Name: development of an electrochemical dna biosensor to detect a foodborne pathogen
Uploaded: 2018-06-03T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen at JoVE.com

המחברים רוצה להכיר את התמיכה של מלזיה Universiti Putra.

הערה: כל ריאגנטים כימי וביוכימי כדי לשמש צריך להיות של כיתה אנליטית, ללא טיהור נוסף. להכין את כל הפתרונות באמצעות מים יונים סטרילי. אוטוקלב כל כלי זכוכית לפני העיקור.
התראה: אנא השתמש כל נוהלי בטיחות המתאים בעת ביצוע פעילויות מעבדה, כולל את השימוש הנדסה פקדים (fume הוד, הכפפות), ?...

השלבים הקריטיים במסגרת להתפתחותן של סוג זה של ביוסנסור אלקטרוכימי הם מבחר אלמנטים המתאימים זיהוי ביולוגי המתמר (חומצת גרעין או DNA כאן); הגישה כימיים עבור בניית השכבה חישה של המתמר; התמרה חושית חומר; אופטימיזציה של ה-DNA הנייח, הכלאה; ואימות החיישן מפותחת באמצעות דוגמאות אמיתיות.
<p class="jove_cont...

נושא מרכזי של הדיון הציבורי ומדעיים בשנים האחרונות, הרעלת מזון היא מזוהה בעיקר עם שלושה סוכנים: מיקרואורגניזמים1, כימיקלים2וטפילים3. מזון מזוהם עלול לגרום לתוצאות בריאות רציניות בבני אדם, במיוחד אצל קבוצת סיכון גבוה יותר של אלה עם מערכות החיסון חלשה, נשים בהריון, קשישים, תינוקות, ילדים צעירים4. עם יותר ממיליון מקרים של שלשול אקוטי המתרחשים מדי שנה אצל ילדים מתחת לגיל 5 שנים ב אפריקה, אסיה, אמריקה הלטינית, הרעלת מזון היא מחלה הגלובלית הגדולות5,6 , הקימה ארגון הבריאות העולמי מיקרואורגניזמים כמו התורם החשוב ביותר7. ויבריו parahaemolyticus בולטת בין זנים מידבק ביותר המוכר. בדרך כלל שנמצאו לאורך החוף, estuarine, ימית סביבות8, הוא חיידק גראם שליליים, אשר הופכת לפעילה בסביבות מלח גבוהה, והוא גורם להרעלתו אנושי רציני כאשר אוכלים מבושל כראוי, כושלת או raw ימית מוצרים9. בנוסף, קיימים מצבים רפואיים אצל אנשים מסוימים להפוך אותם נוטה פצע הזיהום זיהום, ספטיסמיה או האוזן הנובעים נ' parahaemolyticus10. הגורמים התקפה אלימה של נ' parahaemolyticus hemolysins נחלקים לשני סוגים אשר לתרום בפתוגנזה המחלה: thermostable המוליזין ישירה (TDH) מקודד על ידי הגנים tdh ולאחר הקשורות TDH המוליזין מקודד על ידי גנים trh11. הקריטריונים התקפה אלימה (גנים tdh ו- trh) של parahaemolyticus (פ') נמצאים בעיקר דגימות קליניות, במקום דגימות סביבתיים.
(פ') parahaemolyticus יש את היכולת לשרוד תחת מגוון רחב של תנאים, להגיב במהירות על שינויים סביבתיים12. מנגנון התפשטות שלה מסלים את פוטנציאל הסיכון שלו ככל שלה רעילות במקביל תא המוני13. חמור מכך, שינוי האקלים מספקת חיידקים אלה בתנאים בשפע כדי להאיץ את הצמיחה שלהם האוכלוסייה תא14. בשל תדירותו גבוהה, נ' parahaemolyticus צריך להיות במעקב לאורך שרשרת אספקת המזון, במיוחד בתחום הסחר והייצור של פירות ים מאז מוצרים אלה הם שבו הם נמצאים בכמויות עצומות15,16 ברחבי העולם. כיום החיידקים מזוהות ואת וזמינותו מבודדים באמצעות מגוון של שיטות כולל בדיקות ביוכימיות, העשרה, מדיה סלקטיבי17, מקושרים-אנזים immunomagnetic sorbent (אליסה)18, הדופק-שדה בג'ל (PFGE) 19התלכדות לייטקס בדיקות, בדיקות פולימראז תגובת שרשרת (PCR)20. שיטות אלו דורשות בדרך כלל מוסמכים, מכשירים מתוחכמים וטכניקות מפרך אשר אינם מספקים מידע אודות זיהום באופן מיידי. זה קשות מגביל את הסבירות מיד גילוי זיהום מזיקים ויישומים באתר. כלי איתור מהיר עדיין מהווה אתגר יוצא מן הכלל.
