Name: development of an electrochemical dna biosensor to detect a foodborne pathogen
Uploaded: 2018-06-03T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen at JoVE.com

Los autores desean reconocer el apoyo de Universiti Putra Malasia.

Nota: Todos los reactivos químicos y bioquímicos para ser utilizado deben ser de grado analítico y utilizan sin purificación adicional. Preparar todas las soluciones utilizando agua desionizada estéril. Autoclave de toda la cristalería antes de la esterilización.
PRECAUCIÓN: Utilice todas las prácticas de seguridad apropiadas cuando se realizan actividades de laboratorio, incluyendo el uso de controles (campana, guantera) de ingeniería y equipo de protección personal (gafas, guantes...

Los pasos críticos en un marco para el desarrollo exitoso de este tipo de biosensor electroquímico son selección de elementos de reconocimiento biológico apropiado para el transductor (ácido nucleico o ADN aquí); enfoque de química para la construcción de la capa de detección del transductor; material de transducción de señales; optimización de inmovilización del DNA e hibridación; y validación del biosensor desarrollado con muestras reales.
Base para el desarrollo de un biosens...

Un tema importante de debate público y científico en los últimos años, la intoxicación alimentaria se asocia fundamentalmente con 3 agentes: microorganismos1y química2parásitos3. Alimentos contaminados pueden causar consecuencias graves para la salud en seres humanos, especialmente en el grupo de mayor riesgo aquellos con sistemas inmunes débiles, los ancianos, mujeres embarazadas, bebés y niños pequeños4. Con más de 1 millón de casos de diarrea aguda que ocurre anualmente en niños menores de 5 años en África, Asia y América Latina, la intoxicación alimentaria es una importante enfermedad global5,6 y la Organización Mundial de la salud ha establecido microorganismos como el más importante colaborador7. Vibrio parahaemolyticus se destaca entre las más reconocidas cepas virulentas. Generalmente se encuentran en ambientes marinos, estuarinos y costeros8, es una bacteria gram negativa, que se activa en entornos de alta sal y causa grave gastroenteritis humana cuando está comido en marinos insuficientemente cocidos, maltratados o crudo productos9. Además, las condiciones médicas existentes en algunas personas hacen propensos a la infección de oído, septicemia o infección de V. parahaemolyticus10de la herida. Los factores de virulencia de V. parahaemolyticus hemolisinas se dividen en dos tipos que contribuyen a la patogénesis de la enfermedad: la hemolisina directa termoestable (TDH) codificadas por los genes tdh y hemolisina relacionada con TDH, codificadas por genes de trh11. Los marcadores de virulencia (genes tdh y trh) de V. parahaemolyticus se encuentran sobre todo en muestras clínicas y no en muestras ambientales.
V. parahaemolyticus posee la capacidad de sobrevivir en un amplio rango de condiciones, responder rápidamente a cambios ambientales12. Su mecanismo de proliferación aumenta su potencial de peligro como su toxicidad aumenta en paralelo con la masa de la celda13. Peor aún, el cambio climático está proporcionando estas bacterias con amplias condiciones para acelerar su célula de crecimiento población14. Debido a su alta frecuencia, V. parahaemolyticus necesita ser monitoreada a lo largo de la cadena alimentaria, particularmente en el comercio y la producción de pescados y mariscos ya que esos productos son donde se encuentran en cantidades enormes de15,16 en todo el mundo. Actualmente se identifican las bacterias y aislados utilizando una variedad de métodos, incluyendo pruebas bioquímicas, enriquecimiento y medios selectivos17, enzima-ligado Inmunomagnética sorbente ensayo (ELISA)18, electroforesis de pulso-campo (PFGE) 19, pruebas de aglutinación de látex y de polimerasa de las pruebas de reacción en cadena (PCR)20. Estos métodos generalmente requieren personal calificado, instrumentos sofisticados y técnicas laboriosas que no proporcionan información sobre la contaminación inmediatamente. Esto limita seriamente la posibilidad de detectar con prontitud contaminación perjudicial y aplicaciones in situ. Herramientas de detección rápida siguen siendo un desafío excepcional.
