 수 있습니다 (즉, 기본) 또는 (즉, 보조)를 인수. 본질적인 저항 보조 저항 약물 치료7응답의 기간 후에 발생 하는 반면 치료, 응답의 드 노 보 부족을 설명 합니다. 후자는 기본 종양의 대부분 내의 종양 세포의 작은 동료의 발생으로 인 한 또는 원심 비밀 해 부 틈새에 자리 잡고 있으며, 최대 90%까지 전시 저항 하나 이상의 타겟 치료제. 기본 타겟된 치료에 저항 개발 주로 분자 메커니즘 대상 유전자 변이 그 이해 완료8멀지는 다른 프로 생존 신호 통로의 중복 활성화에서 유래한 다.
이 작품에서는, 우리는 시간 및 비용 effective 접근의 약물 내성 세포 subclones의 세대에서 시작 하는 침묵의 설명에 타겟된 치료제 인수 저항 메커니즘 체 외에서 조사 제안 사용 감도 억제제, 테스트 작업 가설의 유효성을 검사 하는 사용 되는 중요 한 도구를 복원 하는 절차. 특히, 우리의 접근은 조사, 위 암, trastuzumab (예를 들어, Herceptin), HER2 단백질9의 세포 외 도메인을 대상으로 인간 답게 단일 클론 항 체를 저항 메커니즘에에서 사용 되었다. Trastuzumab + 화학요법 HER2 양성 전이성 유방암에 대 한 표준 첫 줄 치료로 널리 인정 됩니다. 그 안티 HER2 보여주는 최근 전 임상 연구 덕분에 치료에 있는 중요 한 활동 둘 다 생체 외에서 그리고 HER2 양성 vivo에서 위 암 모델10,11, HER2를 표적으로 하는 분자 약물 되었습니다. 임상 시험에서 광범위 하 게 검사, 일부는 여전히 지속적인 환자 위 식도 암12,13,,1415에 있습니다.
이러한 연구 환자 trastuzumab16, 유사 하 게 어떤 다른 타겟된 치료 억제제에 대 한 관찰은 저항을 발생의 상승 수를 강조 했다. 특히, trastuzumab의 응답 속도 47%, 그리고 trastuzumab + 화학요법에 환자에 대 한 평균 전반적인 생존은 불과 2.7 개월 환자 화학 요법 혼자17에 대 한 이상. 이 기본 trastuzumab 저항 유행 이다, 하는 동안 보조 trastuzumab 저항 불가피 하다 제안 했다. 이러한 이유로,이 neoplasia18의 내부 종양 유전자이 주어진 더욱 문제는 위 암에 HER2 타겟 치료 저항을 일으키는 메커니즘을 명확히 하는 긴급 한 필요가 있다.
또한,의 위 암에 trastuzumab 저항 메커니즘 설명 하 고, 부분적으로 신뢰할 수 있는 전 임상 모델 대표가 조건의 취득에 어려움으로 인해 어려운 입증 했다. 오시마 외 는 vivo에서 선택 방법을 trastuzumab 내성 위 암 세포 선, 작은 잔여 복 막 전이의 반복된 문화 trastuzumab19치료 후 구성 된의 보고. 그러나, 필요를, 특정 동물 처리 전문, 그리고 동물 윤리 위원회의 승인의 시간 그리고 비용 소모 메서드에 기여. 우리가이 작품에 설명 하는 방법은 간단 하 고 광범위 하 게 적용 이며 다른 종양 histotypes20에서 다른 치료 약물에 저항 메커니즘을 조사 하기 위해 쉽게 확장할 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Trizol Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td>TRIzol Reagent is a reagent for isolating high-quality total RNA or simultaneously isolating RNA, DNA, and protein from a variety of biological samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISCRIPT CDNA SYNTHESIS KIT</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708891</td>
			<td>The iScript cDNA synthesis kit is a sensitive and easy-to-use first-strand cDNA synthesis kit for gene expression analysis using real-time qPCR.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan gene expression assay</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4331182</td>
			<td>Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays consist of a pair of unlabeled PCR primers and a TaqMan probe with an Applied Biosystems FAM or VIC dye label on the 5&#8217; end and minor groove binder (MGB) and nonfluorescent quencher (NFQ) on the 3&#8217; end.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>78501</td>
			<td>Thermo Scientific M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent is designed to provide highly efficient total soluble protein extraction from cultured mammalian cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>78440</td>
			<td>Thermo Scientific Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) provides the convenience of a single solution with full protein sample protection for cell and tissue lysates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td>The Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Kit is a two-component, high-precision, detergent-compatible assay reagent set to measure (A562nm) total protein concentration compared to a protein standard.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610747</td>
			<td>Use 4x Laemmli Sample Buffer for preparation of samples for SDS PAGE. For reduction of samples, add a reducing agent such as 2-mercaptoethanol to the buffer prior to mixing with the sample.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8211;20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>456-1094</td>
			<td>Long-life TGX (Tris-Glycine eXtended) Gels have a novel formulation and can be used for both standard denaturing protein separations as well as native electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein WesternC Blotting Standards</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610376</td>
			<td>Precision Plus Protein Prestained Standards are available in Dual Color, All Blue, Kaleidoscope, and Dual Xtra formats. All four have the same gel migration patterns, with 3 high-intensity reference bands (25, 50, and 75 kD).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Tris/Glycine/SDS</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610732</td>
			<td>10x Tris/glycine/SDS is a premixed running buffer for separating protein samples by SDS-PAGE.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704156</td>
			<td>Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs for fast, efficient transfer of proteins from mini gels using the Trans-Blot Turbo Transfer System. Each vacuum sealed, ready-to-use transfer pack contains two buffer-saturated ion reservoir stacks and a prewetted PVDF membrane.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Protein StrepTactin-HRP Conjugate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610381</td>
			<td>StrepTactin-Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugate for chemiluminescent or colorimetric detection of Precision Plus Protein Unstained Protein Standards or Precision Plus Protein WesternC Protein Standards on western blots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immun-Star WesternC solution</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5572</td>
			<td>Immun-Star WesternC solution, a method of protein detection , detects mid-femtogram amounts of protein.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Negative Control</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12935300</td>
			<td>Negative Control siRNA has no significant sequence similarity to mouse, rat, or human gene sequences. The control has also been tested in cell-based screens and proven to have no significant effect on cell proliferation, viability, or morphology.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>opti-MEM Glutamax Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51985026</td>
			<td>Opti-MEM Medium is an improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in growth rate or morphology.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silencer Select Pre-Designed &#38; Validated siRNA</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>4390824</td>
			<td>RNA interference (RNAi) is the best way to effectively knock down gene expression to study protein function in a wide range of cell types.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13778075</td>
			<td>Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent offers an advanced, efficient solution for siRNA delivery. No other siRNA specific transfection reagent provides such easy and efficient siRNA delivery in a wide variety of cell lines including common cell types, stem cells and primary cells, as well as traditionally hard-to-transfect cell types.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-IQGAP1</td>
			<td>Invitrigen</td>
			<td>33-8900</td>
			<td>working concentration: 1:400 in 5% milk solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-mouse IgG-HRP: sc-2005</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-2005</td>
			<td>working concentration: 1:10000 in 5% milk solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P 7626</td>
			<td>this is an inhibitor of serine proteases and acetylcholinesterase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler for RT-PCR</td>
			<td>MJ Research</td>
			<td>MJ Research PTC-200 Thermal Cycler</td>
			<td>it allows temperature homogeneity and a ramping speed of up to 3&#176;C/sec. The protocol can be performed also with other thermalcyclers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real Time RT-PCR instrument</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>7500 RT-PCR system</td>
			<td>This is a five-color platform that uses fluorescence-based polymerase chain reaction (PCR) reagents to provide a relative quantification using comparative CT assay type. The protocol can be performed also with other thermalcyclers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvolume Spectrophotometers</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>It provides an accurate and fast acid nucleid measurement using little volume of sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blotting system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Trans-Blot Turbo system</td>
			<td>It perfoms a semy-dry transfer in a few minutes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition system and gel documentation</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Chemidoc image system</td>
			<td>It is easy to use for chemiluminescent detection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

looking for driver pathways of acquired resistance to targeted therapy: drug resistant subclone generation and sensitivity restoring by gene knock-down

지난 2 년간 의료 종양학에서 타겟된 치료 세포 독성 약물에서 변화를 보았다. 타겟된 치료제 더 인상적인 임상 효능과 전통적인 치료법 보다 부작용 최소화에 표시 하는 있지만 약물 저항 그들의 혜택을 주요 제한 되고있다. 임상 연습에 대상된 에이전트에 저항을 취득된의 여러 전 임상/생체 외에서 또는 vivo에서 모델 두 가지 전략을 사용 하 여 주로 개발 되었습니다: 인수 저항, 및 ii) 생체 외에서 의 genotypes 모델링 i) 유전자 조작 / vivo에서 저항 모델의 선택. 현재 작업에서 우리는 기본 메커니즘의 설명에 약물 내성 세포 subclones의 세대에서 시작 타겟된 치료제에 저항을 취득된에 대 한 책임을 조사 통합 프레임 워크를 제안 입을 절차는 억제 물 감도 복원에 사용. 간단한 시간 그리고 비용 effective 이렇게 광범위 하 게 적용 이며 다른 종양 histotypes에 다른 대상된 치료 약물에 저항 메커니즘을 조사를 쉽게 확장할 수 있습니다.

그림 1 실험 절차의 프레임 워크를 설명합니다. 3 위 암 세포-라인 HER2 trastuzumab에 민감한의 높은 수준의 표현 (IC50 < 마약, 그림 2A, 왼쪽된 그래프의 피크 플라즈마 수준) 타겟된 치료 에이전트를 포함 하는 문화 매체에서 성장 했다. 복용량은 10 배 trastuzumab (10 µ g/mL)의 피크 플라즈마 농도 시작 하는 복용량으로 설정 되었...

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Looking for Driver Pathways of Acquired Resistance to Targeted Therapy: Drug Resistant Subclone Generation and Sensitivity Restoring by Gene Knock-down

이것은 시간 및 비용 effective 생체 외에서 프로토콜의 타겟된 치료제 인수 저항 메커니즘을 조사 하는 암 관리에 높은 미 충족된 의료 필요 이다.

타겟된 치료에 저항을 취득의 드라이버 경로 찾고: 약물 내성 Subclone 생성 및 감도 유전자 때 려 눕에 의해 복원

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

에 약물 저항 관련 소설 스플 라이스 변종을 감지하는 RNA 시퀀싱을 사용하여<em&gt; 체외</em&gt; 암 모델

Drug resistance remains a major problem in the treatment of cancer for both hematological malignancies and solid tumors. Intrinsic or acquired resistance ...

연구

암 연구학

Anticancer Efficacy of Photodynamic Therapy with Lung Cancer-Targeted Nanoparticles

폐암 표적 나노 입자와 광 역학 치료의 항암 효능

Photodynamic therapy (PDT) is a non-invasive and non-surgical method representing an attractive alternative choice for lung cancer treatment. ...

Generation of Prostate Cancer Cell Models of Resistance to the Anti-mitotic Agent Docetaxel

반대로 mitotic 에이전트 Docetaxel에 전립선 암 세포 모델의 생성

Microtubule targeting agents (MTAs) are a mainstay in the treatment of a wide range of tumors. However, acquired resistance to chemotherapeutic drugs is a ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

마약 검사에 대 한 높은 처리량 3 차원 종양 Spheroids의 생성

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Assessment of Resistance to Tyrosine Kinase Inhibitors by an Interrogation of Signal Transduction Pathways by Antibody Arrays

항 체 배열에 의해 신호 변환 통로의 심문에 의해 Tyrosine Kinase 억제제에 평가

Cancer patients with an aberrant regulation of the protein phosphorylation networks are often treated with the tyrosine kinase inhibitors. Response rates ...

Oncogenic Gene Fusion Detection Using Anchored Multiplex Polymerase Chain Reaction Followed by Next Generation Sequencing

앵커드 멀티플렉스 폴리머라제 연쇄 반응을 이용한 종양발생 유전자 융합 검출 후 차세대 염기서열 분석

Gene fusions frequently contribute to the oncogenic phenotype of many different types of cancer. Additionally, the presence of certain fusions in samples ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

종양 항원 특이적 T 세포의 생성을 위한 인간 유도 만능 줄기 세포를 사용하여

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

A Murine Ommaya Xenograft Model to Study Direct-Targeted Therapy of Leptomeningeal Disease

렙토메뇌질환의 직접 표적 치료를 연구하는 뮤린 옴마야 제노이식 모델

Leptomeningeal disease (LMD) is an uncommon type of central nervous system (CNS) metastasis to the cerebral spinal fluid (CSF). The most common cancers ...

Patient-Derived Tumor Explants As a "Live" Preclinical Platform for Predicting Drug Resistance in Patients

환자 유래 종양은 환자의 약물 내성을 예측하기위한 "라이브"전임상 플랫폼으로 이월합니다.

An understanding of drug resistance and the development of novel strategies to sensitize highly resistant cancers rely on the availability of suitable ...

Spatial Profiling of Protein and RNA Expression in Tissue: An Approach to Fine-Tune Virtual Microdissection

조직에서 단백질 및 RNA 발현의 공간 프로파일링: 가상 미세 해부를 미세 조정하는 접근 방식

Multiplexing enables the assessment of several markers on the same tissue while providing spatial context. Spatial Omics technologies allow both protein ...