Name: development of an electrochemical dna biosensor to detect a foodborne pathogen
Uploaded: 2018-06-03T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen at JoVE.com

Os autores gostaria de agradecer o apoio da Universiti Putra Malaysia.

Nota: Todos os reagentes químicos e bioquímicos para ser usado devem ser de qualidade analítica e usado sem mais purificação. Prepare todas as soluções usando água deionizada estéril. Autoclave todos os produtos vidreiros antes da esterilização.
Atenção: Por favor, use todas as práticas de segurança adequadas ao realizar atividades de laboratório, incluindo o uso de controles (coifa, porta-luvas) de engenharia e equipamentos de proteção individual (óculos de segurança, luva...

Os passos críticos em um quadro para o desenvolvimento bem sucedido deste tipo de biosensor eletroquímico são a seleção de elementos de reconhecimento biológico adequado para o transdutor (ácido nucleico ou DNA aqui); abordagem de química para a construção de camada de sensoriamento do transdutor; material de transdução; otimização de imobilização de DNA e hibridação; e validação do biosensor desenvolvido usando amostras reais.
Núcleo para o desenvolvimento bem sucedido de...

Um importante tópico de debate público e científico nos últimos anos, a intoxicação alimentar é principalmente associada com 3 agentes: microorganismos1, produtos químicos2e parasitas3. Alimentos contaminados podem causar consequências graves para a saúde nos seres humanos, especialmente no grupo de risco mais elevado das pessoas com fraco sistema imunológico, a mulheres grávidas, idosas, bebês e crianças pequenas4. Com mais de 1 milhão de casos de diarreia aguda, ocorrendo anualmente em crianças menores de 5 anos de idade na África, Ásia e América Latina, a intoxicação alimentar é das principais doenças global5,6 e estabeleceu-se a Organização Mundial da saúde microorganismos como o mais importante contribuinte7. Vibrio parahaemolyticus destaca-se entre as cepas virulentas mais amplamente reconhecidas. Geralmente encontrado em ambientes costeiros, estuarinos e marinhos8, é uma bactéria Gram-negativa, que se torna ativo em ambientes de sal elevados e provoca grave gastroenterite humana quando comidos em marine inadequadamente cozida, maltratado ou cru produtos9. Além disso, condições médicas existentes em algumas pessoas tornem propenso a ferida infecção, septicemia ou orelha infecção decorrentes de V. parahaemolyticus10. Os fatores de virulência de V. parahaemolyticus hemolisinas são divididos em dois tipos, que contribuem para a patogênese da doença: thermostable hemolisina directa (TDH) codificadas por genes tdh e hemolisina TDH-relacionados, codificadas por genes de trh11. Os marcadores de virulência (genes tdh e trh) de V. parahaemolyticus são normalmente encontrados em amostras clínicas em vez de amostras ambientais.
V. parahaemolyticus possui a habilidade de sobreviver em uma ampla gama de condições, responder rapidamente às mudanças ambientais12. Seu mecanismo de proliferação se agrava seu potencial de risco à medida que sua toxicidade aumenta em paralelo com a célula em massa13. Pior ainda, mudança climática está fornecendo estas bactérias com amplas condições para acelerar sua de crescimento de população celular14. Devido à sua alta frequência, V. parahaemolyticus necessita de ser acompanhada ao longo da cadeia de abastecimento alimentar, particularmente no comércio e na produção de frutos do mar, desde que esses produtos sejam onde eles são encontrados em quantidades enormes de15,16 em todo o mundo. Atualmente, as bactérias são identificadas e isolados, usando uma variedade de métodos, incluindo testes bioquímicos, enriquecimento e meios selectivos17, enzima-lig Fima adsorvente do ensaio (ELISA)18, eletroforese em gel de pulso-campo (PFGE) 19, testes de aglutinação de látex e de testes de reação em cadeia (PCR) polimerase20. Esses métodos normalmente requerem pessoal qualificado, instrumentos sofisticados e técnicas laboriosas que não fornecem informações sobre contaminação imediatamente. Isto limita severamente a probabilidade de detectar prontamente contaminação prejudicial e aplicações no local. Ferramentas de detecção rápida permanecem um desafio excepcional.
Biosensing está emergindo como uma opção promissora para a detecção de agentes patogénicos de origem alimentar, porque oferece uma economia de tempo, econômico, prático e em tempo real de análise método21,22,23,24 . No entanto, embora tenha havido muitos resultados positivos de detecção de analito em amostras cravadas e solução padrão usando biosensores, ainda há uma falta de pesquisa aplicada a amostras reais em misturas aquosas ou extractos orgânicos25. Recentemente, biosensores eletroquímicos detecção direta ou indireta de Ácido desoxirribonucleico (DNA) têm recebido atenção crescente entre os cientistas, devido a sua detecção específica do alvo complementar através de uma hibridização evento26 , 27 , 28 , 29. essas abordagens únicas são mais estáveis em comparação com biossensores enzimáticos, oferecendo assim uma tecnologia promissora para a miniaturização e comercialização. O alvo do estudo relatado aqui é construir uma ferramenta rápida que pode detectar V. parahaemolyticus com alta seletividade, sensibilidade e praticidade, baseada-se a especificidade de sequência de DNA durante a hibridação. Estratégias de identificação envolvem a combinação de polilático nanopartículas de ouro ácido-estabilizado (PLA-AuNPs)30 e os elétrodos do carbono serigrafado (SPCEs) na presença do indicador de hibridação, azul de metileno (MB). O potencial de construção de deteção desenvolvidos é mais explorado usando amostras de berbigão fresco e lisado de DNA de bactérias.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaminoethane tetraacetic acid</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibasic sodium phosphate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium hydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>255793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>16368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold (III) chloride trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>520918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M44907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monobasic sodium phosphate, monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(lactic acid) resin, commercial grade 4042D</td>
			<td>NatureWorks</td>
			<td>4042D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>R&#38;M Chemicals</td>
			<td>59435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hexacyanoferrate III</td>
			<td>R&#38;M Chemicals</td>
			<td>208019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate anhydrous salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl) aminomethane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>T395-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X PCR Master Mix with Dual-Dye</td>
			<td>Norgen Biotek</td>
			<td>28240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose gel</td>
			<td>Merck</td>
			<td>101236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolton Agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolton Broth</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHROMagar Vibrio</td>
			<td>CHROMagar</td>
			<td>VB910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>Promega</td>
			<td>U1511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin methylene blue agar&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>101347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelRed</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>41001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Go Taq Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading dye 100 bp DNA ladder</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G2101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading dye 1kb DNA ladder</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G5711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Promega</td>
			<td>91176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol egg yolk polymyxin agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McConkey Agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutrient Broth</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq polymerase</td>
			<td>Merck</td>
			<td>71003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticase Soy Broth</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticase Soy Agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105458</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of an electrochemical dna biosensor to detect a foodborne pathogen

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) é um patógeno comum de intoxicação alimentar que contribui para uma grande parte dos problemas de saúde pública no mundo, afetando significativamente a taxa de morbidade e mortalidade humana. Métodos convencionais para a detecção de V. parahaemolyticus como métodos baseados em cultura, testes imunológicos e moleculares com base em métodos requerem manipulação de amostra complicado e são caro, demorado e tedioso. Recentemente, biosensores tem provado para ser um método de deteção promissora e abrangente com as vantagens da detecção rápida, custo-efetividade e praticidade. Esta pesquisa se concentra no desenvolvimento de um método rápido de detectar V. parahaemolyticus com alta seletividade e sensibilidade usando os princípios de hibridização de DNA. No trabalho, caracterização de nanopartículas ouro sintetizado polilático ácido-estabilizado (PLA-AuNPs) foi conseguida usando a difração de raios x (XRD), espectroscopia de ultravioleta-visível (UV-Vis), microscopia eletrônica de transmissão (TEM), de emissão de campo Microscopia eletrônica (FESEM) e voltametria cíclica (CV). Também realizamos ensaios de estabilidade, sensibilidade e reprodutibilidade do PLA-AuNPs. Nós achamos que o PLA-AuNPs formou uma estrutura sólida de nanopartículas estabilizadas em solução aquosa. Observou-se também que a sensibilidade melhorada como resultado o valor de resistência (Rct) de transferência de carga menor e um aumento da área de superfície ativa (0,41 cm2). O desenvolvimento da nossa biosensor DNA baseou-se na modificação de um eletrodo de carbono serigrafado (SPCE) com PLA-AuNPs e usando azul de metileno (MB) como indicador redox. Foram avaliados os eventos de imobilização e hibridação por voltametria de pulso diferencial (DPV). Descobrimos que complementar, não-complementares, e oligonucleotides incompatíveis especificamente foram distinguidos pelo biosensor fabricado. Também mostrou que confiantemente sensível deteção em estudos de reatividade cruzada contra vários patógenos de origem alimentar e na identificação de V. parahaemolyticus em berbigões frescos.

Formação de AuNPs foi revelada através da mudança na cor da solução aquosa com citrato de sódio presente. Isto causou a cor mudar de amarelo claro para um vermelho rubi profundo. A geração de PLA-AuNPs foi confirmada de espectros de UV-vis (Figura 1), onde o crescimento do pico de ressonância (SPR) do plasmon de superfície foi encontrado a cerca de 540 nm. A formação e a existência de PLA-AuNPs foi indicado em intervalos de comprimento de onda 5...

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Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

Desenvolvimento de um Biosensor eletroquímico do DNA para detectar um patógeno de origem alimentar

Um protocolo para o desenvolvimento de um biosensor eletroquímico de DNA composta por um eletrodo de carbono ácido-estável, ouro de nanopartículas-modificado, serigrafado polilático para detectar o Vibrio parahaemolyticus é apresentado.

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, ...

Research

JoVE Journal

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Fabricação de Eletroquímica-DNA Biossensores para Detecção Reagentless de ácidos nucléicos, proteínas e pequenas moléculas

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receive the results. ...

Bioengenharia

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