Name: differential effects of lipid-lowering drugs in modulating morphology of cholesterol particles
Uploaded: 2017-11-10T15:00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Differential Effects of Lipid-lowering Drugs in Modulating Morphology of Cholesterol Particles at JoVE.com

Dette arbejde blev finansieret af en Plaxgen forskning tilskud tildeles SM (PLX-1008). Vi takker Palo Alto Medical Research Foundation Research Institute for indsamling serumprøver fra åreforkalkning emner under IRB godkendelse.

1. forberedelse af fluorescerende-mærket kolesterol og Lipid-sænkende medicin Bemærk: lysstofrør-mærket kolesterol aggregater og statiner blev forberedt som beskrevet i vores tidligere artikel 21. se Tabel af materialer for detaljer af reagenser, imaging flow forskellige, kemi analysatorer og data analyse software, der anvendes i denne undersøgelse.
<ol><li>Solubilize fluorescerende-mærket frysetørrede kolesterol (1 mg, Ex / Em = 495 nm/507 nm) pulver i 1 mL 100% alkohol.</li>
	<li>Centrifugeres prøve for 3 min på 2,040 x g og bruge de supernatanter, der indeholder opløselige fluorescens-mærket kolesterol aggregater i plaque array assay.</li>
	<li>Til fremstilling af narkotika, individuelt solubilize pulver (2 mg) af simvastatin, lovastatin, atorvastatin, ezetimibe, og omega-3 fedtsyrer i 1 ml 100% alkohol.</li>
	<li>Efter centrifugering i 3 min. ved 2,040 x g, bruge de supernatanter, der indeholder stoffer i analysen.</li>
	<li>Ligeledes solubilize individuelt pulvere (2 mg) af fluvastatin, rosuvastatin, niacin, og fibrate i 1 mL deioniseret vand at gøre en stamopløsning af 2 mg/mL.</li>
	<li>Efter centrifugering i 3 min. ved 2,040 x g, bruge de supernatanter, der indeholder stoffer i plaque array assay.</li>
</ol> 2. Plaque Array Assay undersøgelse In Vitro kolesterol partikler dannes <ol><li>Brug kemi analysator-1 (se tabel af materialer) at oprette plaque array assay for kolesterol partikler dannelse. Udfør analysen i en rund bund, lav protein bindende 96-brønd plade ved hjælp af reagenser tilberedes i afdeling 1. Opretholde den endelige reaktion volumen i hver brønd på 200 µL og udføre alle assays i tre eksemplarer.
	<ol><li>Først, belastning 194.5 µL af phosphat bufferet saltvand (PBS) til hver brønd.</li>
		<li>Til hver godt tilføje 2,5 µL (5 µg) af hver lipid-sænkende drug opløsning og ryste plade for 30 s ved at placere det på kemi analysator-1 reaktion plade til ensartet Bland stoffet i løsning. Ingen stof er føjet til negative kontrolprøverne.</li>
		<li>Endelig tilføje 2 µL (2 µg) fluorescerende-mærket kolesterol samlede løsning til hver brønd og ryste plade for 30 s ved at placere det på kemi analysator-1 reaktion plade.</li>
		<li>Ruger plade på en lab shaker i 2 timer ved 37 ° C og 200 rpm.</li>
		<li>Efter inkubation, erhverve billeder af partikler af imaging flowcytometri.</li>
	</ol></li></ol> 3. Fange billeder af kolesterol partikler ved hjælp af Imaging Flow flowcytometri <ol><li>åben erhvervelse dataskabelon at indlæse indstillingerne korrekt instrument. Klik på &#34; fil &#34;, og vælg derefter &#34; åbne skabelon &#8230; &#34; og vælg skabelonfil.</li>
	<li>Klik &#34; Flush, lås, belastning &#34; at forberede instrument for prøven lastning.</li>
	<li>Når de &#34; indlæse prøve &#34; dialog boks åbnes, klik på &#34; OK &#34; at indlæse 50 µL af prøverne fra hver godt forberedt i afsnit 2 i de billeddiagnostiske flow Flowcytometret.</li>
	<li>Klik &#34; køre | Installationsprogrammet &#34; til at se partiklerne i det billeddiagnostiske område i realtid.</li>
	<li>Når partikler i det billeddiagnostiske område er i god fokus, klik &#34; køre | Erhverve &#34; at erhverve billeder af hvert objekt samtidigt i en høj overførselshastighed måde for mørkefelt (side scatter/SSC), lyse felt (BF), grønne fluorescens og gule fluorescens.</li>
	<li>Gentag trin 3.2-3.5 for at erhverve 5.000-10.000 partikler fra hver stikprøve.</li>
	<li>Analysere alle HUDLØS billedfiler ved hjælp af billede analyse software til bestemmelse af objektet fluorescens intensitet og morfologiske variationer.
	<ol><li>Klik på den &#34; værktøjer &#34; knappen øverst i billedet analyse software, og vælg derefter &#34; Data batchfiler &#34; fra drop-down menuen, som vil åbne de &#34; partier &#34; vindue.</li>
		<li>i de &#34; partier &#34; vindue, klik på den &#34; tilføje Batch &#34; knap, som vil åbne den &#34; definere en Batch &#34; vindue.</li>
		<li>i den &#34; definere en Batch &#34; vindue, klik på den &#34; tilføje filer &#34; knappen og vælg HUDLØS billedfiler, klik på den &#34; skabelon &#34; knappen og vælg den relevante data analyse skabelonfil, og vælg derefter &#34; OK &#34; og &#34; indsende partier &#34; til at begynde behandling og analyse af raw-billedfilerne.</li>
	</ol></li></ol> 4. Plaque Array Assay baseret evaluering af Lipid-sænkende stoffer effekt på renset kolesterol partikler <ol><li>som beskrevet i trin 2.1, udføre kolesterol partikler dannelse analyse ved hjælp af renset VLDL, LDL og HDL lipoproteiner/partikler. Udføre plaque array assay i en 96-brønd plade.
	<ol><li>Først, indlæse alle brønde med PBS, bruge en 200 µL endelige mængden for hver brønd.</li>
	</ol></li> <li>For negativ kontrol, tilføje 4 µg VLDL, LDL, eller HDL proteiner/partikler individuelt i hver godt uden narkotika og ryste plade for 30 s.
	<ol><li>For at undersøge effekten lipid-sænkende medicin, tilføje 4 µg VLDL, LDL, eller HDL proteiner/partikler individuelt til hver godt og ryste plade for 30 s.</li>
		<li>For wells tilføjet med 4 µg VLDL, LDL og HDL, tilføje 2,5 µL (5 µg) ezetimibe, lovastatin, simvastatin eller niacin løsning og ryste plade for 30 s ved at placere det i kemi analysator-1.</li>
		<li>Endelig tilføje 2 µL (2 µg) Fluorescens-mærket kolesterol samlede løsning til alle brønde og ryste plade for 30 s ved at placere det på kemi analysator-1 reaktion plade.</li>
	</ol></li> <li>Inkuberes plade i 2 timer i en lab shaker indstillet på 37 ° C og 200 rpm.</li>
	<li>Erhverve prøver ved hjælp af billedbehandling flowcytometri efter trin 3.1-3.5.</li>
	<li>Analysere HUDLØS billedfiler ved hjælp af billede analyse software som beskrevet i trin 3.7.</li>
	<li>i analyse skabelon, bruger følgende gating ordningen for identifikation af kolesterol partikler delpopulationer.
	<ol><li>På et plot af grønne kanal mættet pixel count (x-aksen) og mørkefelt kanal mættede pixeltal (y-aksen), afviser objekter med en eller flere mættede pixels i enten kanal.</li>
		<li>Plot objekter/partikler uden mættede pixel ved hjælp af grøn kanal intensitet (x-aksen) og SSC intensitet (y-aksen): objekter falder ind under en af tre regioner (VLDL, LDL, HDL) baseret på deres grønne kanal og SSC intensiteter. 
		Bemærk: Disse porte blev skabt på grundlag af data genereret fra kontrol eksperimenter udført ved hjælp af renset af VLDL, LDL og HDL af partikler/proteiner uden stoffet.</li>
	</ol></li> <li>For at bestemme den lipid-sænkende medicin effekt for hver prøve, beregne samlede lipoprotein partikler koncentrationer, som procentdelen af hver af de delpopulationer (VLDL, LDL, HDL) som beskrevet i trin 6.5.
	<ol><li>Beregn partiklen koncentrationer (partikler/mL) ved hjælp af følgende ligning: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56596/56596eq1.jpg" /> NOTE: The VLDL, LDL og HDL gating regioner i fluorescens dot-plot opdage ~ 80% af deres respektive delpopulationer, og de resterende ~ 20% af partiklerne overlapper med andre gating områder.</li>
	</ol></li></ol> 5. Måling af Lipid koncentrationer i serumprøver <ol><li>til bestemmelse af koncentrationer af LDL, HDL, kolesterol og triglycerider af kemi analysator-2, bruge serumprøver fra alder-matchede normal og dyslipidæmi emner.</li>
	<li>Definerer unormal koncentration af LDL, HDL, kolesterol og triglycerider baseret på deres koncentration identificeret ud over de øvre og nedre værdier i serumprøver.</li>
	<li>Følg normale reference værdi KommisDED af reagens producent: kolesterol (4-200 mg/dL), HDL (3.0-65 mg/dL), LDL (4-100 mg/dL) og triglycerider (9-200 mg/dL).</li>
	<li>Identificere serumprøver, der har en unormal værdi som enten under referenceværdien på lavere eller over referenceplanet, højere værdi for kolesterol og triglycerider, og bruge dem til screening i tilstedeværelse og fravær af lipid-sænkende stoffer.</li>
</ol> 6. Analysere effekten af narkotika på kolesterol partikler dannelse i serumprøver <ol><li>brug af kemi analysator-1 at oprette plaque array assay for kolesterol partikler dannelse i serumprøver. Udfør analysen i en rund bund, lav protein bindende 96-brønd plade. Bruge en endelig reaktion volumen af 200 µL/brønd og udføre alle assays i tre eksemplarer.</li>
	<li>Forberede pladen ved at indlæse reagenser i en trinvis måde.
	<ol><li>Forberede kontrolhullerne.</li>
		<li>Belastning 193 µL af PBS i hvert hul.</li>
		<li>Tilføje 2,5% (v/v) patientens serum (kun én serumprøven pr. brønd) og ryst plade for 30 s ved at placere det på kemi analysator reaktion plade.</li>
		<li>Tilføje 2 µL (2 µg) af fluorescens-mærket kolesterol samlet løsning i hver brønd og ryste plade for 30 s ved at placere det på en kemi analysator-1 reaktion plade.</li>
	</ol></li> <li>Forberede brønde med narkotika.
	<ol><li>Belastning 191 µL af PBS i hvert hul.</li>
		<li>Tilføje 2,5% (v/v) patientens serum (kun én serumprøven pr. brønd) og ryst plade for 30 s ved at placere det på en kemi analysator-1 reaktion plade.</li>
		<li>Tilføje 2 µL ezetimibe, lovastatin, simvastatin eller niacin løsning (4 µg) i alle pladens huller, undtagen negative kontrolhullerne. Tilføj kun ét stof pr. brønd og ryste plade for 30 s ved at placere det på en kemi analysator-1 reaktion plade.</li>
		<li>Tilføje 2 µL af fluorescens-mærket cholesterol samlede løsning (2 µg) i hver brønd og ryste plade for 30 s ved at placere det på kemi analysator-1 reaktion plade.</li>
	</ol></li> <li>Indlæse narkotika kun efter alle brønde (kontrol og stof-behandlede) har været fyldt med deres respektive serumprøver, og tilføje fluorescens-mærket kolesterol i slutningen af dette trin.</li>
	<li>Ruger plade i 2 timer i en lab shaker indstillet på 37 ° C og 200 rpm.</li>
	<li>Erhverve prøverne af imaging flow Flowcytometret følgende indstillinger beskrives i trin 3.1-3.6.</li>
	<li>Bruger billedet analyse software til batch-behandling alle image filer ved hjælp af den samme skabelon, som beskrevet i trin 3.7.
	<ol><li>Udføre en dataanalyse ved tegning gates på plottet, som beskrevet i trin 4.5 og 4.6.</li>
	</ol></li> <li>For at bestemme den lipid-sænkende drug effekt/reaktion (lav, moderat og høj) for hver prøve, beregne den samlede lipoprotein partikel koncentration samt procentdelen af den samlede partikler bestående af VLDL, LDL og HDL delpopulationer.</li>
	<li>Plot i VLDL, LDL og HDL befolkninger på et histogram af objektet &#39; s lysfelt billede, bredde fratrækkes længde (længde - bredde) og gate i enten kugleformede eller lineær regioner: objekter med (længde - bredde) &#8804; 2 µm falder ind under den kugleformede region til beregning af procentdelen af kugleformede og lineær formede partikler.</li>
	<li>Sammenlign procentdelen af kugleformede og lineær formet LDL og HDL kolesterol partikler identificeret for hvert serum prøve inkuberes med og uden hver enkelt drug. Blandt tredobbelt værdier opnået for hver serumprøven, acceptere procentdelen af kugleformede og lineær formet LDL og HDL partikler, der falder inden for SD ±2 interval for bestemmelse af narkotikamisbrug effekt.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Pahan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-lowering+drugs.">Lipid-lowering drugs.</a> Cell Mol Life Sci. 63, 1165-1178 (2006).</li><li>Laforest, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+low+high-density+lipoprotein+cholesterol+and+hypertriglyceridaemia+in+patients+treated+with+hypolipidaemic+drugs.">Prevalence of low high-density lipoprotein cholesterol and hypertriglyceridaemia in patients treated with hypolipidaemic drugs.</a> Arch Cardiovasc Dis. 102, 43-50 (2009).</li><li>Roberts, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preventing+and+arresting+coronary+atherosclerosis.">Preventing and arresting coronary atherosclerosis.</a> Am Heart J. 130, 580-600 (1995).</li><li>Goldstein, J. L., Brown, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+century+of+cholesterol+and+coronaries:+from+plaques+to+genes+to+statins.">A century of cholesterol and coronaries: from plaques to genes to statins.</a> Cell. 16, 161-172 (2015).</li><li>Drexel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statins,+fibrates,+nicotinic+acid,+cholesterol+absorption+inhibitors,+anion-exchange+resins,+omega-3+fatty+acids:+which+drugs+for+which+patients?.">Statins, fibrates, nicotinic acid, cholesterol absorption inhibitors, anion-exchange resins, omega-3 fatty acids: which drugs for which patients?.</a> Fundam Clin Pharmacol. 23, 687-692 (2009).</li><li>Camelia, S., Anca, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statins:+Mechanism+of+action+and+effects.">Statins: Mechanism of action and effects.</a> J.Cell.Mol.Med. 5, 378-387 (2001).</li><li>Schaefer, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparisons+of+effects+of+statins+(atorvastatin,+fluvastatin,+lovastatin,+pravastatin,+and+simvastatin)+on+fasting+and+postprandial+lipoproteins+in+patients+with+coronary+heart+disease+versus+control+subjects.">Comparisons of effects of statins (atorvastatin, fluvastatin, lovastatin, pravastatin, and simvastatin) on fasting and postprandial lipoproteins in patients with coronary heart disease versus control subjects.</a> Am J Cardiol. 93, 31-39 (2004).</li><li>Meyers, C. D., Kamanna, V. S., Kashyap, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niacin+therapy+in+atherosclerosis.">Niacin therapy in atherosclerosis.</a> Curr Opin in Lipid. 15, 659-665 (2004).</li><li>Phan, B. A., Dayspringm, T. D., Toth, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ezetimibe+therapy:+mechanism+of+action+and+clinical+update.">Ezetimibe therapy: mechanism of action and clinical update.</a> Vasc Health Risk Mana. 8, 415-427 (2012).</li><li>Leitersdorf, E., Fruchart, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+action+of+fibrates+on+lipid+and+lipoprotein+metabolism.">Mechanism of action of fibrates on lipid and lipoprotein metabolism.</a> Circulation. 98, 2088-2093 (1998).</li><li>Backes, J., Anzalone, D., Hilleman, D., Catini, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+relevance+of+omega-3+fatty+acids+in+the+management+of+hypertriglyceridemia.">The clinical relevance of omega-3 fatty acids in the management of hypertriglyceridemia.</a> Lipids Health Dis. 15, 118 (2016).</li><li>Davidson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Significance+of+Statin+Pleiotropic+Effects+Hypotheses+Versus+Evidence.">Clinical Significance of Statin Pleiotropic Effects Hypotheses Versus Evidence.</a> Circulation. 111, 2280-2281 (2005).</li><li>Chinetti-Gbaguidi, G., Fruchart, J. C., Staels, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pleiotropic+effects+of+fibrates.">Pleiotropic effects of fibrates.</a> Curr Atheroscler Rep. 7, 396-401 (2005).</li><li>McTaggart, F., Jones, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Statins+on+High-Density+Lipoproteins:+A+Potential+Contribution+to+Cardiovascular+Benefit+Effects+of+Statins+on+High-Density+Lipoproteins:+A+Potential+Contribution+to+Cardiovascular+Benefit.">Effects of Statins on High-Density Lipoproteins: A Potential Contribution to Cardiovascular Benefit Effects of Statins on High-Density Lipoproteins: A Potential Contribution to Cardiovascular Benefit.</a> CardiovascDrugs Ther. 22, 321-338 (2008).</li><li>Quehenberger, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Plasma+Lipidome.">The Human Plasma Lipidome.</a> N Engl J Med. 365, 1812-1823 (2011).</li><li>Lund-Katz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+responsible+for+the+compositional+heterogeneity+of+nascent+high+density+lipoprotein.">Mechanisms responsible for the compositional heterogeneity of nascent high density lipoprotein.</a> J. Biol Chem. 288, 23150-23160 (2013).</li><li>Krauss, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoprotein+subfractions+and+cardiovascular+disease+risk.">Lipoprotein subfractions and cardiovascular disease risk.</a> Curr Opin Lipidol. 21, 305-311 (2010).</li><li>Krauss, R. M., Burke, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multiple+subclasses+of+plasma+low+density+lipoproteins+in+normal+humans.">Identification of multiple subclasses of plasma low density lipoproteins in normal humans.</a> J Lipid Res. 23, 97-104 (1982).</li><li>Rosenson, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL+measures,+particle+heterogeneity,+proposed+nomenclature,+and+relation+to+atherosclerotic+cardiovascular+Events.">HDL measures, particle heterogeneity, proposed nomenclature, and relation to atherosclerotic cardiovascular Events.</a> Clinic Chemi. 57, 392-410 (2011).</li><li>Madasamy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plaque+array+method+and+proteomics-based+identification+of+biomarkers+from+Alzheimer's+disease+serum.">Plaque array method and proteomics-based identification of biomarkers from Alzheimer's disease serum.</a> Clin Chim Acta. 441, 79-85 (2015).</li><li>Madasamy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonenzymatic+Mechanism+of+Statins+in+Modulating+Cholesterol+Particles+Formation.">Nonenzymatic Mechanism of Statins in Modulating Cholesterol Particles Formation.</a> Am J Cardiol. 118, 1187-1191 (2016).</li><li>Peter, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+relevance+of+the+biochemical,+metabolic,+and+genetic+factors+that+influence+low-density+lipoprotein+heterogeneity.">Clinical relevance of the biochemical, metabolic, and genetic factors that influence low-density lipoprotein heterogeneity.</a> Am J Cardiol. 90, 30-47 (2002).</li><li>Weissglas-Volkov, D., Pajukanta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+causes+of+high+and+low+serum+HDL-cholesterol.">Genetic causes of high and low serum HDL-cholesterol.</a> J Lipid Res. 51, 2032-2057 (2010).</li><li>Abela, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+statins+on+cholesterol+crystallization+and+atherosclerotic+plaque+stabilization.">Effect of statins on cholesterol crystallization and atherosclerotic plaque stabilization.</a> Am J Cardiol. 107, 1710-1717 (2011).</li><li>Nidorf, S. M., Eikelboom, J. W., Thompson, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cholesterol+crystal-induced+inflammation+for+the+secondary+prevention+of+cardiovascular+disease.">Targeting cholesterol crystal-induced inflammation for the secondary prevention of cardiovascular disease.</a> Cardiovasc Pharmacol Ther. 19, 45-52 (2014).</li><li>Thacker, S. G., Zarzour, A., Chen, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+density+lipoprotein+reduces+inflammation+from+cholesterol+crystals+by+inhibiting+inflammasome+activation.">High density lipoprotein reduces inflammation from cholesterol crystals by inhibiting inflammasome activation.</a> Immunol. 149, 306-319 (2016).</li><li>Kim, S. H., Lee, E. S., Lee, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+coherent+anti-stokes+Raman+Spectroscopy+images+intact+atheromatous+lesions+and+concomitantly+identifies+distinct+chemical+profiles+of+atherosclerotic+lipids.">Multiplex coherent anti-stokes Raman Spectroscopy images intact atheromatous lesions and concomitantly identifies distinct chemical profiles of atherosclerotic lipids.</a> Circ Res. 106, 1332-1341 (2010).</li><li>Lim, R. S., Suhalim, J. L., Miyazaki-Anzai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+cholesterol+crystals+in+plaques+of+atherosclerotic+mice+using+hyperspectral+CARS+imaging.">Identification of cholesterol crystals in plaques of atherosclerotic mice using hyperspectral CARS imaging.</a> J Lipid Res. 52, 2177-2186 (2011).</li><li>Rothblat, G. H., Phillips, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+lipoprotein+heterogeneity+and+function+in+reverse+cholesterol+transport.">High-density lipoprotein heterogeneity and function in reverse cholesterol transport.</a> Curr Opin Lipidol. 21, 229-238 (2011).</li><li>Kontush, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL+particle+number+and+size+as+predictors+of+cardiovascular+disease.">HDL particle number and size as predictors of cardiovascular disease.</a> Front in Pharmacol. , (2015).</li><li>Karathanasis, S. K., Freeman, L. A., Gordon, S. M., Remaley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+changing+face+of+HDL+and+the+best+way+to+measure+it.">The changing face of HDL and the best way to measure it.</a> Clin. Chem. 63, 196-210 (2017).</li></ol>

Dr. Madasamy modtaget tilskud fra Plaxgen, Inc og har en konkurrerende økonomisk interesse. Andre forfattere har ingen konkurrerende finansielle interesser til at videregive.

I almindelighed, bestemmes distribution og funktionelle egenskaber af VLDL, LDL og HDL kolesterol partikler i blodcirkulationen hovedsagelig af metaboliske, genetiske, epidemiologiske, cellulære og plasma faktorer22,23. I den foreliggende undersøgelse, undersøge virkningerne af lipid-ændring narkotika i bufferen afslørede, at meget lipofile stoffer som ezetimibe, lovastatin, simvastatin og atorvastatin induceret en højere niveau kompleksitet på morfologi af kolesterol partikler i forhold til den lavere niveau effekt observeret med stærkt hydrofilt rosuvastatin og fluvastatin narkotika. Disse resultater er i god aftale med vores tidligere undersøgelse beskriver en ikke-enzymatisk mekanisme baseret effekt af statiner i modulerende LDL og HDL kolesterol partikler dannelse i buffer og serum prøver21. I overensstemmelse hermed, resultaterne fra nærværende undersøgelse åbenbaret en ikke-enzymatiske virkningsmekanisme af ezetimibe, niacin, fibrate, og omega-3 fedtsyre lægemidler, der kan spille en direkte rolle i modulerende kolesterol partikler dannelse. Det er muligt, at samspillet mellem medicin og kolesterol aggregater fører til samling af store størrelse kolesterol partikler, der er 2-60 µm2, udstiller kugleformede og lineær strand morfologier.
Desuden foreslå resultaterne ved hjælp af renset lipoprotein partikler interaktioner mellem kolesterol aggregater og plasma faktorer herunder VLDL, LDL og HDL proteiner, der kan ændre kompositioner og morfologiske egenskaber af kolesterol partikler. Stof behandlingsresultater der involverer renset lipoprotein partikler viste et højere niveau stof effekt på VLDL partikler dannelse i forhold til deres effekt observeret på LDL kolesterol partikler dannelse. Lovastatin og simvastatin ezetimibe narkotika blev brugt som pro-stoffer og deres doser i assays kan være højere end de fysiologiske koncentrationer.
Interessant, formet screening af serumprøver viste variationer af narkotikamisbrug effekt på at ændre profiler af VLDL, LDL og HDL kolesterol partikler dannelse, især deres indvirkning på formationer af lineære LDL og HDL partikler. Disse stoffer induceret reduktion på lineære formet LDL og HDL kolesterol partikler dannelse i både dyslipidæmi og alder-matchede normale serumprøver. Narkotika effekter observeret på at reducere lineær formede partikler dannelse var højere i simvastatin, ezetimibe, lovastatin og niacin. Identifikation af kolesterol partikler med kugleformede og lineær strand morfologier i serumprøver normal og dyslipidæmi tyder på, at partikler med lignende morfologier kan danne i vivo betingelser. Tidligere undersøgelser har identificeret tilstedeværelsen af disken og nål-lignende kolesterol krystaller i de aterosklerotiske plaques af menneskelige og ApoE- /- og LDLR- / - mus modeller24,25,26 ,27,28.
HDL partikler cirkulerer i blodet findes som en heterogen blanding og niveauet af små og store størrelse HDL partikler sammen med funktionelle aktivitet er vigtige faktorer til at udøve deres cardio-beskyttende virkning via reverse kolesterol transport vej29,30. Nylige undersøgelser har fremhævet betydningen af at identificere HDL kolesterol partikel subfractions for belyse deres rolle i flere biologiske funktioner såsom cholesterol efflux, anti-betændelse, anti-trombotiske og anti-oxidative31 . Derudover har en række undersøgelser rapporteret effekten af lipid-sænkende behandling i stigende en lav til moderat niveau af HDL i plasma1,5,21. I overensstemmelse hermed, resultaterne fra denne undersøgelse giver ny indsigt om morfologiske træk af kolesterol partikler. Navnlig, påvisning af en højere grad af lineære formet HDL kolesterol partikler i serumprøver af dyslipidæmi fag tyder på, at de kan være den pålidelige biomarkør for både diagnose og evaluere virkningerne af lipid-ændring narkotika i patienter. Imidlertid yderligere er undersøgelse påkrævet ved brug af store klinisk prøver til bedre for at forstå kolesterol partiklerne med forskellige morfologier og deres tilknytning til CVD.
I plaque array analyse for at undersøge effekten stof på montering af kolesterol partikler, vi brugte 2 µg af fluorescens mærket kolesterol aggregater og 5 µgof hver enkelt drug fordi: (1) stoffer konkurrencedygtige binde til begge fluorescens mærket kolesterol og endogene lipider i serumprøver; (2) fra hver prøve erhvervet vi 5.000 til 10.000 kolesterol partikler, der er samlet i store størrelser og former fra ~ 2-60 µ2; (3) vi observeret en bred variationer af narkotika svar blandt serumprøver inkuberes med narkotika (doser 300 ng til 5 µg) og ~ 1-5% af dem inkuberes med høje doser viste ingen påviselige ændringer i profilen for kolesterol partikler dannelse; og (4) samspillet mellem kolesterol aggregater og lipid-sænkende stoffer er medieret af en ikke-enzymatisk proces. Koncentrationerne af de reagenser, der anvendes i analysen kan derfor være højere end deres fysiologiske niveau.
Afslutningsvis har vi med succes demonstreret fordele ved en in vitro- imaging metoden i denne undersøgelse til bestemmelse af effekten af et bredt spektrum af lipid-sænkende stoffer på modulerende morfologi og sammensætning af kolesterol partikler. Visualisere og kvantificere morfologi af lipid partikler ved at ansætte en konstellation af billede analyse algoritmer fremgangsmåde kan hjælpe både diagnosen af åreforkalkning og evaluere resultaterne af lipid-sænkende behandling hos patienter.

Talrige kliniske undersøgelser har påvist gavnlige virkninger af lipid-sænkende medicin til at reducere plasmaniveauer af low-density lipoprotein (LDL) kolesterol og en lav til moderat niveau stigning i high-density lipoprotein (HDL) kolesterol, som forhindrer både primære og sekundære forekomster af åreforkalkning-relaterede negative kardiovaskulære hændelser1,2,3,4,5. Statiner, en gruppe af HMG-CoA reduktase enzym-hæmmere, blokere endogent kolesterol syntese i leveren, i tur fører til lavere cirkulerende niveauer af LDL kolesterol i blodet6,7. Ligeledes, den lipid sænkende effekt af niacin er medieret af sin direkte og noncompetitive hæmmer af hepatocyt diacylglycerol acyltransferase-2, en nøgle leverenzym involveret i triglycerid syntese8. Relativt, reducerer ezetimibe plasma niveau af LDL ved at begrænse absorption af eksogene kolesterol ved binding til Niemann-Pick C1-Like 1 (NPC1L1) protein beliggende i epitelceller af tyndtarmen9. Fenofibrate, en anden lipid-sænkende medicin, reducerer betydeligt plasmakoncentrationer af triglycerider og også moderat mindsker LDL kolesterol gennem Peroxisom proliferator-aktiverede receptorer vej10. Desuden er omega-3 fedtsyrer rapporteret at have anti-aterosklerotisk virkning på grund af dens evne til at sænke plasmaniveauer af LDL11.
Lipid-sænkende medicin, ud over deres primære virkning på at sænke LDL-kolesterol, har en række gavnlige pleiotrope effekter, herunder øge HDL-niveau, forbedrer endotel funktioner, reducere inflammation og hæmme trombocyttal sammenlægninger12,13,14. Men, den underliggende mekanisme af disse stoffer for at øge HDL kolesterol partikler og ændre deres strukturelle træk er ikke fuldt forstået. Da disse lægemidler er almindeligt ordineret til behandling af åreforkalkning-relaterede hjerte-kar-sygdomme (lidelser), er det vigtigt for yderligere at undersøge deres mulige roller i fastsættelsen af morfologiske træk og distribution af lipid partikler. Humant plasma lipidome består af cirka 600 forskellige lipider og 22 forskellige molekylære former af cholesterols, der er til stede i forskellige størrelser, former, tætheder og kompositioner15,16,17 . Analytiske metoder såsom ultra-centrifugering, NMR og gradient gelelektroforese bruges til at karakterisere LDL og HDL partikler og deres subfractions18,19. Anvendelsen af disse metoder er dog begrænset til undersøgelser med henblik på bestemmelse af virkningen af lægemidler i modulerende morfologi og samling af lipid partikler. Flow Flowcytometret baseret plaque array er en funktionel biokemiske assay udviklet til påvisning og visualisering af serum fremstillet lipid og amyloid plaque partikler20. Fordele ved in vitro- imaging metoden i denne undersøgelse aktiverer identifikation af lipid-modulerende medicin effekter i at ændre morfologi og fordeling af kolesterol partikler i buffer og serum prøver.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>TopFluor fluorescent cholesterol</td>
			<td>Avanti Polar lipids</td>
			<td></td>
			<td>store 100 &#181;l aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>simvastatin (pro-drug)</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td></td>
			<td>store 100 &#181;l aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lovastatin (pro-drug)</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td></td>
			<td>store 100 &#181;l aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rosuvastatin</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td></td>
			<td>store 100 &#181;l aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>atorvastatin</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td></td>
			<td>store 100 &#181;l aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluvastatin</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td></td>
			<td>store 100 &#181;l aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ezetimibe (pro-drug)</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td></td>
			<td>store 100 &#181;l aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Niacin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td></td>
			<td>store 100 &#181;l aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fibrate</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td></td>
			<td>store 100 &#181;l aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>omega-3 fatty acid</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td></td>
			<td>store 100 &#181;l aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>purified VLDL proteins/particles</td>
			<td>Lee Bio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>purified LDL proteins/particles</td>
			<td>Lee Bio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>purified HDL proteins/particles</td>
			<td>Lee Bio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human age-matched serum</td>
			<td>Dx Biosamples</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human atherosclerosis serum</td>
			<td>Bioserve</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human normal serum</td>
			<td>Stanford Blood center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDL measurement reagent pack</td>
			<td>Roche Diangostics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDL measurement reagent pack</td>
			<td>Roche Diangostics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total cholesterol measurment</td>
			<td>Roche Diangostics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microtitre plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triglycerides measrument</td>
			<td>Roche Diangostics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amnis Imaging Flow cytometer</td>
			<td>Amnis Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDEAS image analysing software</td>
			<td>Amnis Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemistry Analyzer-1, ChemWel 2902</td>
			<td>Awarness Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemistry Analyzer-2, Intergra 400</td>
			<td>Roche Diangostics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differential effects of lipid-lowering drugs in modulating morphology of cholesterol particles

Behandling af dyslipidæmi patienter med lipid-sænkende stoffer fører til en betydelig reduktion i low-density lipoprotein (LDL) niveau og et lavt til moderat niveau stigning i high-density lipoprotein (HDL) kolesterol i plasma. Dog er en mulig rolle for disse stoffer i at ændre morfologi og fordeling af kolesterol partikler dårligt forstået. Her beskriver vi in vitro- vurderingen af lipid-sænkende narkotika effekter i modulerende morfologiske træk af kolesterol partikler ved hjælp af metoden plaque array i kombination med imaging flowcytometri. Billede analyser af kolesterol partikler angivet at lovastatin, simvastatin, ezetimibe, og atorvastatin inducere dannelse af kugleformede og lineær strand-formede partikler, der henviser til, at niacin, fibrater, fluvastatin og rosuvastatin fremkalde den dannelsen af kun kugleformede-formet partikler. Næste, renset meget low-density lipoprotein (VLDL) og LDL partikler inkuberes med disse stoffer viste ændringer i kolesterol morfologi og image tekstur partikler delpopulationer. Derudover afslørede screening af 50 serumprøver tilstedeværelsen af en højere grad af lineære formet HDL kolesterol partikler i fag med dyslipidæmi (gennemsnit af 18,3%) i forhold til alder-matchede normal (gennemsnit af 11,1%) prøver. Vi bemærkede også betydelige variationer i lipid-sænkende narkotika virkninger på at reducere lineær formet LDL og HDL kolesterol partikler dannelse i serumprøver. Disse resultater viser, at lipid-sænkende medicin, ud over deres celle-medieret hypolipidemic effekter, direkte kan modulere morfologi af kolesterol partikler af en ikke-enzymatiske virkningsmekanisme. Resultaterne af disse resultater har potentiale til at informere diagnose af åreforkalkning og forudsige optimal lipid-sænkende behandling.

Watch this Scientific Journal Video about Differential Effects of Lipid-lowering Drugs in Modulating Morphology of Cholesterol Particles at JoVE.com

Differential Effects of Lipid-lowering Drugs in Modulating Morphology of Cholesterol Particles

Differential virkninger af Lipid-sænkende stoffer i modulerende morfologi af kolesterol partikler

Formålet med denne undersøgelse var at evaluere i vitro lipid-sænkende narkotika effekter i modulerende morfologi af kolesterol partikler. Sammenligning af lipid-sænkende stoffer viste variationer i deres virkning i modulerende de morfologiske træk af kolesterol partikler.

Treatment of dyslipidemia patients with lipid-lowering drugs leads to a significant reduction in low-density lipoproteins (LDL) level and a low to ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Medicine

Fundamentals

Chemistry of Life

SCIENTISTS IN ACTION

Cholesterol Efflux Assay

Cholesterol efflux Assay

Cholesterol content of cells must be maintained within the very tight limits, too much or too little cholesterol in a cell results in disruption of ...

A Methodological Approach to Non-invasive Assessments of Vascular Function and Morphology

En metodisk tilgang til ikke-invasive vurderinger af vaskulær funktion og morfologi

The endothelium is the innermost lining of the vasculature and is involved in the maintenance of vascular homeostasis.  Damage to the endothelium may ...

A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs

En humant glioblastom organotypisk skivekulturmodel til undersøgelse af tumorcellemigration og patientspecifikke virkninger af antiinvasive stoffer

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor ...

Assessing Specificity of Anticancer Drugs In Vitro

Assessing Specificity of Anticancer Drugs In Vitro

Vurdering Specificitet af Anticancer Drugs<em&gt; In vitro</em

A procedure for assessing specificity of anticancer drugs in vitro using cultures containing both tumor and non-tumor cells is demonstrated. The key ...

Use of Rabbit Eyes in Pharmacokinetic Studies of Intraocular Drugs

Anvendelse af kanin Eyes i farmakokinetiske studier af intraokulært Drugs

The intraocular route of drug administration enables the delivery of high concentrations of therapeutic drugs, while minimizing their systemic absorption. ...

Echocardiographic and Histological Examination of Cardiac Morphology in the Mouse

Ekkokardiografisk og histologisk undersøgelse af hjertets morfologi i mus

An increasing number of genetically modified mouse models has become available in recent years. Moreover, the number of pharmacological studies performed ...

Semi-automated Analysis of Mouse Skeletal Muscle Morphology and Fiber-type Composition

Semi-automatiseret analyse af musen skeletmuskulatur morfologi og Fiber-type sammensætning

For years, distinctions between skeletal muscle fiber types were best visualized by myosin-ATPase staining. More recently, immunohistochemical staining of ...

High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay

Høj overførselshastighed Nitrobenzoxadiazole-mærket Cholesterol Efflux Assay

Atherosclerosis leads to cardiovascular disease (CVD). It is still unclear whether cholesterol-HDL (cHDL) concentration plays a causal role in ...

A Minimally Invasive Method for Intratracheal Instillation of Drugs in Neonatal Rodents to Treat Lung Disease

En minimalt invasiv metode til intratracheal indånding af lægemidler hos neonatale gnavere til behandling af lungesygdom

Treatment of neonatal rodent with drugs instilled directly into the trachea could serve as a valuable tool to study the impact of a locally administered ...

Self-Administration of Drugs in Mouse Models of Feeding and Obesity

Selvadministration af lægemidler i musemodeller af fodring og fedme

Preclinical studies in mice often rely on invasive protocols, such as injections or oral gavage, to deliver drugs. These stressful routes of ...