Name: a simple fluorescence-based reporter assay to identify cellular components required for ricin toxin a chain (rta) trafficking in yeast
Uploaded: 2017-12-15T15:00:00
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本研究の一部は親切 (SFB 1027, A6) ドイツ研究基金からの助成金によってサポートされています。

注: 一般的な実験的ワークフローの概要については、図 1に描かれています。
注意: RTA は人間にとって猛毒です。安全性研究室許可 S2 (バイオ セーフティ レベル 2 に相当) が必要です。全体の実験の間に手袋を着用してください。
1. 異種発現大腸菌の彼の付けられた RTA
<ol>
	<li>エシェリヒア属大腸菌細胞発現プラ...

<ol>
	<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding-competent+and+folding-defective+forms+of+ricin+A+chain+have+different+fates+after+retrotranslocation+from+the+endoplasmic+reticulum.">Folding-competent and folding-defective forms of ricin A chain have different fates after retrotranslocation from the endoplasmic reticulum.</a> Mol Biol Cell. 21 (15), 2543-2554 (2010).</li><li>Li, S., Spooner, R. A., Hampton, R. Y., Lord, J. M., Roberts, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosolic+entry+of+Shiga-like+toxin+a+chain+from+the+yeast+endoplasmic+reticulum+requires+catalytically+active+Hrd1p.">Cytosolic entry of Shiga-like toxin a chain from the yeast endoplasmic reticulum requires catalytically active Hrd1p.</a> PLoS One. 7 (7), e41119 (2012).</li><li>Moreau, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screens+identify+genes+required+for+Ricin+and+PE+intoxications.">Genome-wide RNAi screens identify genes required for Ricin and PE intoxications.</a> Dev Cell. 21 (2), 231-244 (2011).</li><li>Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fluorescent+toolbox+for+assessing+protein+location+and+function.">The fluorescent toolbox for assessing protein location and function.</a> Science. 312 (5771), 217-224 (2006).</li><li>Majoul, I. V., Bastiaens, P. I., Soling, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+of+an+external+Lys-Asp-Glu-Leu+(KDEL)+protein+from+the+plasma+membrane+to+the+endoplasmic+reticulum:+studies+with+cholera+toxin+in+Vero+cells.">Transport of an external Lys-Asp-Glu-Leu (KDEL) protein from the plasma membrane to the endoplasmic reticulum: studies with cholera toxin in Vero cells.</a> J Cell Biol. 133 (4), 777-789 (1996).</li><li>Becker, B., Schnoder, T., Schmitt, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+Reporter+Assay+to+Identify+Cellular+Components+of+Ricin+Toxin+A+Chain+Trafficking.">Yeast Reporter Assay to Identify Cellular Components of Ricin Toxin A Chain Trafficking.</a> Toxins (Basel). 8 (12), (2016).</li><li>Li, X. P., Baricevic, M., Saidasan, H., Tumer, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+depurination+is+not+sufficient+for+ricin-mediated+cell+death+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Ribosome depurination is not sufficient for ricin-mediated cell death in Saccharomyces cerevisiae.</a> Infect Immun. 75 (1), 417-428 (2007).</li><li>Lord, J. M., Roberts, L. M., Robertus, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ricin:+structure,+mode+of+action,+and+some+current+applications.">Ricin: structure, mode of action, and some current applications.</a> Faseb J. 8 (2), 201-208 (1994).</li><li>Becker, B., Schmitt, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adapting+yeast+as+model+to+study+ricin+toxin+a+uptake+and+trafficking.">Adapting yeast as model to study ricin toxin a uptake and trafficking.</a> Toxins (Basel). 3 (7), 834-847 (2011).</li><li>Seidman, C. E., Struhl, K., Sheen, J., Jessen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+plasmid+DNA+into+cells.">Introduction of plasmid DNA into cells.</a> Curr Protoc Mol Biol. , (2001).</li><li>Brunelle, J. L., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coomassie+blue+staining.">Coomassie blue staining.</a> Methods Enzymol. 541, 161-167 (2014).</li><li>Shapiro, A. L., Vinuela, E., Maizel, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+weight+estimation+of+polypeptide+chains+by+electrophoresis+in+SDS-polyacrylamide+gels.">Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels.</a> Biochem Biophys Res Commun. 28 (5), 815-820 (1967).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.+1979.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. 1979.</a> Biotechnology. 24, 145-149 (1992).</li><li>Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+intact+yeast+cells+treated+with+alkali+cations.">Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations.</a> J Bacteriol. 153 (1), 163-168 (1983).</li><li>Vitetta, E. S., Yen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+functional+properties+of+genetically+engineered+ricin+B+chain+lacking+galactose-binding+activity.">Expression and functional properties of genetically engineered ricin B chain lacking galactose-binding activity.</a> Biochim Biophys Acta. 1049 (2), 151-157 (1990).</li><li>Wales, R., Roberts, L. M., Lord, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addition+of+an+endoplasmic+reticulum+retrieval+sequence+to+ricin+A+chain+significantly+increases+its+cytotoxicity+to+mammalian+cells.">Addition of an endoplasmic reticulum retrieval sequence to ricin A chain significantly increases its cytotoxicity to mammalian cells.</a> J Biol Chem. 268 (32), 23986-23990 (1993).</li><li>Breslow, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+strategy+enabling+high-resolution+functional+analysis+of+the+yeast+genome.">A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome.</a> Nat Methods. 5 (8), 711-718 (2008).</li><li>Jablonowski, D., Schaffrath, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zymocin,+a+composite+chitinase+and+tRNase+killer+toxin+from+yeast.">Zymocin, a composite chitinase and tRNase killer toxin from yeast.</a> Biochem Soc Trans. 35 (Pt 6), 1533-1537 (2007).</li><li>Jablonowski, D., Schaffrath, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccharomyces+cerevisiae+RNA+polymerase+II+is+affected+by+Kluyveromyces+lactis+zymocin.">Saccharomyces cerevisiae RNA polymerase II is affected by Kluyveromyces lactis zymocin.</a> J Biol Chem. 277 (29), 26276-26280 (2002).</li><li>Jablonowski, D., Frohloff, F., Fichtner, L., Stark, M. J., Schaffrath, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kluyveromyces+lactis+zymocin+mode+of+action+is+linked+to+RNA+polymerase+II+function+via+Elongator.">Kluyveromyces lactis zymocin mode of action is linked to RNA polymerase II function via Elongator.</a> Mol Microbiol. 42 (4), 1095-1105 (2001).</li></ol>