Biosensing מתגלה כאופציה מבטיחה איתור והקאה פתוגנים משום שהיא מציעה לחיסכון בזמן, חסכונית, מעשית, בזמן אמת וניתוח בשיטת21,22,23,24 . עם זאת, אמנם היו תוצאות חיוביות רבות של analyte בזיהוי כל פתרון באמצעות ביולוגיים ודוגמאות מחודדים, יש עדיין חוסר מחקר חלה על דוגמאות אמיתיות או תערובות מימית או תמציות אורגניות25. לאחרונה, ביולוגיים אלקטרוכימי באמצעות זיהוי ישיר ו/או עקיף חומצה deoxyribonucleic (DNA) קיבלו תשומת לב מוגברת בקרב מדענים, עקב שלהם זיהוי ספציפי של המטרה משלימים באמצעות אירוע הכלאה26 , 27 , 28 , 29. גישות ייחודיות אלה יציבים יותר בהשוואה ביולוגיים מבוססי אנזים, ובכך מציע טכנולוגיה מבטיח המזעור, מסחור. המטרה של המחקר דיווח הנה כדי לבנות כלי מהיר יכול לזהות נ' parahaemolyticus עם סלקטיביות גבוהה, רגישות, מעשיות, המבוססת על רצף ה-DNA יחודיות במהלך הכלאה. זיהוי אסטרטגיות כוללות השילוב של חומצה מיוצב חלקיקי זהב (PLA-AuNPs) polylactic30 ואלקטרודות פחמן המסך המודפס (SPCEs) בנוכחות מחוון הכלאה, מתילן כחול (MB). הפוטנציאל של הבונה הזיהוי מפותחת הוא חקר נוסף באמצעות חיידקים דגימות די אן איי פשוט נתעלף lysate ורענן.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaminoethane tetraacetic acid</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibasic sodium phosphate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium hydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>255793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>16368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold (III) chloride trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>520918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M44907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monobasic sodium phosphate, monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(lactic acid) resin, commercial grade 4042D</td>
			<td>NatureWorks</td>
			<td>4042D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>R&#38;M Chemicals</td>
			<td>59435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hexacyanoferrate III</td>
			<td>R&#38;M Chemicals</td>
			<td>208019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate anhydrous salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl) aminomethane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>T395-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X PCR Master Mix with Dual-Dye</td>
			<td>Norgen Biotek</td>
			<td>28240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose gel</td>
			<td>Merck</td>
			<td>101236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolton Agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolton Broth</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHROMagar Vibrio</td>
			<td>CHROMagar</td>
			<td>VB910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>Promega</td>
			<td>U1511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin methylene blue agar&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>101347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelRed</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>41001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Go Taq Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading dye 100 bp DNA ladder</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G2101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading dye 1kb DNA ladder</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G5711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Promega</td>
			<td>91176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol egg yolk polymyxin agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McConkey Agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutrient Broth</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq polymerase</td>
			<td>Merck</td>
			<td>71003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticase Soy Broth</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticase Soy Agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105458</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of an electrochemical dna biosensor to detect a foodborne pathogen

ויבריו parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) הוא. חיידק נפוץ והקאה אשר תורם חלק ניכר של בעיות בריאות הציבור ברחבי העולם, באופן משמעותי משפיע על הקצב של האדם תמותה ותחלואה קרדיווסקולרית. שיטות קונבנציונליות איתור נ' parahaemolyticus כגון שיטות מבוססות-תרבות, מבחני אימונולוגי מולקולרי המבוסס על שיטות דורשים טיפול מסובך לדוגמה, זמן רב, מייגע, ויקרות. לאחרונה, ביולוגיים הוכיחו להיות שיטה לזיהוי מבטיח ומקיף עם היתרונות של זיהוי מהיר, משתלמת, ו המעשיות. מחקר זה מתמקד בפיתוח שיטה מהירה של גילוי נ' parahaemolyticus סלקטיביות גבוהה ורגישות שימוש בעקרונות ה-DNA הכלאה. עבודה, אפיון polylactic מסונתז מיוצב חומצה חלקיקי זהב (PLA-AuNPs) הושג באמצעות קרני רנטגן (XRD), ספקטרוסקופיה הגלוי אולטרה סגול (UV-Vis), הילוכים מיקרוסקופ אלקטרונים (TEM), פליטת שדה מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה (FESEM), וולטמטריה ציקלית (CV). אנחנו גם ביצעו בדיקה נוספת של יציבות, רגישות הפארמצבטית של ה-PLA-AuNPs. . מצאנו ה-PLA AuNPs נוצר מבנה הקול של חלקיקים מיוצב בתמיסה המימית. גם הבחנו כי שיפרה הרגישות כתוצאה ערך התנגדות (Rct) קטן יותר תשלום העברה, גידול של פעיל שטח (2ס מ 0.41). פיתוח ביוסנסור הדנ א שלנו מבוססת על שינוי של אלקטרודות פחמן המסך המודפס (SPCE) עם ה-PLA-AuNPs ושימוש מתילן כחול (MB) כאינדיקטור חמצון-חיזור. אנחנו לאומדן האירועים הנייח והכלאה הדופק דיפרנציאלי voltammetry (DPV). מצאנו כי משלימים, שאינם משלימים, oligonucleotides לא תואמת במיוחד היו מכובדים על ידי החיישן מפוברק. זה הראה גם זיהוי רגיש בצורה אמינה במחקרים אשיג נגד פתוגנים שונים שמקורם במזון, הזיהוי של נ' parahaemolyticus בתוך הלב טריים.

היווצרות AuNPs התגלה באמצעות בשינוי הצבע של התמיסה המימית עם סודיום ציטרט הנוכחי. זה גרם את הצבע לשנות מן צהוב בהיר אדום רובי עמוק. הדור של ה-PLA-AuNPs אושרה של ספקטרום UV-vis (איור 1) שבו הצמיחה של הפסגה תהודה (SPR) משטח פלזמון נמצאה כ 540 nm. היווצרות ואת קיומו של ה-PLA-AuNPs ה...

Watch this Scientific Journal Video about Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen at JoVE.com

Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

התפתחות ביוסנסור אלקטרוכימי דנ א כדי לזהות חיידק והקאה

פרוטוקול לפיתוח ביוסנסור אלקטרוכימי DNA הכוללת של אלקטרודות פחמן חלקיקי-לאחרונה, המסך המודפס מיוצב חומצה, זהב polylactic לזהות ויבריו parahaemolyticus מוצג.

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

המצאה של אלקטרוכימי-DNA Biosensors לגילוי Reagentless של חומצות, חלבונים ומולקולות קטנות גרעין

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

עיצוב של bioreactor לחץ על מחזורי Ex Vivo מחקר של מסתמי הלב אבי העורקים

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Hollow Microneedle-based Sensor for Multiplexed Transdermal Electrochemical Sensing

חיישן הולו Microneedle מבוסס על מרובב דרך העור אלקטרוכימי חישה

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals ...

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

גילוי חיידקים וזיהוי באמצעות חיישנים אלקטרוכימיים

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

High-throughput, Automated Extraction of DNA and RNA from Clinical Samples using TruTip Technology on Common Liquid Handling Robots

הפקת תפוקה גבוהה, אוטומטית של DNA ו-RNA מדגימות קליניות באמצעות הטכנולוגיה TruTip על רובוטים טיפול נוזל נפוצים

TruTip is a simple nucleic acid extraction  technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a  pipette tip. The geometry of the ...

Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria

Biosensor לאיתור של חיידקי סטפילוקוקוס עמידים לאנטיביוטיקה

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) ...

Sensing of Barrier Tissue Disruption with an Organic Electrochemical Transistor

חישה של שיבוש טישו גדר עם טרנזיסטור אלקטרוכימי אורגני

The gastrointestinal tract is an example of barrier tissue that provides a physical barrier against entry of pathogens and toxins, while allowing the ...

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

Biochip אלקטרוכימי מבוסס Microfluidic לניתוח הכלאה DNA ללא תווית

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

פיתוח של<em&gt; במבחנה</em&gt; פלטפורמת Ocular כדי לבדוק עדשות מגע

Currently, in vitro evaluations of contact lenses (CLs) for drug delivery are typically performed in large volume vials,1-6 which fail to mimic ...

The Use of a &#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

The Use of a ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

השימוש β-lactamase מבוססי ביוסנסור Conductimetric Assay לזהות אינטראקציות למערכות ביולוגיות

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental ...