Name: development of an electrochemical dna biosensor to detect a foodborne pathogen
Uploaded: 2018-06-03T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen at JoVE.com

Forfatterne ønsker å erkjenne støtte fra Universiti Putra Malaysia.

Merk: Alle kjemiske og biokjemiske reagensene brukes bør være analytisk klasse og uten videre rensing. Forberede alle løsninger ved hjelp av sterilt deionisert vann. Autoclave alle glass før sterilisering.
Forsiktig: Bruk alle nødvendige sikkerhets praksis når laboratorie aktiviteter inkludert bruk av engineering kontroller (avtrekksvifte, glovebox) og personlig verneutstyr (vernebriller, hansker, laboratoriefrakk, full lengde bukser, lukket tå sko).
1. fabrika...

Kritisk trinnene i et rammeverk for vellykkede utviklingen av denne typen elektrokjemisk biosensor er valg av riktige biologiske anerkjennelse elementer for svingeren (nukleinsyre eller DNA her); kjemisk tilnærming for å konstruere sensing laget svingeren; signaltransduksjon materiale; optimalisering av DNA immobilisering og hybridisering; og validering av den utviklede biosensor bruker virkelige eksempler.
Kjernen for en vellykket utbygging av en følsom og selektiv elektrokjemiske DNA bios...

Et sentralt tema offentlige og vitenskapelig debatt de siste årene, matforgiftning er hovedsakelig forbundet med 3 agenter: mikroorganismer1, kjemikalier2og parasitter3. Forurenset mat kan føre til alvorlige helseproblemer hos mennesker, spesielt i risikogruppen for høyere i de med svak uimottakelig systemer, eldre, gravide kvinner, spedbarn og små barn4. Med mer enn en million tilfeller av akutt diaré forekommer årlig i barn under 5 år i Afrika, Asia og Latin-Amerika, matforgiftning er en stor global sykdom5,6 og Verdens helseorganisasjon har etablert mikroorganismer som det viktigste bidragsyter7. Vibrio parahaemolyticus skiller seg ut blant de mest anerkjente virulente stammene. Vanligvis finner i kyst, marinsystemer og hav8, er det en Gram-negative bakterie, som blir aktivt i høy salt miljøer, og forårsaker alvorlige menneskelige gastroenteritt når spist i mangelfullt kokte, feilsendt eller rå marine produkter9. I tillegg gjør eksisterende medisinske tilstander i noen mennesker dem utsatt for sår infeksjon, septicemia eller øre infeksjon oppstår fra V. parahaemolyticus10. Virulens faktorene av V. parahaemolyticus hemolysins er delt inn i to typer som bidrar til sykdom patogenesen: thermostable direkte hemolysin (TDH) kodet av tdh gener og TDH-relaterte hemolysin kodet av trh gener11. Virulens markører (tdh og trh gener) av V. parahaemolyticus finnes hovedsakelig i klinisk prøver ikke i miljømessige prøver.
V. parahaemolyticus har muligheten til å overleve under en rekke forhold, reagerer raskt miljøendringer12. Dens spredning mekanikk eskalerer dens farepotensial som sin toksisitet øker parallelt med cellen masse13. Enda verre, klimaendringer gir disse bakteriene med rikelig forhold å akselerere deres celle befolkningen vekst14. På grunn av dens høy frekvens må V. parahaemolyticus overvåkes langs verdikjeden mat, særlig i handel og produksjon av sjømat siden disse produktene er hvor de finnes i enorme mengder15,16 over hele verden. Foreløpig bakterier er identifisert og isolert bruker en rekke metoder inkludert biokjemiske tester, berikelse og selektiv media17, enzym knyttet immunomagnetic absorberende analysen (ELISA)18, puls-feltet gel geleelektroforese (PFGE) 19, latex agglutinerende tester og polymerase kjedereaksjon (PCR)-tester20. Disse metodene krever vanligvis kvalifisert personell, komplekse instrumenter og arbeidskrevende teknikker som ikke gir informasjon om forurensning umiddelbart. Dette begrenser alvorlig sannsynligheten for raskt oppdage skadelig forurensning og stedets programmer. Rask søkeverktøy forblir en enestående utfordring.
Biosensing fremstår som en lovende alternativ for påvisning av matbårne patogener fordi det tilbyr en tidsbesparende, kostnadseffektive, praktiske og sanntids analyse metoden21,22,23,24 . Men selv om det har vært mange positive resultater av analytt piggete prøver og standard løsning ved hjelp av biosensors, er det fortsatt en mangel på forskning på virkelige eksempler i vandig blandinger eller organisk ekstrakter25. Nylig har elektrokjemisk biosensors bruker direkte og/eller indirekte deoksyribonukleinsyre (DNA) oppdagelsen fått økt oppmerksomhet blant forskere, på grunn av deres spesifikke oppdaget komplementære målet via en hybridisering hendelsen26 , 27 , 28 , 29. disse unike tilnærminger er mer stabile forhold enzym-baserte biosensors, dermed tilby en lovende teknologi for miniatyrisering og kommersialisering. Målet for studien rapporterte her er å bygge en rask verktøy som kan oppdage V. parahaemolyticus med høy selektivitet, følsomhet og praktiske, basert på DNA sekvensen spesifisitet under hybridisering. Identifikasjon strategier innebærer kombinasjonen av polylactic syre-stabilisert gull nanopartikler (PLA-AuNPs)30 og trykt karbon elektroder (SPCEs) i nærvær av hybridisering indikatoren, methylene Blåfarge (MB). Potensialet i den utviklede oppdagelse konstruere er utforsket bakterier DNA lysate og frisk hjerteskjell utvalg.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaminoethane tetraacetic acid</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibasic sodium phosphate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium hydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>255793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>16368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold (III) chloride trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>520918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M44907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monobasic sodium phosphate, monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(lactic acid) resin, commercial grade 4042D</td>
			<td>NatureWorks</td>
			<td>4042D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>R&#38;M Chemicals</td>
			<td>59435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hexacyanoferrate III</td>
			<td>R&#38;M Chemicals</td>
			<td>208019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate anhydrous salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl) aminomethane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>T395-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X PCR Master Mix with Dual-Dye</td>
			<td>Norgen Biotek</td>
			<td>28240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose gel</td>
			<td>Merck</td>
			<td>101236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolton Agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolton Broth</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHROMagar Vibrio</td>
			<td>CHROMagar</td>
			<td>VB910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>Promega</td>
			<td>U1511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin methylene blue agar&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>101347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelRed</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>41001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Go Taq Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading dye 100 bp DNA ladder</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G2101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading dye 1kb DNA ladder</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G5711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Promega</td>
			<td>91176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol egg yolk polymyxin agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McConkey Agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutrient Broth</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq polymerase</td>
			<td>Merck</td>
			<td>71003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticase Soy Broth</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticase Soy Agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105458</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of an electrochemical dna biosensor to detect a foodborne pathogen

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) er en felles infeksjon patogen som bidrar til en stor andel av folkehelseproblemer globalt, betydelig påvirker frekvensen av menneskelige dødelighet og sykelighet. Konvensjonelle metoder for påvisning av V. parahaemolyticus som kultur-baserte metoder, immunologiske analyser og molekylær-baserte metoder krever komplisert eksempel håndtering og er tidkrevende, kjedelig og dyrt. Nylig har biosensors vist seg for å være en lovende og omfattende gjenkjennings-metoden med fordelene ved rask oppdagelsen, kostnadseffektivitet og praktiske. Denne forskningen fokuserer på å utvikle en rask metode for å oppdage V. parahaemolyticus med høy selektivitet og følsomhet bruker prinsippene om DNA hybridisering. I arbeidet, ble karakterisering av syntetisk polylactic syre-stabilisert gull nanopartikler (PLA-AuNPs) oppnådd med X-ray Diffraksjon (XRD), UV-synlig spektroskopi (UV-Vis), overføring elektronmikroskop (TEM), felt-utslipp Skanning elektronmikroskop (FESEM), og syklisk Voltammetry (CV). Vi har også gjennomført ytterligere testing stabilitet, følsomhet og reproduserbarhet for PLA-AuNPs. Vi fant at PLA-AuNPs dannet en lyd struktur av stabilisert nanopartikler i vandig løsning. Vi har også observert at følsomheten forbedret mindre kostnad overføring motstand (Rct) verdien og en økning av aktive areal (0.41 cm2). Utviklingen av vårt DNA biosensor var basert på endring av en trykt karbon elektrode (SPCE) med PLA-AuNPs og bruke methylene Blåfarge (MB) som redoks indikator. Vi vurdert hendelsene immobilisering og blanding av differensial puls voltammetry (DPV). Vi fant ut at komplementære, ikke-utfyllende, og oligonucleotides var spesielt preget av den ferdige biosensor. Det viste også pålitelig følsom oppdagelsen kryssreaktivitet studier mot ulike mat-borne patogener og identifikasjon av V. parahaemolyticus i ferske.

Dannelse av AuNPs ble avslørt gjennom endring i fargen i vandig løsningen med natriumsitrat stede. Dette forårsaket fargen endre fra lys gul til en dypt ruby rød. Generering av PLA-AuNPs ble bekreftet fra UV-vis spectra (figur 1) der veksten av overflaten plasmon resonans (SPR) toppen ble funnet på rundt 540 nm. Dannelse og eksistensen av PLA-AuNPs ble angitt på 500-600 nm wavelength områder, avhengig av partikkel størrelse37. ...

Watch this Scientific Journal Video about Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen at JoVE.com

Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

Utvikling av en elektrokjemisk DNA Biosensor å oppdage en infeksjon patogen

En protokoll for utviklingen av en elektrokjemisk DNA biosensor bestående av en polylactic syre-stabilisert, gull nanopartikler endret, trykt karbon elektrode for å oppdage Vibrio parahaemolyticus presenteres.

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Hollow Microneedle-based Sensor for Multiplexed Transdermal Electrochemical Sensing

Hollow microneedle-baserte Sensor for Multiplexed Transdermal Electrochemical Sensing

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals ...

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

Bakteriell Detection &amp; Identification hjelp elektrokjemiske sensorer

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

High-throughput, Automated Extraction of DNA and RNA from Clinical Samples using TruTip Technology on Common Liquid Handling Robots

Høy gjennomstrømning, Automated Utvinning av DNA og RNA fra kliniske prøver ved hjelp TruTip Technology på Common Væskehåndtering Robots

TruTip is a simple nucleic acid extraction  technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a  pipette tip. The geometry of the ...

Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria

Biosensor for påvisning av antibiotikaresistens resistente Staphylococcus bakterier

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) ...

Sensing of Barrier Tissue Disruption with an Organic Electrochemical Transistor

Sensing of Barrier vevsdesintegrasjon med en organisk Elektrokjemisk Transistor

The gastrointestinal tract is an example of barrier tissue that provides a physical barrier against entry of pathogens and toxins, while allowing the ...

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

En microfluidic basert Elektrokjemisk biochip for Label-free DNA Hybridisering Analyse

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...