上記プロトコルを実行すると、実験の成功を達成するために次の提案をお勧めします。
異種蛋白質の表現、1 mM の IPTG 濃度を超えないようにすることが重要です。IPTG 濃度 &#62; プロモーターによって誘導される RTA 式および毒素の収率を下げる鉛 1 mM を阻害します。さらに、封入体形成、非効率的な折りたたみ、毒素の不活性化を防ぐために 28 ° C 以上の高温で細胞を栽?...

細菌の生産する毒素によって感染症を患っている患者は、効率的な治療がまだ大きく不足しているので特に各社会医療システム、医療、金融負担が大きいを表しています。医学的に関連する A の複雑な中毒メカニズム、新たな治療戦略を開発する/コレラ毒素、志賀毒素、リシンなど B 毒素が完全に実装すべき新規の強力な試金に基づく分子レベルで理解する必要があります。
近年、いくつかの研究は A の分析を試みました酵母の放射性毒素など時間がかかり、コストがかかる方法を使用して哺乳類セル B 毒素輸送標識 siRNA ベースのスクリーニングと同様、1,2 /3をに近づきます。場合によっては、毒素が人身売買されている可視化体内蛍光顕微鏡による fluorophores が付いて、量子ドットや蛍光タンパク質4,5サブユニットを個々 の毒素の化学および/または遺伝的結合の後。残念ながら、そのような変更はしばしば毒素の不活性および/または変更の自然な特性に します。さまざまな科学的な質問の答えを直接別のエレガントな方法はlacZのルシフェラーゼなど蛍光タンパク質酵素レポーター系の使用 (例えばGFP やDiscosoma sp. 赤色けい光たんぱく質 (下流))。
本稿では、単純なプロトコルは、出芽酵母の細胞外応用 RTA の細胞内輸送に必要な細胞のコンポーネントを特定する説明します。それにより、GFP が続く ER インポート N ターミナル信号を含んでいる蛍光レポーター プラスミッドは GFP 蛍光性の放出後体内で RTA を介したタンパク質翻訳阻害を直接に測定するタンパク質生合成センサーとして機能します。翻訳6。RTA エンドサイトーシスおよび/または細胞内輸送が否定的 (または積極的に) 影響する野生型と比較して特定の酵母削除変異株の場合は GFP 蛍光発光6に増加 (または減少) を検出できます。
これまでのところ、酵母細胞における RTA 輸送の分析のすべてのメソッドは、RTA の小胞体-細胞質レトロ移行プロセスに制限されていました。このような人工的なシステム、ER インポート信号を含む RTA は自殺の表現型の1、7の結果誘導型プロモーターから表されます。リシンの B サブユニットの結合セル本稿に記載されている実験のセットアップで行方不明は同様にであり、したがって、完全に表さないリシン holotoxin 中毒8の自然状況、毒素トランスポート プラズマから膜小胞体、ゴルジ装置では、この新規アッセイで密接にまねることができます。興味深いことに、パイロット研究で得られた予備的な結果は、RTA 人身取引の経路がリシン holotoxin の中毒ルートに顕著な類似性を明らかにすることを示します。
要約すると、RTA エンドサイトーシスで選択した細胞蛋白質と酵母の人身売買の特定の役割を決定するこの方法を使用できます。さらに、この実験のセットアップは簡単に他のリボソームが出され、様々 な酵母や細菌種は、zymocin や志賀毒素などから分泌毒素を不活性化に適応する可能性があります。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bacterial and yeast strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E coli BL21 DE3(Gold)</td>
			<td>Aligent Technologies</td>
			<td>230130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. cerevisiae BY4742</td>
			<td>Euroscarf</td>
			<td>Y10000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. cerevisiae BY4742 deletion mutants</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>YSC1054</td>
			<td>whole collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids used in this protocol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET24a(+) (Novagen)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>69772-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET-RTA(His6)</td>
			<td>Becker et al. (2016)3</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymolyase 20T</td>
			<td>USBio</td>
			<td>Z1000.250</td>
			<td>lytic enzyme for cell wall removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth medium</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10855021</td>
			<td>15 g agar was added for plate production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YNB</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>DF0335-15-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4418-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast drop-out mix supplemts without leucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y1376-20G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>05040-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10197777001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-raffinose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83400-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-sorbitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1876-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-galactose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G0750-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11811031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6758-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3899.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAGE ruler prestained</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>26616</td>
			<td>protein ladder used for Western analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material for RTA purification, desalting and reader measurements</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer Ultrospec 2100 pro</td>
			<td>Amersham</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soniprep 150</td>
			<td>MSE</td>
			<td></td>
			<td>old model, other models available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroskan Ascent</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5210470</td>
			<td>old model, not available anymore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTAPurifier</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28406266</td>
			<td>Product is discontinued and replaced</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisTRAP HP column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5248-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTRAP desalting column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>11-0003-29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midisart sterile filter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>16534K</td>
			<td>0.2 &#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>660 nm assay kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>22660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>260860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies (optional)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tetra-His</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>34670</td>
			<td>primary antibody; 1:1,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse-HRP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9044-2ML</td>
			<td>secondary antibody, 1:10,000 dilution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple fluorescence-based reporter assay to identify cellular components required for ricin toxin a chain (rta) trafficking in yeast

細菌や植物 A/B 毒素は、真核細胞の細胞質内の細胞内ターゲットに到達し、最終的に殺す自然の人身売買経路を悪用します。このような A ・ B 毒素が酵素によって実行中の構成一般的に Asubunit (例えば、リシン毒素 (RTA))、1 つまたは複数のセルに特定のバインド毒素は細胞表面の受容器のために責任がある Bsubunit(s) をバインドします。方法の私達の現在の知識 A/B 毒素はエンドサイトーシスと細胞内タンパク質高等真核細胞での並べ替えのような基本的な細胞メカニズムを理解する助け細胞科学者を効率的に夢中にさせることができます。医療の観点から、患者に適切な治療ソリューションを見つける、最終的にがん治療のための治療毒素ベース アプリケーションの開発の主要な毒素の人身売買ルートを特定することが重要です同様に。
A のゲノム解析から B 毒素哺乳類細胞における人身売買は、時間がかかり、複雑で高価な A に関するいくつかの研究/酵母モデル生物酵母で B 毒素輸送が行われています。酵母と高等真核生物の細胞のより複雑な根本的な細胞プロセスであるにもかかわらず類似していると酵母で得られた非常に頻繁が哺乳類の状況に転送できます。
ここでは、酵母の RTA の細胞内輸送を分析するための高速かつ使いやすいレポーターアッセイをについて説明します。新しいアッセイの重要な利点は、細胞質に小胞体 (ER) から RTA レトロ-転だけを調査する機会が、むしろエンドサイトーシスと逆行性毒素細胞膜が輸送小胞体に。アッセイ生体内で翻訳後、RTA 毒性緑色蛍光タンパク質 (GFP) の蛍光性の放出を介しての間接測定ができる記者プラスミドを使用しています。RTA は、28 s rRNA depurination によって蛋白質の生合成の開始を効率的にできないため、この試金は、蛍光性の放出で、ホスト細胞タンパク質の同定を変化検出による細胞内の RTA 輸送に関わるでできます。

本稿で説明したプロトコルの一般的なワークフローについては、図 1、ほぼ成功した RTA 浄化と後続の GFP レポーター アッセイ実験のため単一の手順を要約します。プロトコルの個々 の手順の詳細な説明を見つけることが。図 2は、アフィニ ティー ・ クロマトグラフィー (図 2 a)、空のベクター コン?...

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A Simple Fluorescence-based Reporter Assay to Identify Cellular Components Required for Ricin Toxin A Chain RTA Trafficking in Yeast

リシン毒素チェーン (RTA) 酵母の人身売買に必要な細胞成分を識別するために簡単な蛍光レポーターの試金

原稿で人身売買に関与する植物毒素リシン (RTA) のサブユニットは細胞傷害性のプロセスを殺す細胞のコンポーネントを識別するために酵母を用いた蛍光レポーターの試金の使用について述べる。

Bacterial and plant A/B toxins exploit the natural trafficking pathways in eukaryotic cells to reach their intracellular target(s) in the cytosol and to ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Simple Fluorescence-based Reporter Assay to Identify Cellular Components Required for Ricin Toxin A Chain (RTA) Trafficking in Yeast

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