Name: standardized method for high-throughput sterilization of arabidopsis seeds
Uploaded: 2017-10-17T15:00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds at JoVE.com

Vi vil gjerne takke Gauri Datta for henne hjelp forberede experimental materialer. Vi er også takknemlige for Bettina Wittler og James Mann for den kritiske gjennomgangen av manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av NSF tilskudd DBI-1049341 og kalt MCB-1143813.

1. forberedelse 1 x Murashige og Skoog (MS) medium <ol><li>legge 4.31 g MS basale salt blanding, 10 g sukrose og 0,5 g 2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid (MES) til et beaker med 0,8 liter destillert vann og røre å oppløse. Kontrollere og justere pH til 5.7 med 1 M kaliumhydroksid (KOH). Legg destillert vann til å gjøre 1 L.</li>
	<li>Dele mediene i to 1 L flasker, 500 mL. Legge til 5 g av agar hver flaske. Holde løs.</li>
	<li>Autoclave for 20 min ved 121 ° C, 15 psi med magnetic røre bar i flasken.</li>
	<li>Etter autoklavering, plassere flaskene på en røre tallerken ved lav hastighet, og la MS mediet avkjøles til 45-50 ° C (inntil flasken kan holdes med bare hendene).</li>
	<li>Fra dette trinnet, utføre alle trinnene i sterile forhold i laminær strømning hette. Legge til 500 µL Gamborg &#39; s Vitamin løsning på hver flaske og rør i MS medium jevnt distribuere vitamin løsningen.</li>
	<li>Hell nok media i til å dekke ca halvparten av dybden på tallerkenen.</li>
	<li>Tillate platene avkjøles til romtemperatur i ca 1 time å tillate agar å størkne. 
	Merk: Hvis platene ikke skal brukes umiddelbart, pakk dem i plast og lagre på 4 ° C (kjøleskap temperatur). Dekket plater, bokser eller rør med befestet agar kan lagres i flere uker på 4 ° C i en lufttett beholder.</li>
</ol> 2. Sterilisering av Arabidopsis frø med blekemiddel <ol><li>forberede MS plater i henhold til § 1 i protokollen. Autoclave 100 mL destillert vann samtidig som MS Media. Bruk dette senere som skylle og suspendere frøene til hjelp i plating. 
	Merk: Hvis ønskelig, 0,8% agar blanding (w/v) (f.eks phytagar) også kan autoklaveres i dette trinnet. Agar blanding kan erstattes for destillert vann under plating (trinn 2.5.3.). Den ekstra viskositeten av agar blandingen gjør det enklere å plass frø på plate eller plante i rader eventuelt.</li>
	<li>Klar 50% (v/v) bleike løsning brukes til sterilisering frøene. For å fortynne blekemiddel, legge til 100 mL blekemiddel 100 mL destillert vann. Legge til 50 µL av mellom 20 vaskemiddel i den bleike løsningen. 
	Merk: Forberedt bleike løsning kan lagres i opptil en måned så lenge det er åpnet i sterile forhold.</li>
	<li>Aliquot 100 frø i en 1,5 mL microcentrifuge tube.</li>
	<li>Sterilisere frøene med en 50% bleike løsning.
	<ol><li>i laminær strømning hette, legge 500 µL av 50% blekemiddel løsningen til microcentrifuge røret som inneholder frø. Trykk på bunnen av røret for å suspendere frøene i den bleike løsningen. 
		Merk: Alternativt en rotator eller plattform shaker kan brukes til å holde frøene suspendert.</li>
	</ol></li> <li>Skyll den bleike løsningen fra tuben.
	<ol><li>Etter 10 min, fjerne den bleike løsningen fra microcentrifuge røret med en pipette eller en aspirator med en pipette spissen på slutten.</li>
		<li>Legge til 500 µL sterilt destillert vann til røret. Lukk røret og Inverter for å blande. Tillate frø å bosette til bunnen av røret. Når frø har avgjort til bunnen av røret nøye fjerne den bleike løsningen av pipettering. Gjenta dette skylling prosessen 6 ganger.</li>
		<li>Legge til 1 mL autoklaveres destillert vann til røret å suspendere frøene.</li>
	</ol></li> <li>Plate sterilisert frø på MS tallerkener.
	<ol><li>i laminær strømning hette, etikett nederst MS platen med lager navn og gjeldende dato.</li>
		<li>Hell frøene fra microcentrifuge røret på MS platen. Spre frøene rundt MS platen med en steril, bruke én inoculating loop eller et sterilt pipette tips. 
		Merk: Hvis frø bli sådd i rader, en pipette med 200 µL tips kan brukes individuelt plassere frø i ønsket plassering. For å forbedre flyten av frø, kan slutten av pipette spissen trimmes med 3-5 mm ved hjelp av saks. Noen feilplasserte frø eller klynger av frø kan deretter flyttes eller separert ved hjelp av en steril bruke én inoculating løkke.</li>
		<li>Plassere MS platen på den av laminær strømning hette med mettes halvparten. La overflødige vannet fordamper fra MS platen.</li>
		<li>Sett lokket på MS tallerkenen. Seal MS platen ved å pakke platen med mikroporøs papir kirurgisk tape (se Tabell av materialer).</li>
	</ol></li></ol> 3. Sterilisering av Arabidopsis frø med klorgass <ol><li>forberede MS plater i henhold til § 1 i protokollen. Autoclave 100 mL destillert vann samtidig som MS Media; Dette vil bli brukt senere å suspendere frøene til hjelp i plating. 
	Merk: Hvis ønskelig, 0,8% agar blanding (w/v) (f.eks phytagar) også kan autoklaveres i dette trinnet. Agar blanding kan erstattes for destillert vann under plating (trinn 3.6.2.). Den ekstra viskositeten av agar blandingen gjør det enklere å plass frø på plate eller plante i rader eventuelt.</li>
	<li>Før du starter sterilisering, beregne beløpene med blekemiddel og saltsyre (HCl) kreves for å produsere klorgass.
	<ol><li>Beregne mengden av HCl for å produsere 6.1% Cl 2 kreves for sterilisering.</li>
