Name: standardized method for high-throughput sterilization of arabidopsis seeds
Uploaded: 2017-10-17T15:00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds at JoVE.com

Vi vil gerne takke Gauri Datta for hendes hjælp i udarbejdelsen af eksperimentelle materialer. Vi er også taknemmelige til Bettina Wittler og James Mann for den kritiske gennemgang af håndskriftet. Dette arbejde blev støttet af NSF tilskud DBI-1049341 og MCB-1143813.

1. forberedelse af 1 x Murashige og Skoog (MS) medium <ol><li>tilføje 4.31 g på MS basal salt blanding, 10 g saccharose og 0,5 g 2-(N-Morpholino) ethanesulfonic syre (MES) til et bægerglas indeholdende 0,8 L destilleret vand og rør til at opløse. Kontrollere og justere pH til 5.7 ved hjælp af 1 M kaliumhydroxid (KOH). Der tilsættes destilleret vand for at gøre 1 L.</li>
	<li>Inddeler mediet i to 1 L flasker, 500 mL. Tilsaettes 5 g agar til hver flaske. Holde låget løs.</li>
	<li>Autoklave i 20 min ved 121 ° C, 15 psi med en magnetisk røre bar i flasken.</li>
	<li>Efter autoklavering, Placer flasker på en røre pladen på lav hastighed, og lad MS medium køle af til 45-50 ° C (indtil flasken kan afholdes med bare hænder).</li>
	<li>Starter fra dette trin, udføre alle trinene i sterile forhold i en laminar flow hætte. Tilsættes 500 µL Gamborg &#39; s Vitamin løsning på hver flaske og rør MS medium for at jævnt distribuere vitamin løsning.</li>
	<li>Hældes plader til at dække cirka halvdelen af dybden af pladen nok medier.</li>
	<li>Tillade tallerkner afkøles ved stuetemperatur i ca 1 time at tillade agar størkne. 
	Bemærk: Hvis pladerne ikke skal anvendes straks, pak dem ind i plastic og opbevares ved 4 ° C (køleskabet temperatur). Overdækket plader, kasser eller rør med størknede agar kan opbevares i flere uger ved 4 ° C i en lufttæt beholder.</li>
</ol> 2. Sterilisation af Arabidopsis frø med blegemiddel <ol><li>Forbered MS plader i overensstemmelse med punkt 1 i protokollen. Autoklave 100 mL destilleret vand på samme tid som MS Media. Brug denne senere som skyllevand og at suspendere frø støtte i plating. 
	Bemærk: Hvis det ønskes, 0,8% agar blanding (w/v) (f.eks. phytagar) kan også være autoklaveres i dette trin. Agar blanding kan erstattes destilleret vand under plating (trin 2.5.3.). Den ekstra viskositet af agar blandingen gør det nemmere at plads frø på plade eller plante i rækker hvis nødvendigt.</li>
	<li>Forbered 50% (v/v) blegemiddel løsning skal bruges til sterilisering af frø. For at fortynde blegemiddel, tilsættes 100 mL af blegemiddel til 100 mL destilleret vand. Tilføje 50 µL Tween 20 vaskemiddel til blegemiddelopløsning. 
	Bemærk: Forberedt blegemiddelopløsning kan opbevares i op til en måned, så længe det kun åbnes under sterile forhold.</li>
	<li>Alikvot 100 frø i en 1,5 mL microcentrifuge tube.</li>
	<li>Sterilisere frøene ved hjælp af en 50% blegemiddelopløsning.
	<ol><li>i en laminar flow hætte, tilføje 500 µL af opløsningen 50% blegemiddel til microcentrifuge røret som indeholder frø. Tryk på bunden af røret at suspendere frø i blegemiddelopløsning. 
		Bemærk: Alternativt, en rotator eller platform shaker kan bruges til at holde frøene suspenderet.</li>
	</ol></li> <li>Skylles blegemiddelopløsning fra røret.
	<ol><li>Efter 10 min, fjerne blegemiddelopløsning fra microcentrifuge røret ved hjælp af en pipette eller en indsugningsventil monteret med en pipette spids for enden.</li>
		<li>Tilføje 500 µL sterilt destilleret vand til røret. Luk røret og vend for at blande. Tillad frø til at bilægge til bunden af røret. Når frø har slået sig ned til bunden af røret forsigtigt fjerne blegemiddelopløsning af pipettering. Gerne gentage skylningen processen 6 gange.</li>
		<li>Tilsættes 1 mL autoklaveres destilleret vand til rør til at suspendere frøene.</li>
	</ol></li> <li>Plade steriliseret frøene på MS plader.
	<ol><li>i en laminar flow hætte, etiket i bunden af MS pladen med den bestand navn og den aktuelle dato.</li>
		<li>Hæld frøene fra microcentrifuge tube på MS pladen. Sprede frø omkring MS pladen ved hjælp af en steril, engangsbrug inoculating løkke eller en steril pipette tip. 
		Bemærk: Hvis frø skal sås i rækker, en pipette med 200 µL spids kan bruges individuelt placere frøene i de ønskede stilling. For at forbedre strømmen af frø, kan slutningen af pipette tip trimmes 3-5 mm ved hjælp af saks. Malplacerede frø eller klynger af frø kan derefter flyttes eller adskilt ved hjælp af en steril engangsbrug inoculating løkke.</li>
		<li>Placerer MS pladen bag på de af laminar flow hætte med låget halv lukket. Lad det overskydende vand til at fordampe fra MS plate.</li>
		<li>Låget lægges på MS plade. Seal MS plade af indpakning pladen med Mikroporøs papir kirurgisk tape (Se Tabel of Materials).</li>
	</ol></li></ol> 3. Sterilisation af Arabidopsis frø med chlorgas <ol><li>Forbered MS plader i overensstemmelse med punkt 1 i protokollen. Autoklave 100 mL destilleret vand på samme tid som MS Media; Dette vil blive brugt senere til at suspendere frøene til støtte i plating. 
	Bemærk: Hvis det ønskes, 0,8% agar blanding (w/v) (f.eks. phytagar) kan også være autoklaveres i dette trin. Agar blanding kan erstattes destilleret vand under plating (trin 3.6.2.). Den ekstra viskositet af agar blandingen gør det nemmere at plads frø på plade eller plante i rækker hvis nødvendigt.</li>
	<li>Før du starter sterilisation, beregne de mængder af blegemiddel og saltsyre (HCl) kræves for at producere chlorgas.
	<ol><li>Beregne mængden af HCl skulle producere 6,1% Cl 2 kræves for sterilisation.</li>
		<li>Bruger følgende formel: 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56587/56587eq1.jpg" /> med 7.000 mL som mængden af objektbeholderen sterilisation og 6.1% Cl 2; Volumenandelen af HCl er beregnet til 3 mL. 
		Bemærk: Et regneark, der er programmeret til at udføre beregningen for forskellige mængder af container og % Cl 2 gives som supplerende tabel 1.</li>
	</ol></li> <li>Alikvot 100 frø ind i 0,5 mL microcentrifuge rør. Lukke hætter for hvert hætteglas, placere hætteglassene i en plastik rack og afsætte. 
	Bemærk: Frø kan gemmes i en længere periode af tid på dette punkt, så længe de er gemt i ordentlige forhold. Opbevaringsforhold kan findes i punkt 3.3.2 i protokollen af Rivero og kolleger 4. 96-brønd plade format kan også bruges.</li>
	<li>Forberede de materialer, der er nødvendige for at udføre klor gas sterilisation.
	<ol><li>Få blegemiddel og HCl fra deres opbevaringssteder.</li>
		<li>Skåret en strimmel af store paraffin film (Se Tabel af materialer) for at bruge taktfast 3.5.3. at forsegle objektbeholderen sterilisation.</li>
		<li>Placer plastikbeholder med låg som sterilisering vil finde sted inde i et stinkskab. Åbn hætter på alle frø hætteglas og placere hele frø rack inde den plastikbeholder.</li>
	</ol></li> <li>Udføre klor gas sterilisation ved stuetemperatur. 
	Forsigtig: Arbejde med blegemiddel og syre separat. Efterlad ikke enten flaske reducerede for at reducere risikoen for udslip. Bruge relevante personlige værnemidler (PPE) herunder handsker og en lab coat. Hvis enten blegemiddel eller syre stænk på handsker, ændre handsker før håndtering af andre materialer. Fjern altid handsker i stinkskab i tilfælde af forurening af blegemiddel eller syre.
	<ol><li>Placere et 250 mL bægerglas inde i containeren og tilsættes 100 mL af blegemiddel. 
		Bemærk: Reaktionen mellem HCl og blegemiddel kræver mindst 22 bind overskud af blegemiddel. Reaktionen vil forbruge HCl og blege ved at frigive Cl 2 gas med natriumchlorid (NaCl) og vand som biprodukter. Med et stort overskud af blegemiddel kan forbruget af yderligere HCl dnder perioden udluftning, som nedsætter mængden af natrium bicarbonat (NaHCO 3) for at neutralisere løsningen til bortskaffelse. 
		Forsigtig: Bægerglasset bør være mindst to gange den samlede flydende mængde blegemiddel + HCl. Dette forhindrer sprøjt flygter bægerglasset under de næste skridt, som kan ødelægge frø, blegemiddel tøj eller brænde eksponeret hud.</li>
		<li>Tilsættes 3 mL HCL over i bægerglasset, der indeholder blegemiddel. 
		Forsigtig: Den første reaktion vil producere bobler, især i gas koncentrationer højere end 6,1%. En langærmet laboratoriekittel er nødvendig for dette trin.</li>
		<li>Luk sterilisation container og forsegle det med paraffin film straks.</li>
		<li>Overvåge sterilisation beholder under sterilisering tid at sikre gas ophobning; ophobning af chlorgas bør ses som en svag gul haze inde i containeren. 
		Advarsel: Kontrollér med jævne mellemrum objektbeholderen sterilisation for at sikre, at trykket inde ikke har unseated låget eller paraffin film. Hvis låget er kommet unseated eller paraffin film er kommet løs, luk låget og nøje wrap beholderen med et ekstra lag af paraffin film.</li>
		<li>Efter 1 h-sterilisation, åbnes beholderen ved fjernelse af paraffin film og åbne låget på det ene hjørne. Tillade container til at udlufte for 3 h for at fuldføre reaktionen og fjerne chlorgas.</li>
		<li>Lukke hætter af alle de microcentrifuge rørene i frø rack. 
		Bemærk: Steriliseret frø kan gemmes indtil tidspunktet for plating så længe de er gemt i tør tilstand.</li>
		<li>Fjerne frø rack og placere det i en laminar flow hætte.</li>
		<li>Neutralisere klor gas reaktion <ol><li>tilføje 1,5 g NaHCO 3 pulver langsomt over i bægerglasset, der indeholder blegemiddel/HCl løsning og omrøres med en glasstav at opløse NaHCO 3 i løsning. Fortsæt med at tilføje NaHCO 3 indtil kuldioxid (CO 2) gasbobler har stoppet danner. 
			Forsigtig: Tilsæt langsomt for at undgå stænk. Bruge relevante PPE herunder handsker og en laboratoriekittel.</li>
			<li>Test pH løsning ved brug af pH strips eller et pH-meter. Tilføje yderligere NaHCO 3 hvis nødvendigt indtil pH af løsningen er neutral (pH 7,0). På dette tidspunkt løsningen kan fjernes fra stinkskab og bortskaffes i overensstemmelse med alle gældende bortskaffelse retningslinjer. 
			Forsigtig: Hvis nogen lugt er bemærket under bortskaffelse, så løsningen bør straks returneres til stinkskab.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Plade steriliseret frøene på MS plader.
	<ol><li>i en laminar flow hætte, etiket i bunden af MS pladen med den bestand navn og den aktuelle dato.</li>
		<li>Tilføje 500 µL steriliseret destilleret vand til hvert microcentrifuge tube at suspendere frøene. Hæld frøene til MS plade og sprede frø jævnt omkring pladen ved hjælp af en steril, engangsbrug inoculating løkke eller en steril pipette tip.</li>
		<li>Placerer MS pladen bag på de af laminar flow hætte med låget halv lukket. Lad det overskydende vand til at fordampe fra MS plate.</li>
		<li>Låget lægges på MS plade. Forsegle MS plade af indpakning plade med Mikroporøs papir kirurgisk tape.</li>
	</ol></li></ol> 4. Væksten i Arabidopsis på MS plader <ol><li>placerer pladerne med låg på toppen i tre dage ved 4 ˚C og omgivende luftfugtighed. 
	Bemærk: Denne proces kaldes stratificering og tjener til at synkronisere spiring af enkelte frø.</li>
	<li>Overføre pladerne til vækstmiljø.
	<ol><li>Bevar temperatur på 23 ° C og lysintensitet på 120-150 µmol/m 2 s med 16 h lys / 8 h mørke lysperiode. Placere plader fladt i grow miljø med låget på toppen, så rødderne vokser i medium.</li>
	</ol></li> <li>Lad stiklinger på plader vokse til 8 dage. 
	Bemærk: En 8 dages voksende periode giver mulighed for sent spirende frø til at spire. Plader kan blive scoret hurtigere end 8 dage, hvis alle frø har spiret.</li>
	<li>Score spiring satser.
	<ol><li>Rekord antal frø der er spiret og der ikke har spiret. Beregne spiring ved at dividere antallet af frø som spiret af det samlede antal frø på tallerkenen. 
		Bemærk: Spiring regnes, når radicle har projiceret udenfor frø frakke og to kimbladene er synlige.</li>
		<li>Også tælle antallet af frø ramt af skimmelsvamp at bestemme effektiviteten af sterilisation betingelser.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Weigel, D., Glazebrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Arabidopsis: a laboratory manual. , (2002).</li><li>Koornneef, M., Meinke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+Arabidopsis+as+a+model+plant.">The development of Arabidopsis as a model plant.</a> Plant J. 61 (6), 909-921 (2010).</li><li>The Arabidopsis Genome Initiative. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=+Analysis+of+the+genome+sequence+of+the+flowering+plant+Arabidopsis+thaliana."> Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana.</a> Nature. 408 (6814), 796-815 (2000).</li><li>Rivero, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handling+Arabidopsis+plants:+growth,+preservation+of+seeds,+transformation,+and+genetic+crosses.">Handling Arabidopsis plants: growth, preservation of seeds, transformation, and genetic crosses.</a> Methods Mol Biol. 1062, 3-25 (2014).</li><li>Yamada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Empirical+analysis+of+transcriptional+activity+in+the+Arabidopsis+genome.">Empirical analysis of transcriptional activity in the Arabidopsis genome.</a> Science. 302 (5646), 842-846 (2003).</li><li>Alonso, J. M., Stepanova, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+transformation+with+large+bacterial+artificial+chromosomes.">Arabidopsis transformation with large bacterial artificial chromosomes.</a> Methods Mol Biol. 1062, 271-283 (2014).</li><li>Savage, L. J., Imre, K. M., Hall, D. A., Last, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+essential+Arabidopsis+nuclear+genes+encoding+plastid-targeted+proteins.">Analysis of essential Arabidopsis nuclear genes encoding plastid-targeted proteins.</a> PLoS One. 8 (9), e73291 (2013).</li><li>Podar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+growth+and+cultivation.">Plant growth and cultivation.</a> Methods Mol Biol. 953, 23-45 (2013).</li><li>Xu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+agar-plate+method+for+studying+root+growth+and+response+of+Arabidopsis+thaliana.">An improved agar-plate method for studying root growth and response of Arabidopsis thaliana.</a> Sci Rep. 3, 1273 (2013).</li><li>Clough, S. J., Bent, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Floral+dip:+a+simplified+method+for+Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana.">Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.</a> Plant J. 16, (1998).</li><li>Cederholm, H. M., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+sensitivities+to+phosphate+deprivation+suggest+that+RGF+peptides+play+disparate+roles+in+Arabidopsis+thaliana+root+development.">Distinct sensitivities to phosphate deprivation suggest that RGF peptides play disparate roles in Arabidopsis thaliana root development.</a> New Phytol. 207 (3), 683-691 (2015).</li><li>Ye, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+ovule+is+the+target+for+Agrobacterium+in+planta+vacuum+infiltration+transformation.">Arabidopsis ovule is the target for Agrobacterium in planta vacuum infiltration transformation.</a> Plant J. 19 (3), 249-257 (1999).</li><li>Kuromori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+collection+of+11+800+single-copy+Ds+transposon+insertion+lines+in+Arabidopsis.">A collection of 11 800 single-copy Ds transposon insertion lines in Arabidopsis.</a> Plant J. 37 (6), 897-905 (2004).</li><li>Fiers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+14-amino+acid+CLV3,+CLE19,+and+CLE40+peptides+trigger+consumption+of+the+root+meristem+in+Arabidopsis+through+a+CLAVATA2-dependent+pathway.">The 14-amino acid CLV3, CLE19, and CLE40 peptides trigger consumption of the root meristem in Arabidopsis through a CLAVATA2-dependent pathway.</a> Plant Cell. 17 (9), 2542-2553 (2005).</li><li>Stepanova, A. N., Alonso, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR-based+screening+for+insertional+mutants.">PCR-based screening for insertional mutants.</a> Methods Mol Biol. 323, 163-172 (2006).</li><li>O'Malley, R. C., Alonso, J. M., Kim, C. J., Leisse, T. J., Ecker, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+adapter+ligation-mediated+PCR+method+for+high-throughput+mapping+of+T-DNA+inserts+in+the+Arabidopsis+genome.">An adapter ligation-mediated PCR method for high-throughput mapping of T-DNA inserts in the Arabidopsis genome.</a> Nat Protoc. 2 (11), 2910-2917 (2007).</li><li>L&#243;pez-Ribera, I., Vicient, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+ultrasonication+to+increase+germination+rates+of+Arabidopsis+seeds.">Use of ultrasonication to increase germination rates of Arabidopsis seeds.</a> Plant Methods. 13 (31), (2017).</li></ol>

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Når voksende Arabidopsis frø på sterile media, skal en form for sterilisation anvendes. Både blegemiddel og klor gas sterilisation behandlinger resultere i lignende spiring sats og mug væksthæmning. Hverken sterilisering metode medfører en betydelig reduktion i spiring sats for frø med høje spireevne potentiale; blegemiddel sterilisation anbefales dog til linjer med lavere spiring potentiale (20-70%), på grund af lille, omend ikke-væsentlig, forbedring af spiring sats i forhold til gas sterilisation (figur 3A).
Sterilisering Arabidopsis frø med blegemiddel koncentrationer fra 40-100% for op til 10 min. giver tilfredsstillende spiring procenter og effektiv skimmel undertrykkelse. Selv om blegemidler koncentrationer mindre end 40% give tilstrækkelig sterilisering for de fleste partier af sædekorn, ved hjælp af en koncentration på 40% eller højere garantier effektiv sterilisering af selv stærkt forurenet frøpartier. Det er vigtigt ikke at overstige 10 min af sterilisation ved brug af blegemiddel koncentrationer lige eller højere end 80% for at undgå høje frø dødelighed og defekter i sætteplante udvikling.
Behandling af Arabidopsis frø med klor gas koncentrationer på 6,1% eller 16,5% til 1 h resultater i høje spireevne priser og passende skimmel fjernelse. Lav klor koncentrationen (2,1%) kan bruges med held ved at øge varigheden af sterilisation til 3 h.
Når par linjer skal være steriliseret, anbefales flydende sterilisation i en opløsning af 50% blegemiddel i 10 min. For et større antal linjer er gas sterilisering med en koncentration på 6,1% for 1 h en bedre løsning, da mange linjer kan være steriliseret hurtigt og let med mindre manipulation.
Vores resultater giver standardiserede betingelser for sterilisering både store antal frø af forskellige genotyper og frø med lavere spiring potentielle. Den eneste begrænsning af disse sterilisation teknikker er, at de ikke kan anvendes på frø med spireevne satser, mindre end 20% på grund af omfattende frø dødelighed. Alternative metoder, såsom sonikering17, at øge spiring fald i fravær af sterilisation kan være gavnlig i disse tilfælde.

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) er en førsteklasses model organisme for grundforskning og anvendt forskning i plante biologi1,2,3. Mens standardbetingelser for Arabidopsis vækst har været veletablerede4, er effekten af frø sterilisation på frø levedygtighed ikke blevet grundigt testet. Solid media i plader eller kasser bruges rutinemæssigt til at fremme en vækst i Arabidopsis stiklinger for mange eksperimentelle programmer, såsom identifikation af homozygot dødbringende mutanter i en adskillelse befolkning, observation af skyde og root fænotyper på tidligt faser, isolering af patogenet-fri væv, samling af store mængder af sætteplante væv, udvælgelse af transformants eller resistente planter og evaluering af spiring1,2,3,4 . Frø høstet fra planter, der dyrkes i et drivhus eller vækst kammer forurenet lejlighedsvis med mikroorganismer og støv. Væksten i Arabidopsis stiklinger på forskellige typer af sterile medier kræver forudgående frø sterilisation at fjerne mikrobielle forureninger som svampe og bakterier er til stede på frø overflade. Brug af en effektiv frø sterilisation regime er kritisk for en balance mellem høje spireevne, minimum forurening og kraftig plantevækst.
De to mest almindelige metoder, der anvendes til Arabidopsis frø Sterilisation er baseret på kommercielle blegemiddel (flydende-fase) og chlorgas (damp-fase). Forskellige procedurer har været ansat i både flydende-fase sterilisation1,4,5,6,7,8,9 , 10 og damp-fase Sterilisation af Arabidopsis frø8,10,11,12,13,14,15 ,16. Men mens disse procedurer har været effektive til varetagelse af frø Sterilisation af de udnyttede genotyper, en detaljeret analyse af effekten af forskellige sterilisation behandlinger på frø af forskellige genotyper er ikke blevet rapporteret. Optimering af procedurerne Sterilisation er derfor skal definere betingelser, hvor effektiv Sterilisation er kombineret med høje spireevne sats.
The Arabidopsis biologiske ressource Center (ABRC) er unikt positioneret for at en) test frø levedygtigheden af en række forskellige genotyper i den samling og b) drage fordel af de kvalitetskontrolprocedurer anvendes internt og som svar på feedback om frø spiring. Formålet med forsøgene præsenteres her var at fastslå virkningerne af forskellige sterilisation metoder på frø spiring af en vifte af Arabidopsis genotyper. Optimeret sterilisation procedurer, hvilket resultere i høj frø spiring priser fastholdes minimal patogen forurening er præsenteret for både blegemiddel og klor gas sterilisation.

standardized method for high-throughput sterilization of arabidopsis seeds

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) stiklinger skal ofte dyrkes på sterile medier. Dette kræver forudgående frø sterilisation til at forhindre vækst af mikrobielle forureninger stede på frø overfladen. I øjeblikket er Arabidopsis frø steriliseret med to særskilte sterilisation teknikker i forhold, der adskiller sig lidt mellem labs og er ikke blevet standardiseret, hvilket ofte resulterer i kun delvist effektive sterilisering eller overdreven frø dødelighed. De fleste af disse metoder er heller ikke nemt skalerbar til et stort antal frø linjer af forskellige genotyper. Som teknologier for høj overførselshastighed analyse af Arabidopsis fortsætte til at formere sig, bliver standardiserede teknikker til sterilisering stort antal frø af forskellige genotyper afgørende for udførelse af disse typer af forsøg. Svar af en række Arabidopsis linjer på to forskellige sterilisation teknikker blev evalueret baseret på seed spiring sats og omfanget af frø kontaminering med mikroorganismer og andre patogener. Behandlingerne indgår forskellige koncentrationer af sterilisering agenter og tidspunkter for eksponering, kombineret for at fastlægge optimale betingelser for Arabidopsis frø sterilisation. Optimerede protokoller er blevet udviklet for to forskellige sterilisation metoder: blegemiddel (flydende-fase) og (Cl2) klorgas (damp-fase), begge resulterer i høje frø spiring priser og minimal mikrobiel kontaminering. Nytten af disse protokoller blev illustreret gennem test af både vildtype og mutant frø med en vifte af spiring potentialer. Vores resultater viser, at frø kan være effektivt steriliseret ved hjælp af enten metoden uden overdreven frø dødelighed, selv om skadelige effekter af sterilisation blev observeret for frø med lavere end optimal spiring potentiale. Derudover blev en ligning udviklet for at give forskerne til at anvende standardiserede klor gas sterilisation betingelser på lufttætte beholdere i forskellige størrelser. De protokoller er beskrevet her tillader nem, effektiv og billig frø sterilisation for et stort antal Arabidopsis linjer.

Arabidopsis frø indsamlet fra et åbent felt, drivhus eller vækst kammer er undertiden forurenet af forskellige mikroorganismer som svampe og bakterier1,4. Således, spirende frø på sterile medier kan være særligt udfordrende på grund af forurening af pladerne, især når frø er begrænset. Den optimerede protokol for både blegemiddel og klor gas sterilisation, hvis resultater præsenteres nedenfor, minimerer problemet og bevarer levedygtigheden af frø kræves for høj overførselshastighed ansøgninger.
Virkningerne af blegemiddel sterilisation på spiring af frø, Arabidopsis Col-0
Blegemiddel er de mest almindeligt anvendte agent for frø sterilisation i mange plantearter. Den optimale koncentration af sterilisation agent og eksponeringstiden varierer mellem arter. Et antal protokoller har været ansat ved hjælp af blegemiddel til Sterilisation af Arabidopsis frø1,4,5,6,7,8,9 , 10. fire forskellige koncentrationer af blegemiddel med fem forskellige eksponeringstid perioder blev testet og resultaterne præsenteres i figur 1. Behandlingerne, der blev anvendt på Columbia wild-type (Col-0) frø. Effekten af blegemiddel koncentration på spiring af frø, Col-0 varierede afhængigt af tidspunktet for sterilisation som påvist ved en betydelig interaktion mellem blegemiddel koncentration og tidspunkt for sterilisation (figur 1, P &#60; 0,001, ANOVA-analyse af varians).
I eksperimenter med sterilisation gange mellem 5 og 10 min resulterede behandlinger med alle blegemiddel koncentrationer i lige så høj spiring sats af Col-0 frø (figur 1). Høje spireevne priser blev også observeret til husholdningsbrug blegemiddel koncentrationer af 40% og 50% for alle sterilisation gange. Behandlinger med 80% og 100% blegemiddel for perioder længere end 10 min resulterede i et betydeligt fald i spiring sats i forhold til de kortere iblødsætning gange (P &#60; 0,01, ANOVA). Desuden, for både 80% og 100% blegemiddel behandlinger i 20 min., spiring var faldt betydeligt i forhold til de tilsvarende 40% og 50% blegemiddel behandlinger (P &#60; 0,001, ANOVA).
Frø vises forskellige niveauer af blegning og shriveling når ved hjælp af høje blegemiddel koncentrationer for 15 min eller længere. I tilføjelse til relativt højt (op til 32%) frø dødelighed, spirede frø steriliseret i disse betingelser ofte viste vækst defekter, afspejles i en fiasko af kimbladene og hypocotyls at udfolde sig og aflang, hvilket resulterer i udviklingsmæssige anholdelse. De fleste behandlinger (14 ud af 20) var helt skimmel-fri, hvilket resulterer i samlet skimmel niveau gennemsnit på 0,21% ± 0,003 (tabel 1).
En behandling med 50% blegemiddel og en iblødsætning tid på 10 min. blev valgt som den bedste sterilisation ordning fordi det kombineret høj spireprocenten med god hæmning af overflade patogen vækst. Denne behandling blev udvalgt til at teste effekten af blegemiddel sterilisation på forskellige mutant linjer som beskrevet nedenfor.
Virkningerne af klor gas sterilisation på spiring af frø, Col-0
For at optimere klor gas sterilisation betingelser, blev tre forskellige koncentrationer af chlorgas brugt til at sterilisere Col-0 frø i to perioder (tabel 2). Koncentrationen af blev beregnet på baggrund af mængden af koncentreret HCl og mængden af sterilisation beholder ved hjælp af følgende ligning:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56587/56587eq2.jpg">
Denne ligning blev afledt ved hjælp af ideal gas loven antager 12,3 M HCl, en temperatur på 23 ° C og standard atmosfærisk tryk 101.3 kPa.
Effekten af klor koncentrationen på spiring af frø, Col-0 blev vist til at afhænge af tidspunktet for sterilisation som angivet af en betydelig interaktion mellem tid og koncentration faktorer (figur 2A, P &#60; 0,01, ANOVA) . Klor gaskoncentrationen havde ingen signifikant effekt på spiring af Col-0 frø underkastes 1 h sterilisation. Med denne sterilisation tid, alle koncentrationer af chlorgas fremmes tilsvarende høje niveauer af spiring, over 85% (P &#62; 0,05, ANOVA). På den anden side en 3 h-lange sterilisation resulterede i en betydelig nedgang i spiring satsen for den højeste koncentration af chlorgas, sammenlignet med de to lavere koncentrationer (P &#60; 0,05, ANOVA). Disse resultater viser, at behandlinger af Arabidopsis frø med nogen af de testede klor gas koncentrationer for 1 h, eller gas koncentrationer under 16,5% til 3 h, er lige så effektiv i at bevare frø levedygtighed, da spiring satser var altid større end 82%. Men sterilisering frø til 3 h med 16,5% gas var skadelig for frø spiring.
Forekomsten af mug var også afhænger af koncentrationen og eksponeringstid. Skimmelvækst var effektivt hæmmede med de relativt høje koncentrationer af 6,1% og 16,5% chlorgas 1 h-lang behandling og med alle koncentrationer for 3 h (figur 2B).
Baseret på disse resultater, blev en behandling med en koncentration på 6,1% for 1 h (tabel 2) valgt som den bedste damp-fase sterilisation betingelse til at teste effekten af gas sterilisation på forskellige mutant linjer, da det kombineret høje spireevne sats ( 85%) med meget lavt niveau for skimmel forurening (0,02%).
Virkningerne af blegemiddel og klor gas sterilisation på frø med forskellige spiring potentielle
Statistisk analyse viste, at spireevnen svar til sterilisation metoder afhængig af spiring potentiale af linjerne (figur 3A, P &#60; 0,01, ANOVA). Hverken blegemiddel eller klor gas sterilisation nedsat spiring af frø med høje spireevne potentielle (gruppe 4 og 5). Hverken behandling havde en effekt på den allerede lave spiring sats af gruppen med den laveste spireevnepotentiale (gruppe 1). Derimod klor gas sterilisation resulteret i en betydelig reduktion af ca. 12-18% (P &#60; 0,01, ANOVA) i spiring af frø med mellemliggende spiring potentiale (gruppe 2 og 3). Blegemiddel sterilisation faldt også spiring sats med 13% i gruppe 2, men det falde ikke spiring sats af gruppe 3. Selv om der var ingen signifikant forskel i spiring sats mellem blegemiddel og klor gas behandlinger i enhver spiring gruppe (figur 3A, P &#62; 0.442, ANOVA), frø steriliseret med blegemiddel har en lidt højere spiring sats end gas-steriliseret frø i alle spiring grupper.
Sterilisation behandlinger betydeligt ændret (P &#60; 0,001, ANOVA) procent af frø ramt af skimmelsvamp (figur 3B). Begge klor gas og blegemiddel sterilisation resulteret i mindre skimmelvækst (P &#60; 0,05, ANOVA) sammenlignet med ingen sterilisation. Der var ingen forskel i mug niveau fundet mellem gas og blegemiddel sterilisation i enhver gruppe (figur 3B, P &#62; 0,4, ANOVA).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56587/56587fig1.jpg"> 
Figur 1: virkningerne af blegemiddel koncentration og sterilisation tid på spiring af frø, Arabidopsis Col-0. Værdierne er middel ± SD fremstillet af 5 uafhængige replications af eksperimentet. * Angiver betydelige forskelle i forhold til de 5 min iblødsætning varighed for en række blegemiddel koncentrationer (P &#60; 0,01, ANOVA). #angiver betydelige forskelle på 80% og 100% blegemiddel koncentrationer i forhold til 40% og 50% for en 20 min periode (P &#60; 0,01, ANOVA). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56587/56587fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56587/56587fig2.jpg"> 
Figur 2: virkningerne af klor gas koncentration og sterilisation tid på Arabidopsis Col-0 frø. (A) spiring sats og (B) skimmel niveau. Fejllinjer udgør middel ± SD fremstillet af 5 biologiske og 5 tekniske replications af eksperimentet. Betyder, at ikke deler et brev er signifikant forskellige (P &#60; 0,05, ANOVA). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56587/56587fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56587/56587fig3.jpg"> 
Figur 3: virkningerne af blegemiddel og klor gas sterilisation på frø med forskellige spiring potentielle. (A) spiring sats og (B) skimmel niveau. Linjerne 100 SALK T-DNA var inddelt i fem grupper ifølge deres spireevne potentielle som spiring i mangel af ethvert middel, sterilisation. Grupper baseret på spiring sats var som følger: gruppe 1 (0-20%), gruppe 2 (21-50%), gruppe 3 (51-70%), gruppe 4 (71-90%) og gruppe 5 (91-100%). Linjerne blev udvalgt tilfældigt og deres potentielle spiring afhænge ikke af genotype. Værdierne er middel ± SD fremstillet af tre uafhængige replications af eksperimentet. Bogstaver ("a", "ab", "c", etc.) over hver værdi angiver de statistiske grupperinger af kategori midler. Betyder, at ikke deler et brev er signifikant forskellige (P &#60; 0,05, ANOVA). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56587/56587fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">Sterilisation tid (min)</td>
			<td colspan="4">Blegemiddel koncentration (%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40</td>
			<td>50</td>
			<td>80</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>0,00%</td>
			<td>0,00%</td>
			<td>0,00%</td>
			<td>2.13%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td>0,00%</td>
			<td>0,00%</td>
			<td>0,00%</td>
			<td>0,00%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>0,00%</td>
			<td>0,50%</td>
			<td>0,00%</td>
			<td>0,36%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15</td>
			<td>0,00%</td>
			<td>0,00%</td>
			<td>0,00%</td>
			<td>0,68%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20</td>
			<td>0,19%</td>
			<td>0,28%</td>
			<td>0,00%</td>
			<td>0,00%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabel 1: Skimmel niveau af blegemiddel-steriliseret Col-0 frø.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Blegemiddel</td>
			<td>HCl</td>
			<td>Tid</td>
			<td rowspan="2">% Chlorgas (mol Cl2/mol samlede gas)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(mL)</td>
			<td>(mL)</td>
			<td>(h)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25</td>
			<td>1</td>
			<td>3</td>
			<td>2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100</td>
			<td>3</td>
			<td>1</td>
			<td>6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200</td>
			<td>9</td>
			<td>1</td>
			<td>16,5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200</td>
			<td>9</td>
			<td>3</td>
			<td>16,5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabel 2: Klor (Cl2) gas sterilisation behandlinger på Columbia vildtype frø ved hjælp af en 7 L beholder.
Supplerende tabel 1: Et regneark er programmeret til at udføre beregningen for forskellige mængder af container og % Cl2. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56587/Supplemental_Table _1.xlsx" target="_blank">Venligst klik her for at downloade denne fil.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds at JoVE.com

Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

Standardiseret metode til høj overførselshastighed Sterilisation af Arabidopsis frø

Formålet med denne undersøgelse var at fastslå virkningerne af blegemiddel og klor gas sterilisation på frø spiring af en vifte af Arabidopsis genotyper dyrkes på sterile medier. Optimeret sterilisation protokoller er blevet udviklet for at forhindre vækst af mikrobielle forureninger samtidig give tilfredsstillende frø overlevelse.

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of ...

Research

JoVE Journal

Biology

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

Ice-Cap: En metode til Voksende Arabidopsis Og tomatplanter i 96-brønds plader for High-Throughput genotypebestemmes

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

High-throughput krystallisering af membranproteiner Brug af Lipidic Bicelle Metode

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

En High-throughput Metode til måling af glomerulær filtrationshastighed i bevidst Mus

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Effektiv og hurtig Isolering af Debuterende embryoner fra<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Frø

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

High-throughput Titrering af luciferase-udtrykkende rekombinante vira

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Inddrivelse af voksne zebrafisk Hearts for high-throughput applikationer

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

High-throughput screening for kemiske modulatorer af post-transkriptionelt regulerede gener

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...