Name: standardized method for high-throughput sterilization of arabidopsis seeds
Uploaded: 2017-10-17T15:00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds at JoVE.com

Vi vill tacka Gauri Datta för hennes hjälp i förberedelserna experimentella material. Vi är också tacksamma att Bettina Wittler och James Mann för kritisk granskning av manuskriptet. Detta arbete stöds av NSF bidrag DBI-1049341 och MCB-1143813.

1. beredning av 1 x Murashige och Skoog (MS) medium <ol><li>lägga till 4,31 g MS basala salt blandning, 10 g sackaros och 0,5 g 2-(N-Morpholino) ethanesulfonic syra (MES) till en bägare som innehåller 0,8 liter destillerat vatten och rör att upplösa. Kontrollera och justera pH till 5,7 med 1 M kaliumhydroxid (KOH). Tillsätt destillerat vatten för att göra 1 L.</li>
	<li>Dela media i två 1 L flaskor, 500 mL vardera. Tillsätt 5 g agar till varje flaska. Hålla locket löst.</li>
	<li>Autoklav under 20 minuter vid 121 ° C, 15 psi med magnetiska rör bar i flaskan.</li>
	<li>Efter autoklavering, placera flaskorna på en uppståndelse tallrik vid låg hastighet, och tillåta MS mediet svalna till 45-50 ° C (tills flaskan kan hållas med händerna).</li>
	<li>Start från detta steg, utföra alla steg i sterila förhållanden i en LAF. Tillsätt 500 µL Gamborg &#39; s Vitamin lösning på varje flaska och rör MS mediet för att jämnt fördela vitamin lösningen.</li>
	<li>Häll tillräckligt media i plattor att täcka ungefär hälften av djupet av plattan.</li>
	<li>Låta plattorna svalna i rumstemperatur i ca 1 h att tillåta agar stelnar. 
	Obs: Om plattorna är inte skall användas omedelbart, Linda in dem i plast och förvaras vid 4 ° C (kylskåpstemperatur). Täckta plattor, lådor eller rör med stelnad agar kan lagras i flera veckor vid 4 ° C i en lufttät behållare.</li>
</ol> 2. Sterilisering av Arabidopsis frön med blekmedel <ol><li>Förbered MS plattor i enlighet med avsnitt 1 i protokollet. Autoklav 100 mL destillerat vatten samtidigt som MS Media. Använda detta senare på som sköljvattnet och att hjälpa avbryta frön till stöd i plätering. 
	Obs: Om så önskas, 0,8% agar blandning (w/v) (t.ex. phytagar) kan autoklaveras i det här steget. Destillerat vatten under plating kan ersätta agar blandningen (steg 2.5.3.). Extra viskositeten av agar blandning gör det lättare att utrymme frön på plattan eller växt i rader om nödvändigt.</li>
	<li>Förbereda 50% (v/v) blekmedel lösning som ska användas för sterilisering frön. För att späda ut blekmedel, tillsätt 100 mL av blekmedel till 100 mL destillerat vatten. Tillsätt 50 μl av Tween 20 tvättmedel till blekmedel lösning. 
	Obs: Beredda blekmedel lösning kan förvaras i upp till en månad så länge det bara öppnas i sterila förhållanden.</li>
	<li>Alikvotens 100 frön i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör.</li>
	<li>Sterilisera frön med en 50% blekmedel lösning.
	<ol><li>i en LAF, tillsätt 500 µL av 50% blekmedel lösning till mikrocentrifug röret som innehåller frön. Knacka på botten av röret att avbryta frön i blekmedel lösning. 
		Obs: Alternativt en rotator eller plattform shaker kan användas att hålla frön upphängd.</li>
	</ol></li> <li>Skölj blekmedel lösningen från röret.
	<ol><li>Efter 10 min, ta bort blekmedel lösningen från mikrocentrifug röret med en pipett eller en insugningsventil försedd med en pipettspetsen på slutet.</li>
		<li>Lägga till 500 µL sterilt destillerat vatten till röret. Nära röret och Invertera om du vill blanda. Låt fröna sedimentera till botten av röret. När fröna har slagit sig till botten av röret försiktigt ta bort blekmedel lösningen genom pipettering. Upprepa detta sköljning processen 6 gånger.</li>
		<li>Lägga till 1 mL Ånghärdad destillerat vatten i röret att avbryta fröna.</li>
	</ol></li> <li>Tallrik steriliserade frön på MS tallrikar.
	<ol><li>i en LAF, etikett längst ned på MS plattan med lager namn och dagens datum.</li>
		<li>Häll fröna från mikrocentrifug röret på MS plattan. Sprida frön runt MS plattan med hjälp av en steril, engångsbruk inoculating slinga eller en steril pipettspetsen. 
		Obs: Om frön ska sås i rader, en pipett med 200 µL spets kan användas individuellt Placera frön i önskade positioner. För att förbättra flödet av frön, kan slutet av pipettspetsen trimmas med 3-5 mm med sax. Felplacerade frön eller kluster av frön kan sedan flyttas eller separeras med hjälp av en steril engångsbruk inoculating loop.</li>
		<li>Placera MS plattan på baksidan av den av LAF med locket hälften stängt. Låt överflödigt vatten avdunsta från MS plattan.</li>
		<li>Placera locket på MS plattan. Seal MS plattan genom att Linda plattan med mikroporös papper kirurgisk tejp (se Tabell för material).</li>
	</ol></li></ol> 3. Sterilisering av Arabidopsis frö med klorgas <ol><li>Förbered MS plattor i enlighet med avsnitt 1 i protokollet. Autoklav 100 mL destillerat vatten samtidigt som MS Media; Detta kommer att användas senare för att upphäva fröna till stöd i plätering. 
	Obs: Om så önskas, 0,8% agar blandning (w/v) (t.ex. phytagar) kan autoklaveras i det här steget. Destillerat vatten under plating kan ersätta agar blandningen (steg 3.6.2.). Extra viskositeten av agar blandning gör det lättare att utrymme frön på plattan eller växt i rader om nödvändigt.</li>
	<li>Innan sterilisering, beräkna beloppen av blekmedel och saltsyra (HCl) krävs för att producera klorgas.
	<ol><li>Beräkna mängden HCl behövs för att producera den 6,1% Cl 2 krävs för sterilisering.</li>
		Använd följande formel för <li>: 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56587/56587eq1.jpg" /> med 7000 mL som volymen av behållaren sterilisering och 6,1% Cl 2; beräknas volymen av HCl till 3 mL. 
		Obs: Ett kalkylblad som programmeras att utföra beräkningen för olika volymer av behållaren och % Cl 2 tillhandahålls som kompletterande Tabell1.</li>
	</ol></li> <li>Alikvotens 100 frön i 0,5 mL mikrocentrifug rör. Stäng locken för varje injektionsflaska, placera injektionsflaskorna i en plast rack och avsätta. 
	Obs: Frön kan lagras under en längre tid på denna punkt så länge som de lagras under rätt förhållanden. Förvaring kan hittas i avsnitt 3.3.2 i protokollet av Rivero och kollegor 4. plattan med 96 brunnar formatet kan också användas.</li>
	<li>Förbereda material behövs för att utföra klor Gassterilisering.
	<ol><li>Få blekmedel och HCl från deras lagringsplatser.</li>
		<li>Klipp ut en remsa av stora paraffin filma (se Tabell för material) använda i steg 3.5.3. att täta behållaren sterilisering.</li>
		<li>Placera behållaren plast med lock där sterilisering sker inuti ett dragskåp. Öppna taken på alla utsäde injektionsflaskorna och placera hela seed racket i plast containern.</li>
	</ol></li> <li>Utföra klor Gassterilisering rumstemperatur. 
	Försiktighet: Arbeta med blekmedel och syra separat. Lämna inte antingen flaska icke-utjämnade för att minska risken för spill. Använd lämplig personlig skyddsutrustning (PPE) inklusive handskar och en labbrock. Om antingen lut eller syra stänk på handskar, ändra handskar innan hantering av andra material. Ta alltid bort handskar i dragskåp vid lut eller syra kontaminering.
	<ol><li>Placera en 250 mL bägare inuti behållaren och tillsätt 100 mL av blekmedel. 
		Obs: Reaktionen mellan HCl och blekmedel kräver minst 22 volymer överskott av blekmedel. Reaktionen kommer konsumera HCl och blekmedel genom att släppa Cl 2 gas med natriumklorid (NaCl) och vatten som biprodukter. Med hjälp av ett stort överskott av blekmedel kan förbrukningen av ytterligare HCl dnder perioden ventilation, vilket minskar mängden natrium bikarbonat (NaHCO 3) behövs för att neutralisera lösningen för bortskaffande. 
		Varning: Bägaren bör vara minst två gånger den totala vätskevolym bleach + HCl. Detta förhindrar stänk flyr bägaren under nästa steg, som kan skada frön, bleka kläder eller bränna exponerad hud.</li>
		<li>Tillsätts 3 mL HCl i den bägare som innehåller blekmedel. 
		Varning: Den första reaktionen kommer att producera bubblor, särskilt vid gas-koncentrationer som är högre än 6,1%. En långärmad labbrock är nödvändigt för det här steget.</li>
		<li>Stäng behållaren sterilisering och försegla det med paraffin film omedelbart.</li>
		<li>Övervaka behållaren sterilisering under sterilisering att säkerställa gas ackumulering, ansamling av klorgas bör vara synlig som en svag gul haze inuti behållaren. 
		Försiktighet: Kontrollera regelbundet sterilisering behållare för att säkerställa att trycket inte har unseated locket eller paraffin film. Om locket har kommit unseated eller paraffin filma har lossnat, Stäng locket och noggrant Linda behållaren med ytterligare ett lager paraffin filma.</li>
		<li>Efter den 1 h-sterilisering, öppna behållaren genom att ta bort paraffin filma och öppna locket på ena hörnet. Tillåta behållaren att ventilera för 3 h att slutföra reaktionen och eliminera klorgas.</li>
		<li>Stäng locken av alla de mikrocentrifugrör i utsäde racket. 
		Obs: Steriliserade frön kan lagras fram tidpunkten för plätering så länge de är lagrade i torrt skick.</li>
		<li>Ta bort utsäde racket och placera den i en LAF.</li>
		<li>Neutralisera klor gasar reaktion <ol><li>lägga till 1,5 g NaHCO 3 pulver långsamt i den bägare som innehåller blekmedel/HCl-lösning och rör om med en glasstav att upplösa den NaHCO 3 i lösningen. Fortsätt lägga till NaHCO 3 tills koldioxid (CO 2) gasbubblor har slutat bilda. 
			Försiktighet: Tillsätt långsamt för att förhindra stänk. Använd lämplig personlig skyddsutrustning inklusive handskar och en labbrock.</li>
			<li>Testa pH-värdet i lösningen med pH remsor eller en pH-mätare. Lägga till ytterligare NaHCO 3 om nödvändigt tills lösningens pH är neutralt (pH 7,0). På denna punkt lösningen kan tas bort från spiskåpa och bortskaffas enligt alla tillämpliga förfogande riktlinjer. 
			Försiktighet: Om någon lukt är märkt vid bortskaffande, sedan lösningen bör omedelbart återlämnas till spiskåpa.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Tallrik steriliserade frön på MS tallrikar.
	<ol><li>i en LAF, etikett längst ned på MS plattan med lager namn och dagens datum.</li>
		<li>Lägga till 500 µL av steriliserad destillerat vatten till varje mikrocentrifug rör att avbryta frön. Häll frön vidare till MS plattan och sprida fröna jämnt runt plattan med hjälp av en steril, engångsbruk inoculating slinga eller en steril pipettspetsen.</li>
		<li>Placera MS plattan på baksidan av den av LAF med locket hälften stängt. Låt överflödigt vatten avdunsta från MS plattan.</li>
		<li>Placera locket på MS plattan. Försegla MS plattan genom att Linda plattan med mikroporös kirurgisk papperstejp.</li>
	</ol></li></ol> 4. Tillväxten av Arabidopsis på MS tallrikar <ol><li>Placera plattorna med locket på i tre dagar vid 4 ° c och omgivande luftfuktighet. 
	Obs: Denna process kallas stratifiering och tjänar till att synkronisera groning av enskilda frön.</li>
	<li>Överföra plattorna till tillväxt miljön.
	<ol><li>Underhåll temperatur på 23 ° C och ljusintensitet på 120-150 µmol/m 2 s med 16 h / 8 h mörka fotoperiod. Placera tallrikar flat i växa miljön med locket på toppen så rötterna växer till medium.</li>
	</ol></li> <li>Låt plantorna på tallrikar växa i 8 dagar. 
	Obs: En 8 dag växtperiod tillåter sent groende frön att gro.. Plattor kan vara poängsätts tidigare än 8 dagar om alla frön har grott.</li>
	<li>Poäng de grobarhet priserna.
	<ol><li>Post antalet frön att grodda och som inte har grott. Beräkna grobarheten genom att dividera antalet frön som grott av det totala antalet frön på tallriken. 
		Obs: Grobarhet räknas när rotanlaget har projekterat utanför utsäde pälsen och två hjärtbladen är synliga.</li>
		<li>Också räkna antalet frön som drabbats av mögel att avgöra effektiviteten av sterilisering villkor.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Weigel, D., Glazebrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Arabidopsis: a laboratory manual. , (2002).</li><li>Koornneef, M., Meinke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+Arabidopsis+as+a+model+plant.">The development of Arabidopsis as a model plant.</a> Plant J. 61 (6), 909-921 (2010).</li><li>The Arabidopsis Genome Initiative. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=+Analysis+of+the+genome+sequence+of+the+flowering+plant+Arabidopsis+thaliana."> Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana.</a> Nature. 408 (6814), 796-815 (2000).</li><li>Rivero, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handling+Arabidopsis+plants:+growth,+preservation+of+seeds,+transformation,+and+genetic+crosses.">Handling Arabidopsis plants: growth, preservation of seeds, transformation, and genetic crosses.</a> Methods Mol Biol. 1062, 3-25 (2014).</li><li>Yamada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Empirical+analysis+of+transcriptional+activity+in+the+Arabidopsis+genome.">Empirical analysis of transcriptional activity in the Arabidopsis genome.</a> Science. 302 (5646), 842-846 (2003).</li><li>Alonso, J. M., Stepanova, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+transformation+with+large+bacterial+artificial+chromosomes.">Arabidopsis transformation with large bacterial artificial chromosomes.</a> Methods Mol Biol. 1062, 271-283 (2014).</li><li>Savage, L. J., Imre, K. M., Hall, D. A., Last, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+essential+Arabidopsis+nuclear+genes+encoding+plastid-targeted+proteins.">Analysis of essential Arabidopsis nuclear genes encoding plastid-targeted proteins.</a> PLoS One. 8 (9), e73291 (2013).</li><li>Podar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+growth+and+cultivation.">Plant growth and cultivation.</a> Methods Mol Biol. 953, 23-45 (2013).</li><li>Xu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+agar-plate+method+for+studying+root+growth+and+response+of+Arabidopsis+thaliana.">An improved agar-plate method for studying root growth and response of Arabidopsis thaliana.</a> Sci Rep. 3, 1273 (2013).</li><li>Clough, S. J., Bent, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Floral+dip:+a+simplified+method+for+Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana.">Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.</a> Plant J. 16, (1998).</li><li>Cederholm, H. M., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+sensitivities+to+phosphate+deprivation+suggest+that+RGF+peptides+play+disparate+roles+in+Arabidopsis+thaliana+root+development.">Distinct sensitivities to phosphate deprivation suggest that RGF peptides play disparate roles in Arabidopsis thaliana root development.</a> New Phytol. 207 (3), 683-691 (2015).</li><li>Ye, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+ovule+is+the+target+for+Agrobacterium+in+planta+vacuum+infiltration+transformation.">Arabidopsis ovule is the target for Agrobacterium in planta vacuum infiltration transformation.</a> Plant J. 19 (3), 249-257 (1999).</li><li>Kuromori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+collection+of+11+800+single-copy+Ds+transposon+insertion+lines+in+Arabidopsis.">A collection of 11 800 single-copy Ds transposon insertion lines in Arabidopsis.</a> Plant J. 37 (6), 897-905 (2004).</li><li>Fiers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+14-amino+acid+CLV3,+CLE19,+and+CLE40+peptides+trigger+consumption+of+the+root+meristem+in+Arabidopsis+through+a+CLAVATA2-dependent+pathway.">The 14-amino acid CLV3, CLE19, and CLE40 peptides trigger consumption of the root meristem in Arabidopsis through a CLAVATA2-dependent pathway.</a> Plant Cell. 17 (9), 2542-2553 (2005).</li><li>Stepanova, A. N., Alonso, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR-based+screening+for+insertional+mutants.">PCR-based screening for insertional mutants.</a> Methods Mol Biol. 323, 163-172 (2006).</li><li>O'Malley, R. C., Alonso, J. M., Kim, C. J., Leisse, T. J., Ecker, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+adapter+ligation-mediated+PCR+method+for+high-throughput+mapping+of+T-DNA+inserts+in+the+Arabidopsis+genome.">An adapter ligation-mediated PCR method for high-throughput mapping of T-DNA inserts in the Arabidopsis genome.</a> Nat Protoc. 2 (11), 2910-2917 (2007).</li><li>L&#243;pez-Ribera, I., Vicient, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+ultrasonication+to+increase+germination+rates+of+Arabidopsis+seeds.">Use of ultrasonication to increase germination rates of Arabidopsis seeds.</a> Plant Methods. 13 (31), (2017).</li></ol>

Författarna har något att avslöja.

När växer Arabidopsis frön på sterila media, måste någon form av sterilisering tillämpas. Både blekmedel och klor gas sterilisering behandlingar resultera i liknande grobarhet ränta och mögel tillväxthämning. Varken steriliseringsmetod orsakar en betydande minskning av grobarheten för frön med hög grobarhet potentiella; blekmedel sterilisering rekommenderas dock för rader med lägre grobarhet potential (20-70%), på grund av små, om än icke-betydande, grobarheten jämfört Gassterilisering (figur 3A).
Sterilisering Arabidopsis frön med blekmedel koncentrationer från 40-100% för upp till 10 min ger tillfredsställande grobarhet procentsatser och effektivt mögel dämpning. Även om blekmedel koncentrationer lägre än 40% ge adekvat sterilisering för de flesta utsädespartier, med en koncentration på 40% eller högre garantier effektiv sterilisering av även kraftigt förorenade utsädespartier. Det är viktigt att inte överskrida 10 min av sterilisering när du använder blekmedel koncentrationer lika med eller högre än 80% att undvika höga utsäde dödlighet och defekter i plantan utveckling.
Behandling av Arabidopsis frön med klor gaskoncentrationerna 6,1% eller 16,5% för 1 h resulterar i hög grobarhet priser och adekvat mögel eliminering. Låg klor gaskoncentrationen (2,1%) kan användas framgångsrikt genom att öka varaktigheten av sterilisering-3 h.
När några rader ska steriliseras, rekommenderas flytande sterilisering i en lösning av 50% blekmedel i 10 min. För ett större antal linjer är Gassterilisering med en gaskoncentration på 6,1% för 1 h ett bättre alternativ eftersom många rader kan steriliseras snabbt och enkelt med mindre manipulation.
Våra resultat ger standardiserade förhållanden för sterilisering både stort antal frön av olika genotyper och fröna med lägre grobarhet potentiella. Den enda begränsningen av dessa sterilisering tekniker är att de inte kan tillämpas på fröna med grobarhet priser mindre än 20 procent på grund av omfattande utsäde dödlighet. Alternativa metoder, exempelvis ultraljudsbehandling17, att öka grobarheten i avsaknad av sterilisering kan vara fördelaktigt i de fall.

Arabidopsis thaliana. (Arabidopsis) är prime modellorganism för grundforskning och tillämpad forskning i växten biologi1,2,3. Medan standardvillkor för Arabidopsis tillväxt har varit väl etablerade4, har effekten av utsäde sterilisering på utsäde livsduglighet inte noggrant testats. Solid media i plattor eller lådor används rutinmässigt att underlätta tillväxten av Arabidopsis plantor för många experimentella applikationer, såsom identifiering av homozygot dödliga mutanter i en segregerande befolkning, observation av skjuta och rot fenotyper tidigt stadier, isolering av patogenfria vävnad, insamling av stora mängder plantor vävnad, val av transformants eller resistenta växter och utvärdering av grobarhet1,2,3,4 . Frön skördas från växter som odlas i ett växthus eller tillväxt kammare är ibland förorenade med mikroorganismer och damm. Tillväxt av Arabidopsis plantor på olika typer av sterila media kräver föregående utsäde sterilisering att avlägsna mikrobiella föroreningar såsom svampar och bakterier som finns på utsäde ytan. Användning av en effektiv utsäde sterilisering regim är avgörande för en balans mellan hög grobarhet, minsta kontaminering och kraftig växttillväxt.
De två vanligaste metoderna som används för Arabidopsis utsäde sterilisering är baserade på kommersiella blekmedel (vätska-fas) och klorgas (ånga-fas). Olika förfaranden har varit anställd i både flytande-fas sterilisering1,4,5,6,7,8,9 , 10 och gasfasen sterilisering av Arabidopsis frön8,10,11,12,13,14,15 ,16. Dock har dessa förfaranden har varit effektiva i att åstadkomma utsäde sterilisering av de utnyttjade genotyperna, en detaljerad analys av effekten av olika sterilisering behandlingar på frön av olika genotyper inte rapporterats. Därför krävs optimering av dessa sterilisering procedurer för att definiera villkor där effektiv sterilisering kombineras med höga grobarheten.
The Arabidopsis biologiska Resource Center (ABRC) är unikt positionerat för att a) testa utsäde livskraften i en mängd olika genotyper i den samling och b) dra nytta av de förfaranden för kvalitetskontroll som tillämpas internt och i svar på feedback om frögroning. Målen med de experiment som presenteras här var att fastställa effekterna av olika sterilisering metoder på frögroning av ett utbud av Arabidopsis genotyper. Optimerad sterilisering procedurer som resulterar i höga fröet grobarhet priser samtidigt som minimal patogen kontaminering presenteras för både blekmedel och klor Gassterilisering.

standardized method for high-throughput sterilization of arabidopsis seeds

Arabidopsis thaliana. (Arabidopsis) plantor behöver ofta odlas på sterila media. Detta kräver föregående utsäde sterilisering att förhindra tillväxt av mikrobiella föroreningar finns på utsäde ytan. För närvarande är Arabidopsis frön steriliserade med två distinkta sterilisering tekniker under förhållanden som skiljer sig något mellan labs och har inte standardiserats, ofta resulterar i endast delvis effektiv sterilisering eller överdriven utsäde dödlighet. De flesta av dessa metoder är inte heller enkelt skalbar till ett stort antal seed linjer av olika genotyper. Teknik för hög genomströmning analys av Arabidopsis fortsätter att föröka sig, blir standardiserade tekniker för sterilisering stort antal frön av olika genotyper nödvändigt för att genomföra dessa typer av experiment. Svar på ett antal Arabidopsis rader två olika sterilisering metoder utvärderades baserat på utsäde grobarheten och av utsäde kontaminering med mikrober och andra patogener. Behandlingar ingår olika koncentrationer av sterilisering agenter och tider av exponering, kombineras för att fastställa optimala förhållanden för Arabidopsis utsäde sterilisering. Optimerade protokoll har tagits fram för två olika sterilisering metoder: blekmedel (vätska-fas) och (Cl2) klorgas (ånga-fas), båda som resulterar i höga fröet grobarhet priser och minimal mikrobiell kontamination. Nyttan av dessa protokoll illustrerades genom testning av både vildtyp och muterade frön med en rad grobarhet potentialer. Våra resultat visar att frön kan effektivt steriliseras med antingen metod utan överdriven utsäde dödlighet, även om skadliga effekter av sterilisering observerades för frön med lägre än optimal grobarhet potential. Dessutom utvecklades en ekvation för att ge forskarna möjlighet att tillämpa de standardiserade klor förhållandena för ångsterilisering av gas till lufttät behållare av olika storlekar. De protokoll som beskrivs här kan lätt, effektiv och billig utsäde sterilisering för ett stort antal Arabidopsis linjer.

Arabidopsis frön samlas in från ett öppet fält, växthus eller tillväxt kammare är ibland smittade av olika mikroorganismer som svampar och bakterier1,4. Således, groende frön på sterila media kan vara särskilt utmanande på grund av kontaminering av pläterar, särskilt när utsäde tillgången är begränsad. Optimerad protokollet för både blekmedel och klor Gassterilisering, vars resultat presenteras nedan, minimerar problemet och bevarar livskraften hos frön krävs för hög genomströmning ansökningar.
Effekter av blekmedel sterilisering på grobarhet Arabidopsis Col-0 frön
Bleach är det vanligaste medlet för utsäde sterilisering i många växtarter. Den optimala koncentrationen av sterilisering agenten och exponeringstiden varierar mellan arter. Ett antal protokoll har varit anställda använda blekmedel för sterilisering av Arabidopsis frön1,4,5,6,7,8,9 , 10. fyra olika koncentrationer av blekmedel med fem olika exponeringstid perioder testades och resultatet presenteras i figur 1. Behandlingarna som tillämpades på Columbia vildtyp (Col-0) frön. Effekten av blekmedel koncentration på grobarhet Col-0 frön varierade beroende på tidpunkten för sterilisering vilket framgår av en signifikant interaktion mellan blekmedel koncentration och tid för sterilisering (figur 1, P &#60; 0,001, ANOVA-variansanalys).
I experiment med sterilisering gånger mellan 5 och 10 min resulterade behandlingar med alla blekmedel koncentrationer i lika höga grobarheten Col-0 frön (figur 1). Hög grobarhet priser observerades också för hushållsblekmedel koncentrationer av 40% och 50% för alla sterilisering gånger. Behandlingar med 80% och 100% blekmedel för perioder som är längre än 10 min resulterat i en betydande minskning av grobarheten jämfört med de kortare blötläggning gånger (P &#60; 0,01, ANOVA). Dessutom för både 80% och 100% blekmedel behandlingar för 20 min, grobarhet var betydligt minskade jämfört med de motsvarande 40% och 50% blekmedel behandlingar (P &#60; 0,001, ANOVA).
Frön visas olika nivåer av blekning och shriveling när du använder hög blekmedel koncentrationer i 15 min eller längre. I tillägg till relativt hög (upp till 32%) utsäde dödlighet, grodda frön steriliseras i dessa villkor som ofta visade tillväxt defekter, återspeglas i ett misslyckande av hjärtbladen och hypocotyls att veckla upp och förlänga, vilket resulterar i developmental arrest. De flesta behandlingar (14 av 20) var helt mögel-fri, vilket resulterade i mögel nivå helhetsbedömningen 0,21% ± 0,003 (tabell 1).
En behandling med 50% blekmedel och blötläggning på 10 min valdes som den bästa sterilisering regimen eftersom det kombinerat hög grobarhet procentandel med bra hämning av surface patogen tillväxt. Denna behandling var utvald att testa effekten av blekmedel sterilisering på olika muterade linjer som beskrivs nedan.
Effekterna av klor Gassterilisering på grobarhet Col-0 frön
För att optimera förhållanden för ångsterilisering av klor-gas, användes tre olika koncentrationer av klorgas för att sterilisera Col-0 frön under två perioder (tabell 2). Gaskoncentrationen var beräknas baserat på volymen av koncentrerad HCl och volymen av sterilisering behållaren med hjälp av följande ekvation:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56587/56587eq2.jpg">
Denna ekvation beräknades genom att använda ideal gaslagen förutsatt 12.3 M HCl, en temperatur av 23 ° C och standard atmosfärstryck på 101,3 kPa.
Effekten av klor gaskoncentrationen på grobarhet Col-0 frön visade sig bero på tiden av sterilisering som indikeras av en signifikant interaktion mellan tiden och koncentration faktorer (figur 2A, P &#60; 0,01, ANOVA) . Klor gaskoncentrationen hade ingen signifikant effekt på grobarhet Col-0 frön utsätts för 1 h sterilisering. Med denna steriliseringstiden, alla koncentrationer av klorgas främjas likaså hög grobarhet, över 85% (P &#62; 0,05, ANOVA). Däremot, en 3 h långa sterilisering resulterade i en betydande minskning av grobarheten för den högsta koncentrationen av klorgas, jämfört med de två lägre koncentrationerna (P &#60; 0,05, ANOVA). Dessa resultat indikerar att behandlingar av Arabidopsis frön med någon av de testade klor koncentrationerna för 1 h eller gaskoncentration under 16,5% för 3 h, är lika effektiv i att bevara utsäde lönsamhet eftersom grobarhet priser var alltid större än 82%. Men var sterilisering fröer för 3 h med 16,5% gas skadligt för frögroning.
Förekomsten av mögel var också beroende av gaskoncentration och exponeringstid. Mögeltillväxt hämmades effektivt med de relativt höga koncentrationerna av 6,1% och 16,5% klorgas för 1 h långa behandling och med alla gaskoncentrationerna för 3 h (figur 2B).
Baserat på dessa resultat, valdes en behandling med en gaskoncentration på 6,1% för 1 h (tabell 2) som bästa gasfasen sterilisering skick att testa effekten av Gassterilisering på olika muterade linjer, eftersom det kombinerade hög grobarhet rate ( 85%) med mycket låg nivå av mögel kontaminering (0,02%).
Effekterna av lut och klor Gassterilisering på frön med olika grobarhet potentiella
Statistisk analys visade att den grobarhet Svaren till sterilisering metoder var beroende av grobarhet potential av raderna (figur 3A, P &#60; 0,01, ANOVA). Varken blekmedel eller klor Gassterilisering minskar grobarheten i fröna med hög grobarhet potentiella (grupperna 4 och 5). Varken behandlingen hade en effekt på de redan låga grobarheten i gruppen med den lägsta grobarhetenpotential (grupp 1). Däremot klor Gassterilisering resulterade i en betydande minskning av cirka 12-18% (P &#60; 0,01, ANOVA) i groning av frön med mellanliggande grobarhet potential (grupperna 2 och 3). Blekmedel sterilisering minskade också grobarheten med 13% i grupp 2, men det minska inte grobarheten i grupp 3. Även om det fanns ingen signifikant skillnad i grobarheten mellan lut och klor gas behandlingar i någon grobarhet grupp (figur 3A, P &#62; 0.442, ANOVA), frön steriliserad med blekmedel har en något högre grobarheten än gas-steriliseras frön i alla grobarhet grupper.
Sterilisering behandlingar signifikant (P &#60; 0,001, ANOVA) procent av frön som drabbats av mögel (figur 3B). Både klor gas och blekmedel sterilisering resulterade i mindre mögeltillväxt (P &#60; 0,05, ANOVA) jämfört med ingen sterilisering. Det fanns ingen skillnad i mögel nivå upptäcktes mellan gas- och blekmedel sterilisering i någon grupp (figur 3B, P &#62; 0.4, ANOVA).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56587/56587fig1.jpg"> 
Figur 1: effekter av blekmedel koncentration och sterilisering tid på grobarhet Arabidopsis Col-0 frön. Värden är medel ± SD erhållits från 5 oberoende replikationer av experimentet. * indikerar betydande skillnader i förhållande till de 5 minuters blötläggning varaktighet för en serie blekmedel koncentrationer (P &#60; 0,01, ANOVA). #visar signifikanta skillnader på 80% och 100% blekmedel koncentrationer i förhållande till 40% och 50% för en 20 min tidsperiod (P &#60; 0,01, ANOVA). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56587/56587fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56587/56587fig2.jpg"> 
Figur 2: effekterna av klor gasar koncentration och sterilisering tid på Arabidopsis Col-0 frön. (A) grobarheten och (B) mögel nivå. Felstaplar representera medel ± SD erhållits från 5 biologiska och 5 tekniska replikationer av experimentet. Innebär att inte delar ett brev är signifikant (P &#60; 0,05, ANOVA). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56587/56587fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56587/56587fig3.jpg"> 
Figur 3: effekterna av lut och klor Gassterilisering på frön med olika grobarhet potentiella. (A) grobarheten och (B) mögel nivå. De 100 SALK T-DNA-linjerna var delas in i fem grupper enligt deras potentiella grobarhet som definieras som grobarheten i avsaknad av någon sterilisering agent. Grupper baserat på grobarheten var följande: grupp 1 (0-20%), grupp 2 (21-50%), grupp 3 (51-70%), grupp 4 (71-90%) och grupp 5 (91-100%). Linjerna valdes slumpmässigt och sin grobarhet potentiella beror inte på genotyp. Värden är medel ± SD erhållits från tre oberoende replikationer av experimentet. Bokstäver (”a”, ”ab”, ”c”, etc.) över varje värde anger de statistiska groupingsna av kategori innebär. Innebär att inte delar ett brev är signifikant (P &#60; 0,05, ANOVA). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56587/56587fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">Sterilisering tid (min)</td>
			<td colspan="4">Blekmedel koncentration (%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40</td>
			<td>50</td>
			<td>80</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>0,00%</td>
			<td>0,00%</td>
			<td>0,00%</td>
			<td>2.13%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td>0,00%</td>
			<td>0,00%</td>
			<td>0,00%</td>
			<td>0,00%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>0,00%</td>
			<td>0,50%</td>
			<td>0,00%</td>
			<td>0,36%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15</td>
			<td>0,00%</td>
			<td>0,00%</td>
			<td>0,00%</td>
			<td>0,68%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20</td>
			<td>0,19%</td>
			<td>0,28%</td>
			<td>0,00%</td>
			<td>0,00%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabell 1: Mögel nivå av blekmedel-steriliseras Col-0 frön.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Blekmedel</td>
			<td>HCl</td>
			<td>Tid</td>
			<td rowspan="2">% Klorgas (mol Cl2/mol totala gas)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(mL)</td>
			<td>(mL)</td>
			<td>(h)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25</td>
			<td>1</td>
			<td>3</td>
			<td>2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100</td>
			<td>3</td>
			<td>1</td>
			<td>6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200</td>
			<td>9</td>
			<td>1</td>
			<td>16,5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200</td>
			<td>9</td>
			<td>3</td>
			<td>16,5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabell 2: Klor (Cl2) gas sterilisering behandlingar på Columbia vildtyp frön med en 7 L behållare.
Kompletterande tabell 1: Ett kalkylblad som programmeras att utföra beräkningen för olika volymer av behållaren och % Cl2. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56587/Supplemental_Table _1.xlsx" target="_blank">Vänligen klicka här för att hämta den här filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds at JoVE.com

Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

Standardiserad metod för High-throughput sterilisering av Arabidopsis frön

Syftet med denna studie var att fastställa effekterna av lut och klor Gassterilisering på frögroning av ett utbud av Arabidopsis genotyper odlas på sterila media. Optimerad sterilisering protokoll har utvecklats för att förhindra tillväxt av mikrobiella föroreningar samtidigt som den ger tillfredsställande utsäde överlevnad.

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of ...

Research

JoVE Journal

Biology

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

En hög genomströmning Metod för Zebrafish Spermier Frysförvaring och In Vitro Befruktning

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

En snabb hög kapacitet metod för kartläggning Ribonucleoproteins (RNPs) om mänskliga pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Med hög kapacitet försockringen analys för lignocellulosa

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

Ice-Cap: En metod för odling Arabidopsis Och tomatplantor i 96-brunnar för high-throughput Genotypning

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Hög genomströmning Kristallisering av membranproteiner Använda Lipidic Bicelle Metod

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

En hög genomströmning metod för mätning av glomerulär filtration Rate i medveten möss

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Effektiv och snabb isolering av tidigt stadium embryon från<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Frön

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Hög kapacitet Titrering av luciferas-uttryckande rekombinanta virus

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Återvinning av vuxna zebrafisk Hjärtan för hög genomströmning Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Hög kapacitet Screening för kemiska modulatorer av Post-transkription Reglerade Gener

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...