Biodetección está emergiendo como una opción promisoria para la detección de patógenos alimentarios ya que ofrece un ahorro de tiempo, rentable, práctico y en tiempo real análisis método21,22,23,24 . Sin embargo, aunque ha habido muchos resultados positivos de la detección de analitos en las muestras inoculadas y solución mediante biosensores, todavía hay una falta de investigación aplicada a muestras reales en mezclas acuosas o extractos orgánicos25. Recientemente, biosensores electroquímicos utilizando detección directa y/o indirecta del ácido desoxirribonucléico (ADN) han recibido una atención creciente entre los científicos, debido a su detección específica del objetivo complementario a través de un evento de hibridación26 , 27 , 28 , 29. estos enfoques únicos son más estables en comparación con los biosensores basados en enzimas, ofreciendo así una tecnología prometedora para la miniaturización y comercialización. El objetivo del estudio aquí reportado es construir una herramienta rápida que puede detectar V. parahaemolyticus con alta selectividad, sensibilidad y sentido práctico, basado en la especificidad de secuencia de ADN durante la hibridación. Estrategias de identificación implican la combinación de nanopartículas de oro (AuNPs de PLA) estabilizado con ácido poliláctico30 y electrodos serigrafiados de carbono (SPCEs) en presencia del indicador de hibridación, azul de metileno (MB). El potencial de la construcción de detección desarrollados es explorado utilizando muestras de berberechos frescos y lisado de ADN de las bacterias.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaminoethane tetraacetic acid</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibasic sodium phosphate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium hydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>255793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>16368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold (III) chloride trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>520918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M44907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monobasic sodium phosphate, monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(lactic acid) resin, commercial grade 4042D</td>
			<td>NatureWorks</td>
			<td>4042D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>R&#38;M Chemicals</td>
			<td>59435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hexacyanoferrate III</td>
			<td>R&#38;M Chemicals</td>
			<td>208019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate anhydrous salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl) aminomethane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>T395-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X PCR Master Mix with Dual-Dye</td>
			<td>Norgen Biotek</td>
			<td>28240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose gel</td>
			<td>Merck</td>
			<td>101236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolton Agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolton Broth</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHROMagar Vibrio</td>
			<td>CHROMagar</td>
			<td>VB910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>Promega</td>
			<td>U1511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin methylene blue agar&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>101347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelRed</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>41001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Go Taq Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading dye 100 bp DNA ladder</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G2101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading dye 1kb DNA ladder</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G5711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Promega</td>
			<td>91176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol egg yolk polymyxin agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McConkey Agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutrient Broth</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq polymerase</td>
			<td>Merck</td>
			<td>71003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticase Soy Broth</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticase Soy Agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105458</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of an electrochemical dna biosensor to detect a foodborne pathogen

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) es un patógeno de los alimentos comunes que contribuye a una gran proporción de problemas de salud pública a nivel mundial, que afecten significativamente a la tasa de morbilidad y mortalidad humana. Los métodos convencionales para la detección de V. parahaemolyticus como métodos basados en la cultura, Ensayos inmunológicos y métodos moleculares requieren manejo muestras complicadas y lentas, tediosas y costosas. Recientemente, biosensores han demostrado para ser un método de detección completa y prometedores con las ventajas de la detección rápida, rentabilidad y practicidad. Esta investigación se centra en el desarrollo de un método rápido de detectar V. parahaemolyticus con alta selectividad y sensibilidad usando los principios de hibridación de ADN. En la obra, caracterización de poliláctico sintetizado estabilizado con ácido nanopartículas de oro (AuNPs de PLA) fue alcanzada usando difracción de rayos x (DRX), Espectroscopia ultravioleta-visible (UV-Vis), microscopia electrónica de transmisión (TEM), emisión de campo Microscopía electrónica (FESEM) y voltametría cíclica (CV). También llevamos a cabo pruebas de estabilidad, sensibilidad y reproducibilidad de las AuNPs PLA. Encontramos que el PLA-AuNPs había formado una sólida estructura de nanopartículas estabilizadas en solución acuosa. También observamos que la sensibilidad mejoró como resultado el menor valor de resistencia (Rct) de transferencia de carga y un aumento del área superficial activa (0,41 cm2). El desarrollo de los biosensores de ADN se basó en la modificación de un electrodo serigrafiados de carbono (SPCE) con PLA-AuNPs y utilizando azul de metileno (MB) como el indicador de redox. Se evaluaron los acontecimientos de inmovilización e hibridación por voltametría de pulso diferencial (DPV). Encontramos complementarios, no complementarios, y oligonucleótidos no coincidentes específicamente fueron distinguidos por el biosensor fabricado. También se demostró la detección fiable sensible en estudios de reactividad cruzada contra diversos agentes patógenos transmitidos por los alimentos y en la identificación de V. parahaemolyticus en berberechos frescos.

Formación de AuNPs fue revelada a través del cambio en el color de la solución acuosa con citrato de sodio presente. Esto causó que el color cambie de amarillo claro a un rojo rubí profundo. La generación de AuNPs PLA fue confirmada de los espectros UV-vis (figura 1) donde el crecimiento del pico de resonancia (SPR) de plasmón superficial se encontró a alrededor de 540 nm. La formación y existencia de AuNPs PLA fue indicada en las gamas de longitud d...

Watch this Scientific Journal Video about Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen at JoVE.com

Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

Desarrollo de un Biosensor de ADN electroquímico para la detección de un patógeno de transmisión alimentaria

Se presenta un protocolo para el desarrollo de un biosensor electroquímico de ADN que comprende un electrodo de carbono nanopartículas modificadas, serigrafiados oro, estabilizado con ácido del poliláctico para la detección de Vibrio parahaemolyticus .

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

Fabricación de ADN electroquímico biosensores para la detección Reagentless de ácidos nucleicos, proteínas y moléculas pequeñas

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Investigación

Bioingeniería

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Diseño de un biorreactor de presión cíclica de la Ex Vivo Estudio de las válvulas aórtica del corazón

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Hollow Microneedle-based Sensor for Multiplexed Transdermal Electrochemical Sensing

Hollow Microneedle basado en sensores para la detección electroquímica multiplexado transdérmica

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals ...

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

Bacterial Detección e Identificación Usando sensores electroquímicos

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

High-throughput, Automated Extraction of DNA and RNA from Clinical Samples using TruTip Technology on Common Liquid Handling Robots

De alto rendimiento, extracción automática de ADN y RNA de muestras clínicas utilizando la tecnología TruTip en común Robots Manejo de líquidos

TruTip is a simple nucleic acid extraction  technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a  pipette tip. The geometry of the ...

Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria

Biosensor para la detección de antibióticos Las bacterias estafilococo resistentes

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) ...

Sensing of Barrier Tissue Disruption with an Organic Electrochemical Transistor

Detección de barrera interrupción del tejido con un transistor orgánico Electroquímica

The gastrointestinal tract is an example of barrier tissue that provides a physical barrier against entry of pathogens and toxins, while allowing the ...

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

Un biochip electroquímico basado en microfluidos para el análisis de hibridación ADN-Label libre

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

Desarrollo de una<em&gt; In Vitro</em&gt; Plataforma ocular para probar las lentes de contacto

Currently, in vitro evaluations of contact lenses (CLs) for drug delivery are typically performed in large volume vials,1-6 which fail to mimic ...

The Use of a &#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

The Use of a ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

El uso de un análisis de biosensores conductimétricos β-lactamase-base para detectar las interacciones biomoleculares

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental ...