Name: development of an electrochemical dna biosensor to detect a foodborne pathogen
Uploaded: 2018-06-03T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen at JoVE.com

Die Autoren möchten die Unterstützung der Universiti Putra Malaysia bestätigen.

Hinweis: Die chemischen und biochemische Reagenzien verwendet werden sollte der analysenrein und ohne weitere Reinigung verwendet. Bereiten Sie alle Lösungen mit sterilen deionisiertes Wasser. Autoklav alle Gläser vor der Sterilisation.
Achtung: Bitte verwenden alle geeigneten Sicherheitsmaßnahmen beim Labortätigkeiten, einschließlich des Einsatzes von technischen Kontrollen (Abzugshaube, Handschuhfach) durchführen und persönliche Schutzausrüstung (Schutzbrille, Handschuhe, Kittel, vol...

Die entscheidenden Schritte in einen Rahmen für die erfolgreiche Entwicklung dieser Art von elektrochemische Biosensor sind Auswahl der geeigneten biologischen erkennungselemente für den Wandler (Nukleinsäure oder DNA hier); chemischen Ansatz für den Bau der Fernerkundungen Schicht des Wandlers; Transduktion Material; Optimierung der DNA Immobilisierung und Hybridisierung; und Validierung der entwickelten Biosensor mit realen Proben.
Für die erfolgreiche Entwicklung der empfindliche und s...

Ein wichtiges Thema der öffentlichen und wissenschaftlichen Diskussion in den letzten Jahren, Lebensmittelvergiftung wird hauptsächlich mit 3 Agenten: Mikroorganismen1, Chemikalien2und Parasiten3. Kontaminierter Lebensmittel kann dazu führen, dass schwerwiegende gesundheitliche Folgen beim Menschen, vor allem in höheren Risikogruppe der Personen mit geschwächtem Immunsystem, ältere Menschen, Schwangere, Säuglinge und Kleinkinder4. Mit mehr als 1 Million Fälle von akuter Durchfall bei Kindern unter 5 Jahren in Afrika, Asien und Lateinamerika jährlich auftretenden Lebensmittelvergiftungen ist eine wichtige globale Krankheit5,6 und der World Health Organization gegründet Mikroorganismen als wichtigsten Faktor7. Vibrio Parahaemolyticus zeichnet sich unter den bekanntesten virulente Stämme. In der Regel in Küsten-, Flussmündungen und marine8gefunden, ist es ein gramnegatives Bakterium, wird im hohen Salz Umgebungen aktiv, und verursacht schwere menschliche Gastroenteritis beim Verzehr in ungenügend gekocht, fehlgeleitetes oder roh marine Produkte-9. Darüber hinaus machen Vorerkrankungen bei manchen Menschen sie anfällig für Infektionen, Septikämie oder Ohr-Infektion aus V. Parahaemolyticus10gewickelt. Die Virulenzfaktoren von V. Parahaemolyticus hämolysinen gliedern sich in zwei Arten, die an der Pathogenese der Erkrankung beitragen: thermostabile direkten hlya (TDH) von Tdh Gene codiert und TDH-bezogene hlya von Trh Gene11codiert. Die Virulenz-Marker (Tdh und Trh Gene) von V. Parahaemolyticus befinden sich meist in klinischen Proben nicht in Umweltproben.
V. Parahaemolyticus besitzt die Fähigkeit, unter den unterschiedlichsten Bedingungen überleben, reagiert schnell auf Veränderungen der Umwelt12. Seine Verbreitung Mechanismus eskaliert sein Gefahrenpotenzial, als seine Giftigkeit parallel zu Zelle Masse13erhöht. Noch schlimmer ist, stellt Klimawandel diese Bakterien mit reichlich Bedingungen ihre Zelle Bevölkerung Wachstum14zu beschleunigen. Aufgrund seiner hohen Frequenz muss V. Parahaemolyticus überwacht werden entlang der Food Supply Chain, insbesondere beim Handel und Produktion von Meeresfrüchten, da diese Produkte sind wo sie sich befinden, in enormen Mengen15,16 überall auf der Welt. Derzeit werden die Bakterien identifiziert und isoliert mit einer Reihe von Methoden, einschließlich biochemischen Tests, Bereicherung und selektivmedien17, Enzym-linked Immunomagnetic sorbent assay (ELISA)18, Puls-Bereich Gelelektrophorese (PFGE) 19, Latex Agglutination Prüfungen und Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Tests20. Diese Methoden erfordern in der Regel qualifiziertes Personal, ausgefeilte Instrumente und aufwendige Techniken, die Informationen über Verunreinigung nicht sofort angeben. Dies schränkt die Wahrscheinlichkeit schädlichen Verunreinigungen und vor-Ort-Anwendungen sofort zu erkennen. Schnellnachweis Werkzeuge bleiben eine hervorragende Herausforderung.
Biosensoren zeichnet sich als eine vielversprechende Option für den Nachweis von lebensmittelbedingten Krankheitserregern, denn es eine zeitsparende, kostengünstige, praktische und Echtzeit-Analyse-Methode21,22,23,24 bietet . Zwar gab es viele positive Ergebnisse der Analyten Erkennung dotierten Proben und Standardlösung mit Biosensoren, bleibt es jedoch ein Mangel an Forschung auf realen Proben in wässrigen Gemischen oder Bio-Extrakte25angewendet. Vor kurzem erhielten elektrochemische Biosensoren mit direkte und/oder indirekte Desoxyribonukleinsäure (DNA) Erkennung erhöhte Aufmerksamkeit unter den Wissenschaftlern, aufgrund ihrer spezifischen Nachweis der komplementären Ziel über eine Hybridisierung Event26 , 27 , 28 , 29. diese einzigartige Ansätze sind stabiler im Vergleich zu den Enzym-basierte Biosensoren, bietet somit eine viel versprechende Technologie für Miniaturisierung und Vermarktung. Das Ziel der Studie berichtet, soll hier ein schnelles Werkzeug zu konstruieren, die V. Parahaemolyticus mit hoher Selektivität, Sensibilität und Praktikabilität, basierend auf der DNA-Sequenz Spezifität bei Hybridisierung erkennen kann. Identifikation-Strategien beinhalten die Kombination aus Polymilchsäure Säure stabilisiert gold-Nanopartikeln (PLA-AuNPs)30 und Siebdruck Kohleelektroden (SPCEs) in Anwesenheit der Hybridisierung Indikator, Methylenblau (MB). Das Potenzial des Konstrukts entwickelten Erkennung ist weiter untersucht mit Bakterien DNA lysate und frische Herzmuscheln Proben.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaminoethane tetraacetic acid</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibasic sodium phosphate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium hydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>255793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>16368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold (III) chloride trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>520918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M44907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monobasic sodium phosphate, monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(lactic acid) resin, commercial grade 4042D</td>
			<td>NatureWorks</td>
			<td>4042D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>R&#38;M Chemicals</td>
			<td>59435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hexacyanoferrate III</td>
			<td>R&#38;M Chemicals</td>
			<td>208019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate anhydrous salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl) aminomethane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>T395-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X PCR Master Mix with Dual-Dye</td>
			<td>Norgen Biotek</td>
			<td>28240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose gel</td>
			<td>Merck</td>
			<td>101236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolton Agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolton Broth</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHROMagar Vibrio</td>
			<td>CHROMagar</td>
			<td>VB910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>Promega</td>
			<td>U1511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin methylene blue agar&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>101347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelRed</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>41001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Go Taq Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading dye 100 bp DNA ladder</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G2101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading dye 1kb DNA ladder</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G5711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Promega</td>
			<td>91176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol egg yolk polymyxin agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McConkey Agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutrient Broth</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq polymerase</td>
			<td>Merck</td>
			<td>71003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticase Soy Broth</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticase Soy Agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105458</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of an electrochemical dna biosensor to detect a foodborne pathogen

Vibrio Parahaemolyticus (V. Parahaemolyticus) ist eine gemeinsame lebensmittelbedingten Erreger, die für einen Großteil der Probleme der öffentlichen Gesundheit Global gesehen trägt erheblich auf die Rate der menschlichen Sterblichkeit und Morbidität. Konventionelle Methoden für den Nachweis von V. Parahaemolyticus wie Kultur-basierte Methoden, immunologischen Assays und molekularen Methoden erfordern komplizierte Probenbehandlung und sind zeitraubend, mühsam und teuer. Vor kurzem, Biosensoren erwiesen sich eine viel versprechende und umfassende Methode mit den Vorteilen der schnellen Erkennung, Wirtschaftlichkeit und Zweckmäßigkeit. Diese Forschung konzentriert sich auf die Entwicklung einer schnelle Methode zum Nachweis V. Parahaemolyticus mit hoher Selektivität und Empfindlichkeit, die mit den Prinzipien der DNA-Hybridisierung. In der Arbeit gelang mittels Röntgendiffraktometrie (XRD), Ultraviolett-sichtbare Spektroskopie (UV-Vis), Transmission Electron Microscopy (TEM), Feldemission Charakterisierung von synthetisierten Polymilchsäure Säure stabilisiert gold-Nanopartikeln (PLA-AuNPs) Rasterelektronenmikroskopie (FESEM) und zyklischer Voltammetrie (CV). Wir führten auch weitere Tests an Stabilität, Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit von PLA-AuNPs. Wir fanden, dass die PLA-AuNPs eine Klangstruktur von stabilisierten Nanopartikeln in wässriger Lösung gebildet. Wir beobachten auch, dass die Empfindlichkeit durch die kleinere Ladung übertragungswert Widerstand (R-ct) und eine Zunahme der aktiven Fläche (0,41 cm2) verbessert. Die Entwicklung unserer DNA-Biosensor beruhte auf Änderung der Siebdruck kohlenstoffelektrode (tauglich) mit PLA-AuNPs und mit Methylenblau (MB) als Redox-Indikator. Wir bewertet die Immobilisierung und Hybridisierung Ereignisse durch differenzielle Puls Voltammetrie (DPV). Wir fanden, dass ergänzende, nicht-ergänzende und nicht übereinstimmende Oligonukleotide wurden speziell zeichnet sich durch die vorgefertigten Biosensor. Es zeigte auch zuverlässig empfindliche Detektion in Kreuzreaktivität Studien von verschiedenen lebensmittelbedingten Krankheitserregern und bei der Identifizierung von V. Parahaemolyticus in frische Herzmuscheln.

Bildung von AuNPs zeigte sich durch die Veränderung der Farbe der wässrigen Lösung mit Natriumcitrat vorhanden. Dies verursacht die Farbe von hellgelb zu tief Rubinrot wechseln. Die Generation von PLA-AuNPs wurde aus den UV-Vis-Spektren (Abbildung 1), wo das Wachstum des Surface Plasmon Resonance (SPR) Peaks bei ca. 540 gefunden wurde, bestätigt nm. Die Entstehung und Existenz von PLA-AuNPs wurde auf 500-600 nm Wellenlänge reicht, je nach Partikel Größ...

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Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

Entwicklung der eine elektrochemische DNA-Biosensor, einem Foodborne Krankheitserreger zu erkennen

Ein Protokoll für die Entwicklung der eine elektrochemische DNA-Biosensor bestehend aus eine Polymilchsäure Säure stabilisiert, gold-Nanopartikeln modifiziert, Siebdruck kohlenstoffelektrode Vibrio Parahaemolyticus erkennen wird vorgestellt.

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

Herstellung von elektrochemischen DNA Biosensoren für die Reagenzienfreier Nachweis von Nukleinsäuren, Proteinen und kleinen Molekülen

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Forschung

Biotechnik

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

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Entwurf eines zyklischen Druck Bioreaktor für die Ex Vivo Studium der Aorten-Herzklappen

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Hollow Microneedle-based Sensor for Multiplexed Transdermal Electrochemical Sensing

Hohle Mikronadel-basierten Sensor für Multiplex Transdermale elektrochemische Nachweis

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals ...

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

Bakterielle Erkennung und Identifizierung mit elektrochemischen Sensoren

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

High-throughput, Automated Extraction of DNA and RNA from Clinical Samples using TruTip Technology on Common Liquid Handling Robots

Hochdurchsatz-, Automated Extraktion von DNA und RNA aus klinischen Proben mit TruTip Technologie Gemeinsames Liquid Handling Robots

TruTip is a simple nucleic acid extraction  technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a  pipette tip. The geometry of the ...

Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria

Biosensor zum Nachweis von Antibiotika-resistenten Staphylococcus Bakterien

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Sensing of Barrier Tissue Disruption with an Organic Electrochemical Transistor

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Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

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Entwicklung eines<em&gt; In Vitro</em&gt; Ocular Platform Kontaktlinsen zu Test

Currently, in vitro evaluations of contact lenses (CLs) for drug delivery are typically performed in large volume vials,1-6 which fail to mimic ...

The Use of a &#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

The Use of a ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

Die Verwendung eines β-Lactamase-basierte Conductimetric Biosensor-Assays, biomolekulare Wechselwirkungen zu erkennen

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