Name: development of an electrochemical dna biosensor to detect a foodborne pathogen
Uploaded: 2018-06-03T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen at JoVE.com

Les auteurs tiennent à souligner l’appui de l’Universiti Putra Malaysia.

Remarque : Tous les réactifs chimiques et biochimiques à utiliser doivent être de qualité analytique et utilisés sans davantage de purification. Préparer toutes les solutions à l’aide de l’eau désionisée stérile. Autoclave toute la verrerie avant la stérilisation.
ATTENTION : S’il vous plaît utilisez toutes les pratiques de sécurité qui s’imposent lors de l’exécution des activités de laboratoire, y compris l’utilisation de contrôles (hotte aspirante, boîte à ga...

Les étapes essentielles dans un cadre de mise au point de ce type de biocapteurs électrochimiques sont le choix des éléments de reconnaissance biologique approprié pour le transducteur (acide nucléique ou ADN ici) ; approche chimique pour la construction de la couche sensible du capteur ; matériel de transduction ; optimisation de l’immobilisation de l’ADN et l’hybridation ; et la validation de la biocapteur développé en utilisant des échantillons réels.
De base de la réu...

Un important sujet de débat public et scientifique au cours des dernières années, l’intoxication alimentaire est principalement associée à 3 principes : microorganismes1, produits chimiques2et parasites3. Des aliments contaminés peuvent provoquer des conséquences graves pour la santé chez les humains, en particulier dans le groupe à risque plus élevé de ceux qui ont un système immunitaire faible, les personnes âgées, les femmes enceintes, bébés et jeunes enfants4. Avec plus de 1 million de cas de diarrhée aiguë survenant chaque année chez les enfants âgés de moins de 5 ans en Afrique, Asie et Amérique latine, l’intoxication alimentaire est une maladie mondiale majeure5,6 , et l’Organisation mondiale de la santé a mis en place microorganismes comme le plus important contributeur7. Vibrio parahaemolyticus se distingue parmi les souches virulentes les plus largement reconnues. Trouve généralement dans des environnements côtiers, estuariens et marins8, c’est une bactérie Gram-négative, qui devenue actif dans des environnements de sels élevées et provoque sérieuse gastro-entérite humaine lorsqu’ils sont consommés dans les marines mal cuit, mal ou cru produits9. En outre, les conditions médicales préexistantes chez certaines personnes rendent sujette à une infection, septicémie ou oreille infection résultant de V. parahaemolyticus10des plaies. Les facteurs de virulence de V. parahaemolyticus hémolysines sont divisés en deux types qui contribuent à la pathogenèse de la maladie : hémolysine directe thermostable (TDH) codées par des gènes de tdh et hémolysine TDH liées codées par des gènes de trh11. Les marqueurs de virulence (gènes tdh et trh) de V. parahaemolyticus sont surtout présents dans les échantillons cliniques plutôt que dans des échantillons environnementaux.
V. parahaemolyticus possède la capacité de survivre dans un large éventail de conditions, répondre rapidement aux changements environnementaux12. Son mécanisme de prolifération s’intensifie son potentiel de danger que sa toxicité augmente en parallèle avec la cellule masse13. Pire encore, le changement climatique offre ces bactéries avec des conditions suffisamment pour accélérer leur de croissance de population de cellule14. En raison de sa haute fréquence, V. parahaemolyticus doit être surveillée le long de la chaîne d’approvisionnement alimentaire, en particulier dans le commerce et la production de fruits de mer étant donné que ces produits sont où ils se trouvent en quantités énormes15,16 dans le monde entier. Actuellement, les bactéries sont identifiés et isolés à l’aide d’un éventail de méthodes, y compris les tests biochimiques, enrichissement et milieux sélectifs17, immunomagnetic-enzymatique sorbant assay (ELISA)18, électrophorèse en champ pulse (PFGE) 19, tests d’agglutination au latex et polymerase chain reaction (PCR) essais20. Ces méthodes exigent habituellement un personnel qualifié, des instruments sophistiqués et techniques laborieuses qui ne fournissent pas d’informations sur la contamination immédiatement. Cela limite fortement la probabilité de détecter promptement contamination nocive et applications sur place. Outils de détection rapide demeurent un défi exceptionnel.
Biodétection s’impose comme une solution prometteuse pour la détection des pathogènes d’origine alimentaire car il offre un gain de temps, économique, pratique et en temps réel analyse méthode21,22,23,24 . Cependant, bien qu’il y a eu de nombreux résultats positifs de l’analyte détection dans des échantillons enrichis et solution standard à l’aide de biocapteurs, il subsiste un manque de recherche appliquée à des échantillons réels dans des mélanges aqueux ou extraits organiques25. Récemment, des biocapteurs électrochimiques utilisant une détection directe et/ou indirecte l’acide désoxyribonucléique (ADN) ont reçu une attention accrue parmi les scientifiques, en raison de leur détection spécifique de la cible complémentaire via une hybridation événement26 , 27 , 28 , 29. ces approches uniques sont plus stables en comparaison de biocapteurs à base d’enzymes, offrant ainsi une technologie prometteuse pour la miniaturisation et de la commercialisation. L’objectif de l’étude ont signalé ici est de construire un outil rapide pouvant détecter V. parahaemolyticus avec haute sélectivité, la sensibilité et praticité, basée sur la spécificité de séquence d’ADN au cours de l’hybridation. Les stratégies d’identification impliquent la combinaison de polylactique acide-stabilisé nanoparticules d’or (PLA-AuNPs)30 et électrodes en carbone sérigraphié (SPCEs) en présence de l’indicateur de l’hybridation, le bleu de méthylène (MB). Le potentiel de la construction de détection avancés est approfondi en utilisant des échantillons de bactéries ADN cockle lysat et fraîche.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaminoethane tetraacetic acid</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibasic sodium phosphate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium hydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>255793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>16368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold (III) chloride trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>520918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M44907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monobasic sodium phosphate, monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(lactic acid) resin, commercial grade 4042D</td>
			<td>NatureWorks</td>
			<td>4042D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>R&#38;M Chemicals</td>
			<td>59435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hexacyanoferrate III</td>
			<td>R&#38;M Chemicals</td>
			<td>208019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate anhydrous salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl) aminomethane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>T395-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X PCR Master Mix with Dual-Dye</td>
			<td>Norgen Biotek</td>
			<td>28240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose gel</td>
			<td>Merck</td>
			<td>101236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolton Agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolton Broth</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHROMagar Vibrio</td>
			<td>CHROMagar</td>
			<td>VB910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>Promega</td>
			<td>U1511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin methylene blue agar&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>101347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelRed</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>41001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Go Taq Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading dye 100 bp DNA ladder</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G2101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading dye 1kb DNA ladder</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G5711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Promega</td>
			<td>91176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol egg yolk polymyxin agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McConkey Agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutrient Broth</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq polymerase</td>
			<td>Merck</td>
			<td>71003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticase Soy Broth</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticase Soy Agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105458</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of an electrochemical dna biosensor to detect a foodborne pathogen

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) est un pathogène d’origine alimentaire commune qui contribue à une grande partie des problèmes de santé publique dans le monde, affectant de manière notable le taux de morbidité et de mortalité humaine. Les méthodes conventionnelles pour la détection de V. parahaemolyticus tels que les méthodes axées sur la culture, tests immunologiques et moléculaires des méthodes nécessitent la manipulation des échantillons complexes et sont long, fastidieux et coûteux. Récemment, les biocapteurs ont prouvé être une méthode de détection prometteurs et complet avec les avantages d’une détection rapide, coût-efficacité et praticité. Cette recherche porte sur l’élaboration d’une méthode rapide de détection V. parahaemolyticus avec une sélectivité élevée et une sensibilité en utilisant les principes de l’hybridation de l’ADN. Dans le travail, caractérisation des nanoparticules or des stabilisés acide polylactique synthétisés (PLA-AuNPs) a été réalisée à l’aide de la Diffraction des rayons x (DRX), spectroscopie Ultraviolet-visible (UV-Vis), microscopie électronique à Transmission (TEM), émission de champ Microscopie électronique à balayage (FESEM) et la voltampérométrie cyclique (CV). Nous avons effectué également nouveaux essais de stabilité, la sensibilité et la reproductibilité de la PLA-AuNPs. Nous avons trouvé que le PLA-AuNPs forment une structure solide de nanoparticules stabilisées en solution aqueuse. Nous avons également observé que la sensibilité améliorée grâce à la plus petite valeur de la résistance (Rct) transfert de charge et une augmentation de la surface active (0,41 cm2). Le développement de notre biocapteur ADN reposait sur la modification d’une électrode de carbone sérigraphié (SPCE) avec PLA-AuNPs et à l’aide de bleu de méthylène (MB) comme indicateur rédox. Nous avons évalué les événements de l’immobilisation et l’hybridation par voltamétrie impulsionnelle différentielle (DPV). Nous avons constaté que complémentaires, non complémentaires et oligonucléotides dépareillées étaient particulièrement distingués par le biocapteur fabriqué. Elle a également montré fiable de sensibilité de détection dans les études de réactivité croisée contre divers pathogènes d’origine alimentaire et dans l’identification de V. parahaemolyticus dans les coques fraîches.

Formation de AuNPs a été révélée par le changement de couleur de la solution aqueuse avec du citrate de sodium présent. Cela a provoqué la couleur changer du jaune clair au rouge rubis profond. La génération de PLA-AuNPs a été confirmée dans les spectres UV-vis (Figure 1) où la croissance du pic surface plasmon resonance (SPR) a été trouvée à environ 540 nm. La formation et l’existence de PLA-AuNPs a été indiqué aux gammes de longueur d?...

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Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

Développement d’un Biocapteur électrochimique ADN pour détecter un pathogène d’origine alimentaire

Un protocole pour le développement d’un Biocapteur électrochimique d’ADN comportant une électrode de carbone acide-stabilisé, or de nanoparticules modifiés, sérigraphié de polylactique pour détecter les Vibrio parahaemolyticus est présenté.

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, ...

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