		<li>Bruker følgende formel: 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56587/56587eq1.jpg" /> 7000 mL volumet beholderen sterilisering og 6.1% Cl 2, volumet av HCl er beregnet til 3 mL. 
		Merk: Et regneark som er programmert til å utføre beregningen for ulike volumer beholder og % Cl 2 leveres som supplerende tabell 1.</li>
	</ol></li> <li>Aliquot 100 frøene i 0,5 mL microcentrifuge tube. Lukk dekslene for hvert hetteglass, plassere ampullene i en plast rack og avsette. 
	Merk: Frø kan lagres i lengre tid på dette punktet, så lenge de er lagret i riktig forhold. Lagringsforhold kan finnes i delen 3.3.2 protokollen av Rivero og kolleger 4. 96-brønns plate format kan også brukes.</li>
	<li>Forberede materialet nødvendig å utføre klor gass sterilisering.
	<ol><li>Få blekemiddel og HCl fra deres lagringssteder.</li>
		<li>Kuttet en stripe av store parafin film (se Tabell of Materials) til bruk i trinn 3.5.3. å forsegle sterilisering beholderen.</li>
		<li>Plasser plast beholderen med lokk som steriliseringsprosess finner sted i avtrekksvifte. Åpne caps på alle frø hetteglass og plasser hele frø stativet inne i plast beholderen.</li>
	</ol></li> <li>Utføre klor gass sterilisering ved romtemperatur. 
	Forsiktig: Arbeide med blekemiddel og syre separat. Ikke la en flaske uncapped for å redusere risikoen for utslipp. Bruke riktig personlig verneutstyr (PVU) inkludert hansker og en labfrakk. Hvis blekemiddel eller syre sprut på hansker, kan du endre hansker før håndtering av andre materialer. Alltid fjerne hansker i avtrekksvifte ved blekemiddel eller syre forurensning.
	<ol><li>Plasserer en 250 mL kanne inne i beholderen og legge til 100 mL blekemiddel. 
		Merk: Reaksjonen HCl og blekemidler krever minst 22 volumer overmål av blekemiddel. Reaksjonen vil forbruke HCl og bleke av slippe Cl 2 gass med natriumklorid (NaCl) og vann som biprodukter. Med en stor overskudd av blekemiddel kan forbruket av ekstra HCl during ventilasjonsåpningene perioden, som reduserer mengden av natriumbikarbonat (NaHCO 3) for å nøytralisere løsningen for avhending. 
		Forsiktig: Begeret bør være minst to ganger det totale flytende volumet av blekemiddel + HCl. Dette forhindrer sprut rømmer begeret under neste trinn som kan skade frø, bleke klær eller brenne eksponert hud.</li>
		<li>Legge til 3 mL HCl begeret med blekemiddel. 
		Advarsel: Den første reaksjonen vil produsere bobler, spesielt ved høyere enn 6.1% konsentrasjoner. En lang-sleeved lab coat er nødvendig for dette trinnet.</li>
		<li>Lukker beholderen sterilisering og forsegle den med parafin film umiddelbart.</li>
		<li>Overvåke beholderen sterilisering under sterilisering tid å sikre gass akkumulering, akkumulering av klorgass skal vises som en svak gul dis inne i beholderen. 
		Forsiktig: Jevnlig se sterilisering beholderen for å sikre at inne ikke har unseated lokket eller parafinen film. Hvis lokket har kommet unseated eller parafin filmen har løsnet, lukker dekslet og nøye wrap beholderen med et ekstra lag med parafin filmen.</li>
		<li>Etter 1 h-sterilisering periode, åpne beholderen ved å fjerne parafin filmen og åpne dekslet på et hjørne. Tillate beholderen å ventilere 3 h å fullføre reaksjonen og eliminere klorgass.</li>
		<li>Lukker caps på alle microcentrifuge rør i frø stativet. 
		Merk: Sterilisert frø kan lagres før tiden av plating så lenge de er lagret i tørr tilstand.</li>
		<li>Fjern frø stativet og plasser den i laminær strømning hette.</li>
		<li>Nøytraliserer klor gass reaksjon <ol><li>legge til 1,5 g NaHCO 3 pulver sakte til begeret inneholder blekemidler/HCl løsning og røre med glass stang å oppløse NaHCO 3 i løsning. Fortsett å legge til NaHCO 3 til karbondioksid (CO 2) gassboblene har stoppet danner. 
			Forsiktig: Legg sakte for å hindre sprut. Bruk passende PPE inkludert hansker og en labfrakk.</li>
			<li>Test pH av løsningen pH strimler eller en pH-meter. Legge til ekstra NaHCO 3 hvis behov til pH av løsningen er nøytral (pH 7.0). På dette punktet løsningen kan fjernet fra avtrekksvifte og avhendes i henhold til alle gjeldende disposisjon retningslinjer. 
			Advarsel: Hvis noen lukten er sett under disposisjon, deretter løsningen skal umiddelbart tilbake til avtrekksvifte.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Plate sterilisert frø på MS tallerkener.
	<ol><li>i laminær strømning hette, etikett nederst MS platen med lager navn og gjeldende dato.</li>
		<li>Legge til 500 µL sterilisert destillert vann til hver microcentrifuge tube å suspendere frøene. Hell frø på MS platen og spre frøene jevnt rundt tallerkenen med en steril, bruke én inoculating loop eller et sterilt pipette tips.</li>
		<li>Plassere MS platen på den av laminær strømning hette med mettes halvparten. La overflødige vannet fordamper fra MS platen.</li>
		<li>Sett lokket på MS tallerkenen. Forsegle MS platen ved å pakke platen med mikroporøs kirurgisk papirremse.</li>
	</ol></li></ol> 4. Veksten av Arabidopsis på MS plater <ol><li>Plasser platene med lokk på tre dager på 4 grader og luftfuktighet. 
	Merk: Denne prosessen kalles lagdeling og tjener til å synkronisere spiring personlige frø.</li>
	<li>Overføre platene til vekst miljøet.
	<ol><li>Vedlikeholde temperatur på 23 ° C og lysintensiteten på 120-150 µmol/m 2 s med 16 h lys / 8 h mørke fotoperiode. Plassere plater flatt i vokse miljøet med lokk på toppen slik at røttene vokse til medium.</li>
	</ol></li> <li>La seedlings på plater vokse i 8 dager. 
	Merk: En 8-dagers vekstperioden lar sent spirende frø til germinate. Platene kan være scoret tidligere enn 8 dager hvis alle har spirer.</li>
	<li>Score spiring satsene.
	<ol><li>Post antall frø som har spirer og som ikke har spirer. Beregne spiring prisen ved å dele antall frø som spirer av antall frø på tallerkenen. 
		Merk: Spiring telles når radicle har anslått utenfor frø jakke og de to cotyledons er synlige.</li>
		<li>Også telle antall frø av mold å fastslå effektiviteten av sterilisering.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Weigel, D., Glazebrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Arabidopsis: a laboratory manual. , (2002).</li><li>Koornneef, M., Meinke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+Arabidopsis+as+a+model+plant.">The development of Arabidopsis as a model plant.</a> Plant J. 61 (6), 909-921 (2010).</li><li>The Arabidopsis Genome Initiative. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=+Analysis+of+the+genome+sequence+of+the+flowering+plant+Arabidopsis+thaliana."> Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana.</a> Nature. 408 (6814), 796-815 (2000).</li><li>Rivero, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handling+Arabidopsis+plants:+growth,+preservation+of+seeds,+transformation,+and+genetic+crosses.">Handling Arabidopsis plants: growth, preservation of seeds, transformation, and genetic crosses.</a> Methods Mol Biol. 1062, 3-25 (2014).</li><li>Yamada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Empirical+analysis+of+transcriptional+activity+in+the+Arabidopsis+genome.">Empirical analysis of transcriptional activity in the Arabidopsis genome.</a> Science. 302 (5646), 842-846 (2003).</li><li>Alonso, J. M., Stepanova, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+transformation+with+large+bacterial+artificial+chromosomes.">Arabidopsis transformation with large bacterial artificial chromosomes.</a> Methods Mol Biol. 1062, 271-283 (2014).</li><li>Savage, L. J., Imre, K. M., Hall, D. A., Last, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+essential+Arabidopsis+nuclear+genes+encoding+plastid-targeted+proteins.">Analysis of essential Arabidopsis nuclear genes encoding plastid-targeted proteins.</a> PLoS One. 8 (9), e73291 (2013).</li><li>Podar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+growth+and+cultivation.">Plant growth and cultivation.</a> Methods Mol Biol. 953, 23-45 (2013).</li><li>Xu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+agar-plate+method+for+studying+root+growth+and+response+of+Arabidopsis+thaliana.">An improved agar-plate method for studying root growth and response of Arabidopsis thaliana.</a> Sci Rep. 3, 1273 (2013).</li><li>Clough, S. J., Bent, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Floral+dip:+a+simplified+method+for+Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana.">Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.</a> Plant J. 16, (1998).</li><li>Cederholm, H. M., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+sensitivities+to+phosphate+deprivation+suggest+that+RGF+peptides+play+disparate+roles+in+Arabidopsis+thaliana+root+development.">Distinct sensitivities to phosphate deprivation suggest that RGF peptides play disparate roles in Arabidopsis thaliana root development.</a> New Phytol. 207 (3), 683-691 (2015).</li><li>Ye, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+ovule+is+the+target+for+Agrobacterium+in+planta+vacuum+infiltration+transformation.">Arabidopsis ovule is the target for Agrobacterium in planta vacuum infiltration transformation.</a> Plant J. 19 (3), 249-257 (1999).</li><li>Kuromori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+collection+of+11+800+single-copy+Ds+transposon+insertion+lines+in+Arabidopsis.">A collection of 11 800 single-copy Ds transposon insertion lines in Arabidopsis.</a> Plant J. 37 (6), 897-905 (2004).</li><li>Fiers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+14-amino+acid+CLV3,+CLE19,+and+CLE40+peptides+trigger+consumption+of+the+root+meristem+in+Arabidopsis+through+a+CLAVATA2-dependent+pathway.">The 14-amino acid CLV3, CLE19, and CLE40 peptides trigger consumption of the root meristem in Arabidopsis through a CLAVATA2-dependent pathway.</a> Plant Cell. 17 (9), 2542-2553 (2005).</li><li>Stepanova, A. N., Alonso, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR-based+screening+for+insertional+mutants.">PCR-based screening for insertional mutants.</a> Methods Mol Biol. 323, 163-172 (2006).</li><li>O'Malley, R. C., Alonso, J. M., Kim, C. J., Leisse, T. J., Ecker, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+adapter+ligation-mediated+PCR+method+for+high-throughput+mapping+of+T-DNA+inserts+in+the+Arabidopsis+genome.">An adapter ligation-mediated PCR method for high-throughput mapping of T-DNA inserts in the Arabidopsis genome.</a> Nat Protoc. 2 (11), 2910-2917 (2007).</li><li>L&#243;pez-Ribera, I., Vicient, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+ultrasonication+to+increase+germination+rates+of+Arabidopsis+seeds.">Use of ultrasonication to increase germination rates of Arabidopsis seeds.</a> Plant Methods. 13 (31), (2017).</li></ol>

Forfatterne ikke avsløre.

Når økende Arabidopsis frø på sterilt media, må noen form for sterilisering brukes. Både blekemiddel og klor gass sterilisering behandlinger resultere i lignende spiring rate og mold vekst hemming. Verken steriliserings metode fører til en betydelig reduksjon i spiring sats for frø med høy spiring potensielle; bleach sterilisering anbefales imidlertid for linjer med lavere spiring potensial (20-70%), på grunn av lille, men ikke betydning, forbedring i spiring rate i forhold til gass-sterilisering (figur 3A).
Sterilisering av Arabidopsis frø med blekemiddel konsentrasjoner fra 40-100% for opptil 10 min gir tilfredsstillende spiring prosenter og effektiv mold undertrykkelse. Selv om blekemiddel konsentrasjoner mindre enn 40% gi tilstrekkelig sterilisering for de fleste frø mye, med en konsentrasjon av 40% eller høyere garanterer effektiv sterilisering med tungt forurenset frø masse. Det er viktig å ikke overskride 10 min sterilisering ved blekemiddel konsentrasjoner lik eller høyere enn 80% å unngå høy frø dødelighet og feil i frøplante utvikling.
Behandling av Arabidopsis frø med klor konsentrasjoner på 6,1% eller 16,5% 1 h resultat i høy spiring priser og tilstrekkelig mold eliminering. Lav klor gass konsentrasjon (2,1%) kan brukes med hell ved å øke varigheten av sterilisering 3t.
Når linjene må steriliseres, anbefales flytende sterilisering i en løsning av 50% blekemiddel i 10 min. For større antall linjer er gass-sterilisering med en gass konsentrasjon på 6,1% 1t et bedre alternativ siden mange linjer kan steriliseres raskt og enkelt med mindre manipulering.
Våre resultater gir standardiserte forholdene for sterilisering både stort antall frø av ulike genotyper og frøene med lavere spiring potensielle. Den eneste begrensningen for disse sterilisering teknikker er at de ikke kan brukes med frø med spiring priser mindre enn 20% på grunn av omfattende frø dødelighet. Alternative metoder, for eksempel sonication17, å øke spiring rate i fravær av sterilisering kan være nyttig i disse tilfellene.

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) er en førsteklasses modell organisme for grunnleggende anvendt forskning i anlegget biologi1,2,3. Mens standard betingelser for Arabidopsis vekst har vært godt etablert4, har effekten av frø sterilisering på frø levedyktighet ikke blitt grundig testet. Solid media i plater eller boksene er rutinemessig brukes til å muliggjøre vekst av Arabidopsis frøplanter for mange eksperimentelle programmer, som homozygous dødelige mutanter i en segregerende befolkning, observasjon av skyte og rot fenotyper på tidlig etapper, isolering av patogen-fri vev, samling av store mengder frøplante vev, transformants eller narkotika-resistente planter og evaluering spiring1,2,3,4 . Frø høstet fra planter dyrket i drivhus eller vekst kammer er noen ganger forurenset med mikroorganismer og støv. Vekst av Arabidopsis frøplanter på forskjellige medietyper sterilt krever forutgående frø sterilisering å fjerne mikrobiell forurensninger som sopp og bakterier på frø overflaten. Bruk av en effektiv frø sterilisering regime er avgjørende for en balanse mellom høy spiring, minimum forurensning og frodig plantevekst.
De to vanligste metodene brukes for Arabidopsis frø sterilisering er basert på kommersielle blekemiddel (flytende-fase) og klorgass (damp-fase). Ulike prosedyrer har vært ansatt både væske-fase sterilisering1,4,5,6,7,8,9 , 10 og damp-fase sterilisering av Arabidopsis frø8,10,11,12,13,14,15 ,16. Men mens disse prosedyrene er effektive i å oppnå frø sterilisering av utnyttet genotyper, er en detaljert analyse av effekten av ulike sterilisering behandlinger på frø av ulike genotyper ikke rapportert. Derfor er optimalisering av disse dampsterilisering nødvendig å definere betingelser som Effektiv sterilisering kombinert med høy spiring rate.
The Arabidopsis biologiske Resource Center (ABRC) ligger unikt til a) test frø levedyktigheten til en rekke ulike genotyper i samlingen og b) dra nytte av kvalitetskontroll prosedyrer brukes internt og som svar på tilbakemeldinger om frø spiring. Målene for eksperimenter presenteres her var å bestemme effekten av ulike sterilisering på frø spiring av et utvalg av Arabidopsis genotyper. Optimalisert dampsterilisering som resulterer i høy frø spiring priser samtidig opprettholde minimale patogen forurensning er presentert for både blekemiddel og klor gass-sterilisering.

standardized method for high-throughput sterilization of arabidopsis seeds

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) planter trenger ofte å dyrkes på sterilt media. Dette krever forutgående frø sterilisering å hindre vekst av mikrobielle forurensninger til stede på frø overflaten. Foreløpig er Arabidopsis frø sterilisert med to forskjellige sterilisering teknikkene i forhold som varierer noe mellom laboratorier og ikke er standardisert, ofte resulterer i bare delvis Effektiv sterilisering eller overdreven frø dødelighet. De fleste av disse metodene er heller ikke lett skalerbar til et stort antall frø linjer med ulike genotyper. Som teknologi for høy gjennomstrømming analyse av Arabidopsis fortsette å spre, blir standardisert teknikker for sterilisering stort antall frø av ulike genotyper avgjørende for å gjennomføre disse typer eksperimenter. Responsen av Arabidopsis linjer på to forskjellige sterilisering teknikker ble evaluert basert på frø spiring rate og nivået av frø forurensning med mikrober og andre patogener. Behandlinger inkludert ulike konsentrasjoner av sterilisering agenter og ganger eksponering, kombinert for å bestemme optimale forhold for Arabidopsis frø sterilisering. Optimalisert protokoller har blitt utviklet for to forskjellige sterilisering metoder: blekemiddel (flytende-fase) og (Cl2) klorgass (damp-fase), både som resulterer i høy frø spiring priser og minimal mikrobiell forurensning. Nytten av disse protokollene ble illustrert gjennom testing av både wild type og mutant frø med en rekke spiring potensialer. Våre resultater viser at frø kan være effektivt sterilisert bruke enten metoden uten overdreven frø dødelighet, selv om skadevirkninger sterilisering ble observert i frø med lavere enn optimalt spiring potensial. I tillegg ble en formel utviklet for å muliggjøre forskere bruke standardiserte klor gass sterilisering betingelsene lufttette beholdere av ulike størrelser. Protokollene beskrevet her tillate enkel, effektiv og rimelig frø sterilisering for en rekke Arabidopsis linjer.

Arabidopsis frø fra et åpent felt, drivhus eller vekst kammer er noen ganger forurenset av ulike mikroorganismer som sopp og bakterier1,4. Dermed kan spirende frø på sterilt medier være spesielt utfordrende på grunn av forurensning av platene, spesielt når frø tilførselen er begrenset. Optimalisert protokollen for både blekemiddel og klor gass-sterilisering, resultatene presenteres nedenfor, minimerer problemet og bevarer levedyktigheten til frø kreves for høy gjennomstrømming programmer.
Effekter av blekemiddel sterilisering på spiring Arabidopsis Col-0 frø
Bleach er den mest brukte agenten for frø sterilisering mange plantearter. Optimal konsentrasjon av sterilisering agent og eksponeringstid varierer mellom artene. Flere protokoller har vært ansatt med blekemiddel for sterilisering av Arabidopsis frø1,4,,5,,6,,7,,8,,9 , 10. fire ulike konsentrasjoner av blekemiddel med fem forskjellige eksponeringstid perioder ble testet og resultatene presenteres i figur 1. Behandlingene ble brukt til Columbia vill-type (Col-0) frø. Effekten av blekemiddel konsentrasjon på spiring Col-0 frø variert avhengig av sterilisering som demonstrert av en betydelig interaksjon mellom blekemiddel konsentrasjon og sterilisering (figur 1, P &#60; 0,001, ANOVA-analyse av varians).
Eksperimenter med sterilisering ganger mellom 5 og 10 min resulterte behandlinger med alle blekemiddel konsentrasjoner i like høy spiring rate av Col-0 frø (figur 1). Høy spiring priser ble også observert for husholdningenes blekemiddel konsentrasjoner av 40% og 50% for sterilisering tidene. Behandlinger med 80% og 100% blekemiddel for perioder lengre enn 10 min resulterte i en betydelig nedgang i spiring sett i forhold til kortere soaking ganger (P &#60; 0.01, ANOVA). Videre for både 80% og 100% blekemidler behandlinger for 20 min, spiring ble betydelig redusert i forhold til tilsvarende 40% og 50% blekemidler behandlinger (P &#60; 0,001, ANOVA).
Frø vises ulike nivåer av bleking og shriveling ved høy blekemiddel konsentrasjoner i 15 minutter eller lenger. I tillegg til relativt høy (opptil 32%) frø dødelighet, spirer frøene sterilisert i disse forholdene ofte viste vekst defekter, gjenspeiles i en feil av cotyledons og hypocotyls å brette og forlenge, resulterer i utviklingsmessige arrestasjon. De fleste behandlinger (14 av 20) var helt mold-fri, resulterer i generelle mold nivå gjennomsnittlig 0,21% ± 0.003 (tabell 1).
Behandling med 50% blekemiddel og soaking tiden 10 min ble valgt som beste sterilisering regimet fordi det kombinerte høy spiring prosent med god hemming av overflaten patogen vekst. Denne behandlingen ble valgt for å teste effekten av blekemiddel sterilisering på forskjellige mutant som beskrevet nedenfor.
Effekter klor gass sterilisering på spiring Col-0 frø
For å optimalisere klor gass sterilisering forhold, ble tre ulike konsentrasjoner av klorgass brukt til å sterilisere Col-0 frø for to perioder (tabell 2). Gass konsentrasjonen ble beregnet basert på volumet av konsentrert HCl og volumet av beholderen sterilisering hjelp av følgende ligning:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56587/56587eq2.jpg">
Denne formelen ble utledet ved hjelp av loven antar 12.3 M HCl, en temperatur på 23 ° C og standard lufttrykk av 101.3 kPa.
Effekten av klor gass konsentrasjon på spiring Col-0 frø ble vist avhengig av sterilisering som angitt av en betydelig interaksjon mellom tid og konsentrasjon faktorer (figur 2A, P &#60; 0.01, ANOVA) . Klor gass konsentrasjon hadde ingen signifikant effekt på spiring Col-0 frø underlegges 1t sterilisering. Med denne sterilisering tid, alle konsentrasjoner av klorgass forfremmet tilsvarende høye nivåer av spirende, over 85% (P &#62; 0,05, ANOVA). På den annen side, en 3 h lange sterilisering resulterte i en betydelig reduksjon i spiring satsen for den høyeste konsentrasjonen av klorgass, sammenlignet med de to lavere konsentrasjonene (P &#60; 0,05, ANOVA). Disse resultatene indikerer at behandlinger av Arabidopsis frø med noen av de testede klor konsentrasjonene 1t eller konsentrasjoner under 16,5% 3 h, er like effektive i å bevare frø levedyktighet siden spiring priser var alltid større enn 82%. Men var sterilisering frø for 3t med 16,5% gass skadelig for frø spiring.
Forekomsten av mold var også avhengig gass konsentrasjon og eksponeringstid. Muggvekst var effektivt hemmet med de relativt høye konsentrasjonene av 6.1% og 16,5% klorgass 1 h lang behandling og alle konsentrasjoner 3 h (figur 2B).
Basert på disse resultatene, ble behandling med en gass konsentrasjon på 6,1% 1t (tabell 2) valgt som den beste damp-fase sterilisering tilstanden å teste effekten av gass-sterilisering på forskjellige mutant, siden det kombinerte høy spiring rate ( 85%) med svært lavt nivå av mold forurensning (0,02%).
Effekter av blekemiddel og klor gass-sterilisering på frø med forskjellige spiring potensielle
Statistisk analyse viste at spiring svaret sterilisering metoder var avhengig av spiring potensialet i linjene (figur 3A, P &#60; 0.01, ANOVA). Verken blekemiddel eller klor gass-sterilisering redusert spiring antall frø med høy spiring potensielle (grupper 4 og 5). Verken behandling hadde en effekt på allerede lave spiring rate av gruppen med den laveste spiringpotensial (gruppe 1). Derimot klor gass sterilisering resulterte i en betydelig reduksjon av ca 12-18% (P &#60; 0.01, ANOVA) i spiring frø med middels spiring potensial (grupper 2 og 3). Bleach sterilisering også redusert spiring rate av 13% av gruppe 2, men det redusere ikke spiring frekvensen av gruppe 3. Selv om det var ingen signifikant forskjell i spiring rate mellom blekemiddel og klor gass behandlinger i noen spiring gruppe (figur 3A, P &#62; 0.442, ANOVA), frø sterilisert med blekemiddel har en litt høyere spiring rate enn gass-steriliseres frø i alle spiring grupper.
Sterilisering behandlinger betydelig endret (P &#60; 0,001, ANOVA) prosent av frø av mold (figur 3B). Begge klor gass og blekemidler sterilisering resulterte i mindre muggvekst (P &#60; 0,05, ANOVA) sammenlignet med ingen sterilisering. Det var ingen forskjell i mold nivå oppdaget mellom gass og blekemidler sterilisering i noen gruppe (figur 3B, P &#62; 0,4, ANOVA).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56587/56587fig1.jpg"> 
Figur 1: effekter av blekemiddel konsentrasjon og sterilisering på spiring Arabidopsis Col-0 frø. Verdiene er betyr ± SD fra 5 uavhengige replications av eksperimentet. * Angir betydelige forskjeller i forhold til 5 min soaking varigheten for en rekke blekemiddel konsentrasjoner (P &#60; 0.01, ANOVA). #indikerer betydelige forskjeller på 80% og 100% blekemiddel konsentrasjoner 40% og 50% for 20 min periode (P &#60; 0.01, ANOVA). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56587/56587fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56587/56587fig2.jpg"> 
Figur 2: effekter av klor gass konsentrasjon og sterilisering tid på Arabidopsis Col-0 frø. (A) spiring rate og (B) Mold nivå. Feilfelt representerer betyr ± SD 5 biologiske og 5 tekniske replications av eksperimentet. Betyr at ikke deler en bokstav er signifikant forskjellig (P &#60; 0,05, ANOVA). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56587/56587fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56587/56587fig3.jpg"> 
Figur 3: effekter av blekemiddel og klor gass-sterilisering på frø med forskjellige spiring potensielle. (A) spiring rate og (B) Mold nivå. 100 SALK T-DNA linjene ble klassifisert i fem grupper etter sin spiring potensielle definert som spiring rate i fravær av noen sterilisering agent. Grupper basert på spiring hastigheten var som følger: gruppe 1 (0-20%), gruppe 2 (21-50%), gruppe 3 (51-70%), gruppe 4 (71-90%) og gruppe 5 (91-100%). Linjene ble valgt tilfeldig og sin spiring potensielle avhengig ikke av genotype. Verdiene er betyr ± SD fra tre uavhengige replications av eksperimentet. Bokstaver ("a", "ab", "c", etc.) over hver verdi angir statistiske grupperingene kategori betyr. Betyr at ikke deler en bokstav er signifikant forskjellig (P &#60; 0,05, ANOVA). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56587/56587fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">Sterilisering tid (min)</td>
			<td colspan="4">Bleach konsentrasjon (%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40</td>
			<td>50</td>
			<td>80</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>0,00%</td>
			<td>0,00%</td>
			<td>0,00%</td>
			<td>2.13%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td>0,00%</td>
			<td>0,00%</td>
			<td>0,00%</td>
			<td>0,00%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>0,00%</td>
			<td>0,50%</td>
			<td>0,00%</td>
			<td>0,36%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15</td>
			<td>0,00%</td>
			<td>0,00%</td>
			<td>0,00%</td>
			<td>0,68%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20</td>
			<td>0,19%</td>
			<td>0.28%</td>
			<td>0,00%</td>
			<td>0,00%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabell 1: Mold nivå av blekemiddel-steriliseres Col-0 frø.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>HCl</td>
			<td>Tid</td>
			<td rowspan="2">% Klorgass (mol Cl2/mol totale gass)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(mL)</td>
			<td>(mL)</td>
			<td>(h)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25</td>
			<td>1</td>
			<td>3</td>
			<td>2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100</td>
			<td>3</td>
			<td>1</td>
			<td>6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200</td>
			<td>9</td>
			<td>1</td>
			<td>16,5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200</td>
			<td>9</td>
			<td>3</td>
			<td>16,5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabell 2: Klor (Cl2) gass sterilisering behandlinger på Columbia vill-type frø med en 7 L beholder.
Ekstra tabell 1: Et regneark som er programmert til å utføre beregningen for ulike volumer beholder og % Cl2. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56587/Supplemental_Table _1.xlsx" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds at JoVE.com

Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

Standardisert metode for høy gjennomstrømming sterilisering av Arabidopsis frø

Målet med denne studien var å bestemme effekten av blekemiddel og klor gass-sterilisering på frø spiring av et utvalg av Arabidopsis genotyper dyrket på sterilt media. Optimalisert sterilisering protokollene er utviklet for å hindre vekst av mikrobielle forurensninger samtidig som tilfredsstillende frø overlevelse.

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of ...

Research

JoVE Journal

Biology

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

Ice-Cap: A Method for voksende Arabidopsis Og tomatplanter i 96-brønn plater for høy gjennomstrømming Genotyping

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

High-throughput krystallisering av membran proteiner Bruke Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

En High-throughput metode for måling av glomerulær filteringsrate i Bevisste Mus

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Effektiv og Rapid Isolering av tidlig stadium embryo fra<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Frø

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Høy gjennomstrømming Titrering av Luciferase-uttrykke rekombinante virus

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Utvinning av Voksen sebrafisk Hearts for høy gjennomstrømming Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Høy gjennomstrømming Screening for kjemi modulatorer av Post-transcriptionally Regulerte Gener

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...