Name: development of an electrochemical dna biosensor to detect a foodborne pathogen
Uploaded: 2018-06-03T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen at JoVE.com

De auteurs wil erkentelijk voor de steun van Universiti Putra Maleisië.

Opmerking: Alle chemische en biochemische reagentia moeten worden gebruikt moeten worden van p.a. en gebruikt zonder verdere zuivering. Alle oplossingen met behulp van steriel gedeïoniseerd water voor te bereiden. Autoclaaf alle glaswerk vóór sterilisatie.
Let op: Gebruik alle passende veiligheidspraktijken bij het uitvoeren van laboratoriumactiviteiten met inbegrip van het gebruik van technische controles (zuurkast ' glovebox ') en persoonlijke beschermingsmiddelen (veiligheidsbril, handsc...

De kritische stappen in een kader voor de succesvolle ontwikkeling van dit soort elektrochemische biosensor zijn selectie van passende biologische erkenning elementen voor de transducer (nucleïnezuur of DNA hier); chemische aanpak voor de bouw van de sensing laag van de transducer; transductie materiaal; optimalisatie van DNA immobilisatie en kruising; en validatie van de ontwikkelde biosensor met behulp van echte monsters.
Core aan de succesvolle ontwikkeling van een gevoelige en selectieve ...

Een belangrijk onderwerp van openbare en wetenschappelijke debat in de afgelopen jaren, voedselvergiftiging is vooral geassocieerd met 3 agenten: micro-organismen1, chemische stoffen2en3van de parasieten. Besmet voedsel kan ernstige gezondheidsproblemen veroorzaken bij de mens, vooral in de hogere risicogroep voor mensen met een zwak immuunsysteem, ouderen, zwangere vrouwen, baby's en jonge kinderen4. Met meer dan een miljoen gevallen van acute diarree zich jaarlijks bij kinderen jonger dan 5 jaar in Afrika, Azië en Latijns-Amerika, voedselvergiftiging is een belangrijke wereldwijde ziekte5,6 en de World Health Organization heeft vastgesteld micro-organismen als de belangrijkste contribuant7. Vibrio parahaemolyticus onderscheidt zich onder de meest bekende virulente stammen. Meestal gevonden in kustgebieden, estuariene en mariene omgevingen8, is het een gram-negatieve bacterie, die actief zijn in hoge zout omgevingen wordt, en veroorzaakt ernstige menselijke gastro-enteritis toen gegeten in onvoldoende gekookt, onjuist afgehandelde of rauw marine producten-9. Zorg bovendien voor bestaande medische aandoeningen bij sommige mensen hen vatbaar voor infectie, sepsis of oor infecties die voortvloeien uit de V. parahaemolyticus10wond. De virulentiefactoren van V. parahaemolyticus hemolysine zijn onderverdeeld in twee soorten die tot de pathogenese van de ziekte bijdragen: thermostable directe hemolysine (TDH) gecodeerd door tdh genen en TDH-gerelateerde hemolysine gecodeerd door trh genen11. De markers (tdh en trh genen) van de virulentie van de V. parahaemolyticus zijn voornamelijk gevonden in klinische monsters in plaats van milieu exemplaren.
V. parahaemolyticus bezit het vermogen om te overleven onder een brede waaier van voorwaarden, snel reageren op veranderingen in het milieu12. Het mechanisme voor proliferatie escaleert zijn potentieel gevaar naarmate de toxiciteit in parallel met cel massa13toeneemt. Erger nog, klimaatverandering is het verstrekken van deze bacteriën met voldoende voorwaarden om te versnellen hun cel bevolking groei14. Als gevolg van de hoge frequentie moet V. parahaemolyticus worden gecontroleerd langs de levensmiddelenketen, met name in de handels- en productie van zeevruchten omdat deze producten waar ze worden aangetroffen in enorme hoeveelheden15,16 over de hele wereld. Op dit moment de bacteriën worden geïdentificeerd en geïsoleerd met behulp van een aantal methoden, met inbegrip van biochemische tests, verrijking en selectieve media17, enzyme-linked immunomagnetic sorptiemiddel assay (ELISA)18, pulse-field gelelektroforese (PFGE) 19, latex agglutinatietests en polymerase kettingreactie (PCR) tests20. Deze methoden vereisen meestal gekwalificeerd personeel, geavanceerde instrumenten en moeizame technieken die geen informatie over verontreiniging onmiddellijk geven. Dit beperkt ernstig de kans op schadelijke verontreiniging en on-site toepassingen onmiddellijk te detecteren. Snelle detectieprogramma's blijven een belangrijke uitdaging is.
Biosensing is in opkomst als een veelbelovende optie voor de detectie van door voedsel overgedragen ziekteverwekkers omdat het biedt u een tijdbesparende, rendabele, praktische en real-time analyse methode21,22,23,24 . Al zijn er veel positieve resultaten voor de detectie van de analyt in verrijkte monsters en standaardoplossing met behulp van biosensoren, is er echter nog steeds een gebrek aan onderzoek toegepast op echte monsters in waterige mengsels of organische extracten25. Onlangs, elektrochemische biosensoren met behulp van directe en/of indirecte deoxyribonucleic acid (DNA) detectie verhoogde aandacht onder wetenschappers, als gevolg van hun specifieke detectie van de complementaire doelstelling via een kruising gebeurtenis26 hebben gekregen , 27 , 28 , 29. deze unieke benaderingen zijn stabieler in vergelijking met enzym gebaseerde biosensoren, waardoor een veelbelovende technologie voor miniaturisatie en commercialisering. Het doel van de studie gemeld hier is voor de bouw van een snel hulpmiddel dat V. parahaemolyticus met hoge selectiviteit, gevoeligheid en bruikbaarheid detecteren kan, gebaseerd op de DNA sequentie specificiteit tijdens hybridisatie. Identificatie strategieën betrekking hebben op de combinatie van polylactic acid-gestabiliseerde gouden nanodeeltjes (PLA-AuNPs)30 en gezeefdrukt Koolelektroden (SPCEs) in aanwezigheid van de kruising indicator, methyleenblauw (MB). Het potentieel van de ontwikkelde detectie constructie wordt verder onderzocht met behulp van bacteriën DNA lysate en verse kokkel monsters.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaminoethane tetraacetic acid</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibasic sodium phosphate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium hydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>255793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>16368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold (III) chloride trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>520918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M44907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monobasic sodium phosphate, monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(lactic acid) resin, commercial grade 4042D</td>
			<td>NatureWorks</td>
			<td>4042D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>R&#38;M Chemicals</td>
			<td>59435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hexacyanoferrate III</td>
			<td>R&#38;M Chemicals</td>
			<td>208019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate anhydrous salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl) aminomethane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>T395-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X PCR Master Mix with Dual-Dye</td>
			<td>Norgen Biotek</td>
			<td>28240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose gel</td>
			<td>Merck</td>
			<td>101236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolton Agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolton Broth</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHROMagar Vibrio</td>
			<td>CHROMagar</td>
			<td>VB910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>Promega</td>
			<td>U1511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin methylene blue agar&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>101347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelRed</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>41001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Go Taq Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading dye 100 bp DNA ladder</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G2101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading dye 1kb DNA ladder</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G5711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Promega</td>
			<td>91176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol egg yolk polymyxin agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McConkey Agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutrient Broth</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq polymerase</td>
			<td>Merck</td>
			<td>71003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticase Soy Broth</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticase Soy Agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105458</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of an electrochemical dna biosensor to detect a foodborne pathogen

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is een gemeenschappelijk foodborne ziekteverwekker die aan een groot aantal problemen voor de volksgezondheid wereldwijd bijdraagt, aanzienlijke invloed zijn op het tempo van de menselijke mortaliteit en morbiditeit. Conventionele methodes voor het opsporen van V. parahaemolyticus zoals cultuur gebaseerde methoden, immunologische testen en moleculaire gebaseerde methoden vereisen ingewikkeld monster behandeling en zijn duur, tijdrovend en vervelend. Onlangs, biosensoren hebben bewezen een veelbelovende en uitgebreide detectiemethode met de voordelen van snelle detectie, kosteneffectiviteit en bruikbaarheid. Dit onderzoek richt zich op het ontwikkelen van een snelle methode voor het opsporen van V. parahaemolyticus met hoge selectiviteit en gevoeligheid op basis van de beginselen van DNA hybridisatie. In het werk, werd karakterisering van gesynthetiseerde polylactic acid-gestabiliseerde gouden nanodeeltjes (PLA-AuNPs) bereikt met behulp van röntgendiffractie (XRD), UV-zichtbaar-spectroscopie (UV-Vis), transmissie-elektronenmicroscopie (TEM), veld-emissie Scanning elektronen microscopie (FESEM), en cyclische voltammetrie (CV). Ook voerden we verder testen van stabiliteit, gevoeligheid en reproduceerbaarheid van de PLA-AuNPs. We vonden dat de PLA-AuNPs een degelijke structuur van gestabiliseerde nanodeeltjes in waterige oplossing gevormd. We hebben ook vastgesteld dat de gevoeligheid verbeterd als gevolg van de kleinere gratis overdracht (Rct) weerstandswaarde en een toename van actieve oppervlakte (0.41 cm2). De ontwikkeling van onze DNA biosensor was gebaseerd op de wijziging van een gezeefdrukt koolstof-elektrode (SPCE) met PLA-AuNPs en het gebruik van methyleenblauw (MB) als de redox-indicator. Wij beoordeeld vinden de gebeurtenissen immobilisatie en kruising door differential pulse voltammetrie (DPV). Vonden we dat aanvullende, niet-complementaire en niet-overeenkomende oligonucleotides werden specifiek onderscheiden door de verzonnen biosensor. Het bleek ook betrouwbaar gevoelige detectie in Kruisallergie studies tegen verschillende voedsel overgedragen ziekteverwekkers en de identificatie van de V. parahaemolyticus in verse kokkels.

Vorming van AuNPs werd geopenbaard door de verandering in de kleur van de waterige oplossing met Natriumcitraat aanwezig. Dit veroorzaakt de kleur overstappen van licht geel op een diep Robijnrood. De generatie van PLA-AuNPs werd bevestigd van de UV-vis-spectra (Figuur 1), waar de groei van de oppervlakte plasmon resonantie (SPR) piek werd aangetroffen bij ongeveer 540 nm. De oprichting en het bestaan van PLA-AuNPs werd aangegeven op de 500-600 nm golflengte ...

Watch this Scientific Journal Video about Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen at JoVE.com

Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

Ontwikkeling van een elektrochemische DNA Biosensor te detecteren een Foodborne Pathogen

Een protocol voor de ontwikkeling van een elektrochemische DNA biosensor bestaat uit een polylactic acid-gestabiliseerde, gouden nanodeeltjes gemodificeerde, gezeefdrukt koolstof elektrode voor het detecteren van Vibrio parahaemolyticus wordt gepresenteerd.

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

Fabricatie van elektrochemische-DNA Biosensoren voor de Reagentless detectie van nucleïnezuren, eiwitten en kleine moleculen

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Ontwerp van een Cyclic Pressure Bioreactor voor de Ex Vivo Studie van Aorta hartkleppen

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Hollow Microneedle-based Sensor for Multiplexed Transdermal Electrochemical Sensing

Holle microneedle-gebaseerde sensor voor multiplexverzending transdermale Elektrochemische Sensing

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals ...

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

Bacteriële Detection &amp; Identification gebruiken elektrochemische sensoren

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

High-throughput, Automated Extraction of DNA and RNA from Clinical Samples using TruTip Technology on Common Liquid Handling Robots

High-throughput, geautomatiseerde extractie van DNA en RNA uit klinische monsters met behulp TruTip Technology op Common Liquid Handling Robots

TruTip is a simple nucleic acid extraction  technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a  pipette tip. The geometry of the ...

Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria

Biosensor voor de detectie van antibiotica resistente Staphylococcus bacteriën

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) ...

Sensing of Barrier Tissue Disruption with an Organic Electrochemical Transistor

Sensing van Barrier weefselverstoring met een Organic elektrochemische Transistor

The gastrointestinal tract is an example of barrier tissue that provides a physical barrier against entry of pathogens and toxins, while allowing the ...

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

A-Microfluidic gebaseerd Elektrochemische Biochip voor-Label vrij DNA hybridisatie-analyse

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

Ontwikkeling van een<em&gt; In Vitro</em&gt; Ocular Platform Contactlenzen Test

Currently, in vitro evaluations of contact lenses (CLs) for drug delivery are typically performed in large volume vials,1-6 which fail to mimic ...

The Use of a &#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

The Use of a ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

Het gebruik van een β-lactamase gebaseerde Conductimetric Biosensor Assay voor het detecteren van biomoleculaire interacties

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental ...