Name: development of an electrochemical dna biosensor to detect a foodborne pathogen
Uploaded: 2018-06-03T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen at JoVE.com

Författarna vill erkänna stöd av Universiti Putra Malaysia.

Obs: Alla kemiska och biokemiska reagenser som används bör vara av analyskvalitet och används utan ytterligare rening. Förbereda alla lösningar med sterilt avjoniserat vatten. Autoklav allt glas före sterilisering.
Försiktighet: Använd alla lämpliga säkerhetsrutiner när du utför laboratorieverksamhet inklusive användning av tekniska kontroller (spiskåpa, handskfack) och personlig skyddsutrustning (skyddsglasögon, handskar, labbrock, full längd byxor, stängd tå skor).
<p c...

De kritiska steg i en ram för framgångsrik utveckling av denna typ av elektrokemisk biosensor är urval av lämpliga biologiska erkännande element för givaren (nukleinsyra eller DNA här); kemisk metod för att konstruera det fjärranalys lagret av givaren; transduktion material; optimering av DNA immobilisering och hybridisering; och validering av den utvecklade biosensor använder riktiga prover.
Core till en framgångsrik utveckling av en känslig och selektiv elektrokemiska DNA biosens...

Ett större ämne för offentliga och vetenskaplig debatt under de senaste åren, matförgiftning förknippas främst med 3 ombud: mikroorganismer1, kemikalier2och parasiter3. Förorenad mat kan orsaka allvarliga hälsokonsekvenser i människor, särskilt i de högre riskgruppen för dem med svagt immunförsvar, äldre, gravida kvinnor, barn och unga barn4. Med mer än en miljon fall av akut diarré inträffar årligen i barn under 5 år i Afrika, Asien och Latinamerika, matförgiftning är en större global sjukdom5,6 och Världshälsoorganisationen har fastställt mikroorganismer som den viktigaste bidragsgivare7. Vibrio parahaemolyticus sticker ut bland de mest erkända virulenta stammarna. Vanligtvis finns i kust, flodmynningar och marina miljöer8, är det en gramnegativ bakterie, som blir aktiv i hög salt miljöer, och orsakar allvarliga mänskliga gastroenterit när ätit otillräckligt kokta, misskött eller råa Marine produkter9. Dessutom gör existerande sjukdomstillstånd hos vissa personer dem benägna att sår infektion, blodförgiftning eller öra infektion uppkommer V. parahaemolyticus10. Virulensfaktorer av V. parahaemolyticus Hemolysiner är indelade i två typer som bidrar till sjukdomspatogenes: termostabila direkt hemolysin (TDH) kodad av tdh gener och TDH-relaterade hemolysin kodad av trh gener11. Virulens markörerna (tdh och trh gener) för V. parahaemolyticus finns främst i kliniska prover i stället för miljömässiga exemplar.
V. parahaemolyticus besitter förmågan att överleva under en lång rad villkor, svarar snabbt på miljöförändringar12. Dess spridning mekanism eskalerar dess fara potential som dess toxicitet ökar parallellt med cell mass13. Ännu värre, klimatförändringar ger dessa bakterier med gott om villkor för att påskynda deras cell befolkningen tillväxt14. På grund av dess hög frekvens måste V. parahaemolyticus övervakas längs livsmedelskedjan, särskilt inom handel och produktion av skaldjur eftersom dessa produkter är där de finns i enorma mängder15,16 över hela världen. För närvarande bakterierna identifieras och isolerade med hjälp av en rad metoder inklusive biokemiska tester, anrikning och selektiva medier17, enzymkopplad immunmagnetisk sorbent assay (ELISA)18, puls-field gel electrophoresis (PFGE) 19, latex agglutinationsprov och polymeras-kedjereaktion (PCR) tester20. Dessa metoder kräver vanligtvis kvalificerad personal, sofistikerade instrument och mödosamma tekniker som inte ger information om kontaminering omedelbart. Detta begränsar kraftigt sannolikheten för att snabbt upptäcka skadliga föroreningar och hotellets program. Snabb upptäckt verktyg förbli en utomordentligt stor utmaning.
Biosensing framstår som ett lovande alternativ för livsmedelsburna patogener eftersom det erbjuder en tidsbesparande, kostnadseffektiv, praktiska och realtid analys metod21,22,23,24 . Dock även om det har varit många positiva resultat för analyten detection i spetsiga prover och standardlösning med biosensorer, finns det fortfarande en brist på forskning tillämpas på verkliga prover i vattenlösning blandningar eller organiska extrakt25. Nyligen, elektrokemiska biosensorer med direkta eller indirekta deoxiribonukleinsyra (DNA) identifiering har fått ökad uppmärksamhet bland forskare, på grund av deras specifika upptäckt av kompletterande målet via en hybridisering event26 , 27 , 28 , 29. dessa unika tillvägagångssätt är mer stabila jämfört med enzym-baserade biosensorer, vilket ger en lovande teknik för miniatyrisering och kommersialisering. Målet för studien rapporterade här är att konstruera en snabb verktyg som kan upptäcka V. parahaemolyticus med hög selektivitet och känslighet praktiska, baserat på DNA sekvens specificitet under hybridisering. Identifiering strategier innebär kombinationen av polylactic acid-stabiliserad Guldnanopartiklar (PLA-AuNPs)30 och screentryckt Kolelektroder (SPCEs) i närvaro av indikatorn hybridisering, metylenblått (MB). Potentialen hos den utvecklade upptäckt konstruera är ytterligare utforskas med hjälp av bakterier DNA lysate och fräsch hjärtmussla prover.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaminoethane tetraacetic acid</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibasic sodium phosphate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium hydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>255793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>16368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold (III) chloride trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>520918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M44907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monobasic sodium phosphate, monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(lactic acid) resin, commercial grade 4042D</td>
			<td>NatureWorks</td>
			<td>4042D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>R&#38;M Chemicals</td>
			<td>59435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hexacyanoferrate III</td>
			<td>R&#38;M Chemicals</td>
			<td>208019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate anhydrous salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl) aminomethane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>T395-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X PCR Master Mix with Dual-Dye</td>
			<td>Norgen Biotek</td>
			<td>28240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose gel</td>
			<td>Merck</td>
			<td>101236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolton Agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolton Broth</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHROMagar Vibrio</td>
			<td>CHROMagar</td>
			<td>VB910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>Promega</td>
			<td>U1511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin methylene blue agar&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>101347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelRed</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>41001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Go Taq Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading dye 100 bp DNA ladder</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G2101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading dye 1kb DNA ladder</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G5711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Promega</td>
			<td>91176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol egg yolk polymyxin agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McConkey Agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutrient Broth</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq polymerase</td>
			<td>Merck</td>
			<td>71003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticase Soy Broth</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticase Soy Agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105458</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of an electrochemical dna biosensor to detect a foodborne pathogen

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) är gemensamma livsmedelsburna patogener som bidrar till en stor del av problem med folkhälsan globalt, avsevärt påverkar graden av mänsklig dödlighet och sjuklighet. Konventionella metoder för detektion av V. parahaemolyticus såsom kultur-baserade metoder, immunologiska analyser och molekylär-baserade metoder kräver komplicerade provhantering och är tidskrävande, omständlig och kostsam. Nyligen, biosensorer har visat sig vara en lovande och omfattande detektionsmetod med fördelarna med snabb detektering, kostnadseffektivitet och funktionalitet. Denna forskning fokuserar på att utveckla en snabb metod för att upptäcka V. parahaemolyticus med hög selektivitet och känslighet enligt principerna för DNA hybridisering. I arbetet uppnås karakterisering av syntetiserade polylactic acid-stabiliserad Guldnanopartiklar (PLA-AuNPs) med hjälp av röntgendiffraktion (XRD), ultraviolett-synliga spektroskopi (UV-Vis), Transmission Electron Microscopy (TEM), fält-utsläpp Scanning Electron Microscopy (FESEM) och cyklisk voltametri (CV). Vi genomförde också ytterligare provning av stabilitet, känslighet och reproducerbarhet av den PLA-AuNPs. Vi hittade att de PLA-AuNPs bildas en sund struktur av stabiliserad nanopartiklar i vattenlösning. Vi observerade också att känsligheten förbättrats tack vare mindre kostnad överföring motstånd (Rct) värdet och en ökning av aktiv yta (0.41 cm2). Utvecklingen av vårt DNA biosensor baserades på modifiering av en screentryckt kol elektroden (SPCE) med PLA-AuNPs och med metylenblått (MB) som indikatorn redox. Vi bedömde händelserna immobilisering och hybridisering av differential pulse voltametri (DPV). Vi hittade som kompletterande, icke-komplementära och inkompatibla oligonukleotider var särskilt kännetecknas av den fabricerade biosensor. Den visade också på ett tillförlitligt sätt känslig detektion i korsreaktivitet studier mot olika livsmedelsburna patogener och identifiering av V. parahaemolyticus i färska hjärtmusslor.

Bildandet av AuNPs avslöjades genom förändringen i färg av en vattenlösning med natriumcitrat närvarande. Detta orsakade färgen som ska ändra från ljusgul till en djupt rubinröd. Generering av PLA-AuNPs bekräftades från UV-vis spektra (figur 1) där tillväxten av ytan plasmon resonans (SPR) toppen hittades vid cirka 540 nm. Bildning och förekomsten av PLA-AuNPs indikerades på 500-600 nm våglängd intervall, beroende på partikel storlek<sup cl...

Watch this Scientific Journal Video about Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen at JoVE.com

Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

Utveckling av en elektrokemisk DNA Biosensor att upptäcka livsmedelsburna patogener

Ett protokoll för utvecklingen av en elektrokemisk DNA biosensor bestående av en polylactic acid-stabiliserad, guld nanopartiklar modifierade, screentryckt kol elektroden för att upptäcka Vibrio parahaemolyticus presenteras.

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

Tillverkning av elektrokemiska-DNA biosensorer för att Reagentless Upptäckt av nukleinsyror, proteiner och små molekyler

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design av en cyklisk tryck Bioreaktor för Ex vivo Studie av Aorta hjärtklaffar

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Hollow Microneedle-based Sensor for Multiplexed Transdermal Electrochemical Sensing

Ihåliga mikronål-baserad sensor för Multiplexade Transdermal Elektrokemisk Sensing

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals ...

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

Bakteriell Detection &amp; identifiering med elektrokemiska sensorer

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

High-throughput, Automated Extraction of DNA and RNA from Clinical Samples using TruTip Technology on Common Liquid Handling Robots

Hög genomströmning, automatiserat rena fram DNA och RNA från kliniska prover med TruTip Technology om gemensamma Vätskehantering Robotar

TruTip is a simple nucleic acid extraction  technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a  pipette tip. The geometry of the ...

Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria

Biosensor för detektion av antibiotikaresistenta stafylokocker

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) ...

Sensing of Barrier Tissue Disruption with an Organic Electrochemical Transistor

Avkänning av Barrier Tissue Störningar med en organisk Elektro Transistor

The gastrointestinal tract is an example of barrier tissue that provides a physical barrier against entry of pathogens and toxins, while allowing the ...

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

En mikroflödesbaserad Elektro Biochip för Label-fritt DNA hybridisering Analys

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

Utveckling av en<em&gt; In Vitro</em&gt; Ögon plattformen Testa Kontaktlinser

Currently, in vitro evaluations of contact lenses (CLs) for drug delivery are typically performed in large volume vials,1-6 which fail to mimic ...

The Use of a &#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

The Use of a ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

Användning av en β-laktamas-baserade Conductimetric Biosensor analysen att upptäcka Biomolekylers interaktion

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental ...