Name: differential effects of lipid-lowering drugs in modulating morphology of cholesterol particles
Uploaded: 2017-11-10T15:00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Differential Effects of Lipid-lowering Drugs in Modulating Morphology of Cholesterol Particles at JoVE.com

Dette arbeidet ble finansiert av en Plaxgen forskning tilskudd tildeles SM (PLX-1008). Vi takker Palo Alto Medical Research Foundation Research Institute for innsamling serumprøver fra aterosklerose temaer under IRBS godkjenning.

1. forberedelse av fluorescerende-merket kolesterol og lipidsenkende legemidler Merk: fluorescerende-merket kolesterol aggregater og statiner var forberedt som beskrevet i vår forrige artikkel 21. kan du se Tabellen for materiale for detaljer om reagenser, imaging flyt cytometer og kjemi analyserer dataanalyse programvare brukt i denne studien.
<ol><li>Solubilize fluorescerende-merket lyofilisert kolesterol (1 mg, Ex / Em = 495 nm/507 nm) pulver i 1 mL av 100% alkohol.</li>
	<li>Sentrifuge utvalget for 3 min 2,040 x g og bruke supernatants som inneholder løselig fluorescens-merket kolesterol mengdefunksjoner i plakk array analysen.</li>
	<li>For utarbeidelse av narkotika, individuelt solubilize pulver (2 mg) av simvastatin, lovastatin, atorvastatin, ezetimibe og omega-3 fettsyrer i 1 ml av 100% alkohol.</li>
	<li>Etter sentrifugering for 3 min 2,040 x g, kan du bruke supernatants som inneholder narkotika i analysen.</li>
	<li>Tilsvarende solubilize individuelt pulver (2 mg) fluvastatin, rosuvastatin, niacin, og fibrate i 1 mL av deionisert vann for å lage en lagerløsning 2 mg/ml.</li>
	<li>Etter sentrifugering for 3 min 2,040 x g, kan du bruke supernatants som inneholder narkotika i plakk array analysen.</li>
</ol> 2. Plakk Array analysen for undersøke I Vitro kolesterol partikler formasjonen <ol><li>Bruk kjemi analyzer-1 (se tabell for materiale) til å definere plakk array analysen for kolesterol partikler formasjonen. Utføre analysen i en rund bunn, lav protein bindende 96-brønns tallerken med reagenser i del 1. Opprettholde siste reaksjon volumet i hver brønn på 200 µL og utføre alle analyser i tre eksemplarer.
	<ol><li>Første Last 194.5 µL av fosfat bufret saltvann (PBS) i hver brønn.</li>
		<li>Hver Vel, legge til 2,5 µL (5 µg) hver lipidsenkende narkotika løsning og riste platen i 30 s ved å plassere den på kjemi analyzer-1 reaksjon plate jevnt blande stoffet i løsning. Ingen stoffet legges til negativ kontroll eksemplene.</li>
		<li>Endelig legge 2 µL (2 µg) lysstoffrør-merket kolesterol samlet løsning i hver brønn og riste platen i 30 s ved å plassere den på kjemi analyzer-1 reaksjon plate.</li>
		<li>Ruge plate på en lab shaker 2 h satt på 37 ° C og 200 rpm.</li>
		<li>Etter inkubasjon skaffe bilder av partikler av imaging flowcytometri.</li>
	</ol></li></ol> 3. Fange bilder av kolesterol partikler bruke Imaging Flow cytometri <ol><li>Åpne oppkjøpet datamalen laste riktig instrument-innstillingene. Klikk &#34; filen &#34;, velg deretter &#34; åpne malen &#8230; &#34; og velg malfilen.</li>
	<li>Klikk &#34; Flush, lås, Last &#34; å forberede maskinen for eksempel lasting.</li>
	<li>Når den &#34; laste prøve &#34; dialogen åpnes, klikk &#34; OK &#34; laste 50 µL av prøvene fra hver godt forberedt i del 2 i tenkelig flyt cytometer.</li>
	<li>Klikk &#34; kjøre | Setup &#34; vise partikler i bildeområdet i sanntid.</li>
	<li>Når partikler i tenkelig området er i god fokus, klikker &#34; kjøre | Kjøpe &#34; hente bilder hvert objekt samtidig i en høy gjennomstrømming måte mørke felt (siden scatter/SSC), lysende felt (BF), grønn fluorescens og gule fluorescens.</li>
	<li>Gjenta trinn 3.2 3,5 å erverve 5000-10.000 partikler fra hver prøve.</li>
	<li>Analysere alle raw-bildefiler med bilde analyseprogramvare for å bestemme objektet fluorescens intensitet og morfologiske variasjoner.
	<ol><li>Klikk på &#34; verktøy &#34; på toppen av bildet analyseprogramvare, velg deretter &#34; satsvise datafiler &#34; fra det miste-ned menyen, som åpner den &#34; grupper &#34; vinduet.</li>
		<li>i den &#34; grupper &#34; vinduet klikker de &#34; legge Batch &#34; knappen, som åpner den &#34; definere satsvis &#34; vinduet.</li>
		<li>i den &#34; definere satsvis &#34; vinduet klikker den &#34; Legg til filer &#34;-knappen og velg raw-bildefilene, klikk den &#34; mal &#34; knappen og velger den riktige data analyse malfilen, deretter &#34; OK &#34; og &#34; sende grupper &#34; å starte behandling og analyse av raw-bildefilene.</li>
	</ol></li></ol> 4. Plakk Array analysen basert evaluering av lipidsenkende legemidler effekt på renset kolesterol partikler <ol><li>som beskrevet i trinn 2.1, utføre kolesterol partikler formasjon analysen bruker renset VLDL LDL og HDL lipoproteiner/partikler. Utføre plakk array analysen i en 96-brønns plate.
	<ol><li>Først laste alle brønner med PBS, bruke en 200 µL endelige volumet for hver brønn.</li>
	</ol></li> <li>For negativ kontroll, legge til 4 µg VLDL, LDL, eller HDL proteiner/partikler enkeltvis i hvert godt uten rusmidler og riste platen i 30 s.
	<ol><li>For å undersøke lipidsenkende narkotika effekten, legge til 4 µg VLDL, LDL, eller HDL proteiner/partikler individuelt til hver godt og riste platen i 30 s.</li>
		<li>Brønner lagt med 4 µg VLDL, LDL eller HDL, legge 2,5 µL (5 µg) ezetimibe, lovastatin, simvastatin eller niacin løsningen og riste platen i 30 s ved å plassere den i kjemi analyzer-1.</li>
		<li>Endelig legge 2 µL (2 µg) fluorescens-merket kolesterol samlet løsning alle brønner og riste platen i 30 s ved å plassere den på kjemi analyzer-1 reaksjon plate.</li>
	</ol></li> <li>Ruge platen i 2t i en lab shaker satt på 37 ° C og 200 rpm.</li>
	<li>Kjøpe eksemplene bruker tenkelig flowcytometri følge trinnene 3.1-3,5.</li>
	<li>Analysere raw-bildefiler med analyseprogramvare som beskrevet i trinn 3.7.</li>
	<li>i analysemalen bruke gating skjemaet for identifikasjon av kolesterol partikler subpopulasjoner.
	<ol><li>På en tomt på grønne kanalen mettet bildepunkter (x-aksen) og mørke felt kanal mettet bildepunkter (y-aksen), avvise objekter med én eller flere mettet piksler i enten kanal.</li>
		<li>Plot objekter/partiklene uten mettet bildepunkter med grønne kanalen intensitet (x-aksen) og SSC intensitet (y-aksen): objekter inndeles i tre regioner (VLDL, LDL, HDL) basert på deres grønne kanalen og SSC intensiteter. 
		Merk: Disse portene ble opprettet basert på data fra kontrollen eksperimenter utført med renset VLDL LDL og HDL partikler/proteiner uten stoffet.</li>
	</ol></li> <li>For å bestemme lipidsenkende narkotika effekt for hver prøve, beregne totale lipoprotein partikler konsentrasjonen, samt prosenten av hver subpopulation (VLDL, LDL, HDL) som beskrevet i trinn 6.5.
	<ol><li>Beregn partikkel konsentrasjoner (partikler/mL) ved hjelp av følgende ligning: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56596/56596eq1.jpg" /> Merk: The VLDL LDL og HDL gating regioner i fluorescens dot-plottet oppdage ~ 80% av sine respektive subpopulasjoner, og de resterende ~ 20% av partikler overlapper med andre gating.</li>
	</ol></li></ol> 5. Måling av Lipid konsentrasjoner i Serum-prøver <ol><li>For å bestemme konsentrasjonen av LDL, HDL, kolesterol og triglyserider av kjemi analyzer-2, bruke serumprøver fra alder-matchet normal og dyslipidemi fag.</li>
	<li>Definerer unormal konsentrasjon av LDL, HDL, kolesterol og triglyserider basert på deres konsentrasjon identifisert utover øvre og nedre referanseverdier i serumprøver.</li>
	<li>Følger normalt referanse verdi stortDed reagens produsenten: kolesterol (4-200 mg/dL), HDL (3.0-65 mg/dL), LDL (4-100 mg/dL) og triglyserider (9-200 mg/dL).</li>
	<li>Identifisere serumprøver som har en unormal verdi som enten under nedre referanseverdi eller over høyere referanse verdi for kolesterol og triglyserider, og bruke dem for screening i tilstedeværelse og fravær av lipidsenkende legemidler.</li>
</ol> 6. Analysere effekten av legemidler på kolesterol partikler formasjon i serumprøver <ol><li>Bruk kjemi analyzer-1 definere plakk array analysen for kolesterol partikler formasjonen i serumprøver. Utføre analysen i en rund bunn, lav protein bindende 96-brønns plate. Bruker et siste reaksjon på 200 µL/godt og utføre alle analyser i tre eksemplarer.</li>
	<li>Forbereder platen ved å laste reagenser på en gradvis måte.
	<ol><li>Forberede kontroll brønnene.</li>
		<li>Last 193 µL av PBS i hver brønn.</li>
		<li>Legge til 2,5% (v/v) pasienter serum (eneste serum eksempel per brønn) og riste platen i 30 s ved å plassere den på kjemi analyzer reaksjon plate.</li>
		<li>Legge 2 µL (2 µg) fluorescens-merket kolesterol samlet løsning i hver brønn og riste platen i 30 s ved å plassere den på en kjemi analyzer-1 reaksjon plate.</li>
	</ol></li> <li>Forberede brønnene med narkotika.
	<ol><li>Last 191 µL av PBS i hver brønn.</li>
		<li>Legge til 2,5% (v/v) pasienter serum (eneste serum eksempel per brønn) og riste platen i 30 s ved å plassere den på en kjemi analyzer-1 reaksjon plate.</li>
		<li>Legge 2 µL ezetimibe, lovastatin, simvastatin eller niacin løsning (4 µg) alle brønnene bortsett fra negativ kontroll brønnene. Legge til bare ett stoff per brønn og riste platen i 30 s ved å plassere den på en kjemi analyzer-1 reaksjon plate.</li>
		<li>Legge 2 µL av fluorescens-merket kolesterol samlet løsning (2 µg) i hver brønn og riste platen i 30 s ved å plassere den på kjemi analyzer-1 reaksjon plate.</li>
	</ol></li> <li>Laste narkotika etter alle brønner (kontrollere og narkotika-behandlet) lastet med sine respektive serumprøver, og legge til fluorescens-merket kolesterol på slutten av dette trinnet.</li>
	<li>Ruge platen i 2t i en lab shaker satt på 37 ° C og 200 rpm.</li>
	<li>Kjøpe prøvene av imaging flyt cytometer innstillinger beskrevet i trinnene 3.1-3.6.</li>
	<li>Bruke bildet analyse programvare for satsvis behandling alle bildefiler bruker samme mal som beskrevet i trinnene 3.7.
	<ol><li>Utføre dataanalyse ved portene på tomten som beskrevet i trinnene 4.5 og 4.6.</li>
	</ol></li> <li>For å bestemme lipidsenkende narkotika effekt/svaret (lav, middels og høy) for hver prøve, beregne totale lipoprotein partikkel konsentrasjonen, samt prosenten av de totale partiklene bestående av VLDL LDL og HDL subpopulasjoner.</li>
	<li>Plot VLDL LDL og HDL befolkningen på et histogram i objektet &#39; s lyse feltet bilde, bredde trukket fra lengde (Lengde - bredde) og gate i globular eller lineær regioner: objekter med (Lengde - bredde) &#8804; 2 µm faller inn i den globular regionen for å beregne prosentdelen av globular og lineære formet partikler.</li>
	<li>Sammenligner prosentdelen av globular og lineære formet LDL og HDL kolesterol partikler identifisert for hver serum prøve inkubert med og uten rusmiddel. Blant tre eksemplarer verdier hentet for hver serum prøve, godta prosentandelen av globular og lineær formet LDL og HDL partikler som faller innenfor SD ± 2 for fastsettelse av narkotika effekten.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Pahan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-lowering+drugs.">Lipid-lowering drugs.</a> Cell Mol Life Sci. 63, 1165-1178 (2006).</li><li>Laforest, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+low+high-density+lipoprotein+cholesterol+and+hypertriglyceridaemia+in+patients+treated+with+hypolipidaemic+drugs.">Prevalence of low high-density lipoprotein cholesterol and hypertriglyceridaemia in patients treated with hypolipidaemic drugs.</a> Arch Cardiovasc Dis. 102, 43-50 (2009).</li><li>Roberts, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preventing+and+arresting+coronary+atherosclerosis.">Preventing and arresting coronary atherosclerosis.</a> Am Heart J. 130, 580-600 (1995).</li><li>Goldstein, J. L., Brown, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+century+of+cholesterol+and+coronaries:+from+plaques+to+genes+to+statins.">A century of cholesterol and coronaries: from plaques to genes to statins.</a> Cell. 16, 161-172 (2015).</li><li>Drexel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statins,+fibrates,+nicotinic+acid,+cholesterol+absorption+inhibitors,+anion-exchange+resins,+omega-3+fatty+acids:+which+drugs+for+which+patients?.">Statins, fibrates, nicotinic acid, cholesterol absorption inhibitors, anion-exchange resins, omega-3 fatty acids: which drugs for which patients?.</a> Fundam Clin Pharmacol. 23, 687-692 (2009).</li><li>Camelia, S., Anca, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statins:+Mechanism+of+action+and+effects.">Statins: Mechanism of action and effects.</a> J.Cell.Mol.Med. 5, 378-387 (2001).</li><li>Schaefer, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparisons+of+effects+of+statins+(atorvastatin,+fluvastatin,+lovastatin,+pravastatin,+and+simvastatin)+on+fasting+and+postprandial+lipoproteins+in+patients+with+coronary+heart+disease+versus+control+subjects.">Comparisons of effects of statins (atorvastatin, fluvastatin, lovastatin, pravastatin, and simvastatin) on fasting and postprandial lipoproteins in patients with coronary heart disease versus control subjects.</a> Am J Cardiol. 93, 31-39 (2004).</li><li>Meyers, C. D., Kamanna, V. S., Kashyap, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niacin+therapy+in+atherosclerosis.">Niacin therapy in atherosclerosis.</a> Curr Opin in Lipid. 15, 659-665 (2004).</li><li>Phan, B. A., Dayspringm, T. D., Toth, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ezetimibe+therapy:+mechanism+of+action+and+clinical+update.">Ezetimibe therapy: mechanism of action and clinical update.</a> Vasc Health Risk Mana. 8, 415-427 (2012).</li><li>Leitersdorf, E., Fruchart, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+action+of+fibrates+on+lipid+and+lipoprotein+metabolism.">Mechanism of action of fibrates on lipid and lipoprotein metabolism.</a> Circulation. 98, 2088-2093 (1998).</li><li>Backes, J., Anzalone, D., Hilleman, D., Catini, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+relevance+of+omega-3+fatty+acids+in+the+management+of+hypertriglyceridemia.">The clinical relevance of omega-3 fatty acids in the management of hypertriglyceridemia.</a> Lipids Health Dis. 15, 118 (2016).</li><li>Davidson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Significance+of+Statin+Pleiotropic+Effects+Hypotheses+Versus+Evidence.">Clinical Significance of Statin Pleiotropic Effects Hypotheses Versus Evidence.</a> Circulation. 111, 2280-2281 (2005).</li><li>Chinetti-Gbaguidi, G., Fruchart, J. C., Staels, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pleiotropic+effects+of+fibrates.">Pleiotropic effects of fibrates.</a> Curr Atheroscler Rep. 7, 396-401 (2005).</li><li>McTaggart, F., Jones, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Statins+on+High-Density+Lipoproteins:+A+Potential+Contribution+to+Cardiovascular+Benefit+Effects+of+Statins+on+High-Density+Lipoproteins:+A+Potential+Contribution+to+Cardiovascular+Benefit.">Effects of Statins on High-Density Lipoproteins: A Potential Contribution to Cardiovascular Benefit Effects of Statins on High-Density Lipoproteins: A Potential Contribution to Cardiovascular Benefit.</a> CardiovascDrugs Ther. 22, 321-338 (2008).</li><li>Quehenberger, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Plasma+Lipidome.">The Human Plasma Lipidome.</a> N Engl J Med. 365, 1812-1823 (2011).</li><li>Lund-Katz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+responsible+for+the+compositional+heterogeneity+of+nascent+high+density+lipoprotein.">Mechanisms responsible for the compositional heterogeneity of nascent high density lipoprotein.</a> J. Biol Chem. 288, 23150-23160 (2013).</li><li>Krauss, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoprotein+subfractions+and+cardiovascular+disease+risk.">Lipoprotein subfractions and cardiovascular disease risk.</a> Curr Opin Lipidol. 21, 305-311 (2010).</li><li>Krauss, R. M., Burke, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multiple+subclasses+of+plasma+low+density+lipoproteins+in+normal+humans.">Identification of multiple subclasses of plasma low density lipoproteins in normal humans.</a> J Lipid Res. 23, 97-104 (1982).</li><li>Rosenson, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL+measures,+particle+heterogeneity,+proposed+nomenclature,+and+relation+to+atherosclerotic+cardiovascular+Events.">HDL measures, particle heterogeneity, proposed nomenclature, and relation to atherosclerotic cardiovascular Events.</a> Clinic Chemi. 57, 392-410 (2011).</li><li>Madasamy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plaque+array+method+and+proteomics-based+identification+of+biomarkers+from+Alzheimer's+disease+serum.">Plaque array method and proteomics-based identification of biomarkers from Alzheimer's disease serum.</a> Clin Chim Acta. 441, 79-85 (2015).</li><li>Madasamy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonenzymatic+Mechanism+of+Statins+in+Modulating+Cholesterol+Particles+Formation.">Nonenzymatic Mechanism of Statins in Modulating Cholesterol Particles Formation.</a> Am J Cardiol. 118, 1187-1191 (2016).</li><li>Peter, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+relevance+of+the+biochemical,+metabolic,+and+genetic+factors+that+influence+low-density+lipoprotein+heterogeneity.">Clinical relevance of the biochemical, metabolic, and genetic factors that influence low-density lipoprotein heterogeneity.</a> Am J Cardiol. 90, 30-47 (2002).</li><li>Weissglas-Volkov, D., Pajukanta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+causes+of+high+and+low+serum+HDL-cholesterol.">Genetic causes of high and low serum HDL-cholesterol.</a> J Lipid Res. 51, 2032-2057 (2010).</li><li>Abela, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+statins+on+cholesterol+crystallization+and+atherosclerotic+plaque+stabilization.">Effect of statins on cholesterol crystallization and atherosclerotic plaque stabilization.</a> Am J Cardiol. 107, 1710-1717 (2011).</li><li>Nidorf, S. M., Eikelboom, J. W., Thompson, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cholesterol+crystal-induced+inflammation+for+the+secondary+prevention+of+cardiovascular+disease.">Targeting cholesterol crystal-induced inflammation for the secondary prevention of cardiovascular disease.</a> Cardiovasc Pharmacol Ther. 19, 45-52 (2014).</li><li>Thacker, S. G., Zarzour, A., Chen, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+density+lipoprotein+reduces+inflammation+from+cholesterol+crystals+by+inhibiting+inflammasome+activation.">High density lipoprotein reduces inflammation from cholesterol crystals by inhibiting inflammasome activation.</a> Immunol. 149, 306-319 (2016).</li><li>Kim, S. H., Lee, E. S., Lee, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+coherent+anti-stokes+Raman+Spectroscopy+images+intact+atheromatous+lesions+and+concomitantly+identifies+distinct+chemical+profiles+of+atherosclerotic+lipids.">Multiplex coherent anti-stokes Raman Spectroscopy images intact atheromatous lesions and concomitantly identifies distinct chemical profiles of atherosclerotic lipids.</a> Circ Res. 106, 1332-1341 (2010).</li><li>Lim, R. S., Suhalim, J. L., Miyazaki-Anzai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+cholesterol+crystals+in+plaques+of+atherosclerotic+mice+using+hyperspectral+CARS+imaging.">Identification of cholesterol crystals in plaques of atherosclerotic mice using hyperspectral CARS imaging.</a> J Lipid Res. 52, 2177-2186 (2011).</li><li>Rothblat, G. H., Phillips, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+lipoprotein+heterogeneity+and+function+in+reverse+cholesterol+transport.">High-density lipoprotein heterogeneity and function in reverse cholesterol transport.</a> Curr Opin Lipidol. 21, 229-238 (2011).</li><li>Kontush, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL+particle+number+and+size+as+predictors+of+cardiovascular+disease.">HDL particle number and size as predictors of cardiovascular disease.</a> Front in Pharmacol. , (2015).</li><li>Karathanasis, S. K., Freeman, L. A., Gordon, S. M., Remaley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+changing+face+of+HDL+and+the+best+way+to+measure+it.">The changing face of HDL and the best way to measure it.</a> Clin. Chem. 63, 196-210 (2017).</li></ol>

Dr. Madasamy mottok gi støtte fra Plaxgen, Inc, og har en konkurrerende økonomisk interesse. Andre forfattere har ingen konkurrerende økonomiske interesser å avsløre.

Distribusjon og funksjonelle egenskaper VLDL LDL og HDL kolesterol partikler i blodsirkulasjonen bestemmes, hovedsakelig av metabolsk, genetisk, epidemiologisk, cellular, og plasma faktorer22,23. Studien, undersøker virkningene av lipid-modifisere stoffer i bufferen avslørt at svært lipofile stoffer som ezetimibe, lovastatin, simvastatin og atorvastatin indusert en høyere nivå kompleksitet på morfologi av kolesterol partikler sammenlignet med lavere nivå effekten observert med svært hydrofile rosuvastatin og fluvastatin narkotika. Disse resultatene er i god avtale med våre tidligere study beskriver en ikke-enzymatisk mekanisme basert effekt av statiner i modulerende LDL og HDL kolesterol partikler formasjon i bufferen og serum prøver21. Følgelig viste resultatene fra denne studien en ikke-enzymatisk virkningsmekanismen av ezetimibe, niacin, fibrate, og omega-3 fettsyrer stoffer som kan spille en direkte rolle i modulerende kolesterol partikler formasjon. Det er mulig at samspillet mellom narkotika og kolesterol aggregater fører til montering av stor størrelse kolesterol partikler som er 2-60 µm2, viser globular og lineære strand morphologies.
Dessuten foreslår resultatene med renset lipoprotein partikler interaksjoner mellom kolesterol aggregater og plasma faktorer inkludert VLDL LDL og HDL proteiner som kan endre komposisjoner og morfologiske egenskaper av kolesterol partikler. Narkotika behandling resultatene som involverer renset lipoprotein partikler indikerte en høyere nivå narkotika effekt på VLDL partikler formasjon sammenlignet med virkning observert på LDL Kolesterol partikler formasjon. Lovastatin og simvastatin ezetimibe narkotika ble brukt som pro-legemidler og deres doser i analyser kan være høyere enn de fysiologiske konsentrasjonene.
Interessant, formet screening av serumprøver viste varianter av narkotika effekt på endre profiler av VLDL LDL og HDL kolesterol partikler formasjon, spesielt deres effekt på formasjoner av lineær LDL og HDL partikler. Disse stoffene indusert reduksjon på lineær formet LDL og HDL kolesterol partikler formasjon i både dyslipidemi og alder-matchet normal serumprøver. Narkotika effekter observert på å redusere lineær formet partikler formasjon var høyere i simvastatin, ezetimibe, lovastatin og niacin. Identifikasjon av kolesterol partikler med globular og lineære strand morphologies i serumprøver normal og dyslipidemi antyder at partikler med lignende morphologies kan danne i vivo forhold. Tidligere studier har identifisert plate og nål som kolesterol krystaller i aterosklerotisk plaketter av menneskelige og ApoE- /- og LDLR- / - mus modeller24,25,26 ,27,28.
HDL partikler i blodet eksisterer som en heterogen blanding og nivået av små og store størrelse HDL partikler sammen med funksjonelle aktiviteten er viktige faktorer for å utøve sine cardio-beskyttende effekt via omvendt kolesterol transport Pathway29,30. Nyere studier har understreket viktigheten av å identifisere HDL kolesterol partikkel subfractions for Klargjørende deres rolle i flere biologiske funksjoner som kolesterol middelklasseinnbyggere, anti-betennelse, anti-trombotiske og anti-oksidativt31 . I tillegg har en rekke studier rapportert effekten av lipidsenkende terapi i økende en lav til moderat nivået av HDL i plasma1,5,21. Følgelig gir resultatene fra denne studien ny innsikt på morfologiske funksjoner i kolesterol partikler. Spesielt oppdagelsen av et høyere nivå av lineær formet HDL kolesterol partikler i serumprøver av dyslipidemi antyder at de kan være pålitelig biomarkør både diagnose og evaluere effekten av lipid-modifisere stoffer i pasienter. Imidlertid flere er undersøkelse nødvendig med store klinisk prøver for å forstå kolesterol partikler med forskjellige morphologies og tilknytningen til CVD.
Plakk array analysen for å undersøke narkotika effekten på montering av kolesterol partikler, brukte vi 2 µg av fluorescens merket kolesterol aggregater og 5 µgof narkotika fordi: (1) narkotika konkurransedyktig binde til både fluorescens merket kolesterol og endogene lipider i serumprøver; (2) fra hver prøve kjøpte vi 5000 til 10.000 kolesterol partikler som er samlet i store størrelser og figurer fra ~ 2-60 µ2; (3) vi observerte et bredt varianter av narkotika-respons blant serumprøver inkubert med narkotika (doser 300 ng til 5 µg) og ~ 1-5% av dem inkubert med høye doser viste ingen synlig endringer i profilen til kolesterol partikler formasjon; og (4) samspillet mellom kolesterol aggregater og lipidsenkende legemidler er formidlet av en ikke-enzymatisk prosess. Derfor kan konsentrasjonen av reagensene i analysen være høyere enn deres fysiologisk nivå.
I konklusjonen, har vi vist fordelene med en i vitro imaging metoden beskrevet i denne studien for å bestemme effekten av et bredt spekter av lipidsenkende legemidler på modulerende morfologi og sammensetningen av kolesterol partikler. Tilnærming visualisere og kvantifisere morfologi av lipid partikler ved å bruke en konstellasjon av bildet analysealgoritmer kan hjelpe både diagnosen åreforkalkning og evaluere resultatene av lipidsenkende terapi hos pasienter.

Flere kliniske studier har vist gunstige effekter av lipidsenkende legemidler i å redusere Plasmanivåer av low-density lipoproteiner (LDL) kolesterol og lav til moderat nivå av økningen i high-density lipoprotein (HDL) kolesterol, som hindrer både primære og sekundære forekomst av aterosklerose-relaterte kardiovaskulære bivirkninger,1,,2,,3,,4,,5. Statiner, en gruppe av HMG-CoA reduktasehemmere, blokkere endogene kolesterol syntese i leveren at i tur føre til lavere sirkulerende nivåer av LDL kolesterol i blodet6,7. Likeledes, lipid redusere effekten av niacin er formidlet av sin direkte og noncompetitive hemming av hepatocyte diacylglycerol acyltransferase-2, en nøkkel leveren enzym involvert i triglyserider syntese8. Relativt, reduserer ezetimibe plasma nivå av LDL ved å begrense absorpsjon av eksogene kolesterol ved binding til Niemann-Pick C1-Like 1 (NPC1L1) protein i epitelceller av tynntarmen9. Fenofibrate, et annet lipidsenkende stoff, reduserer betydelig plasma konsentrasjoner av triglyserider og også moderat reduserer LDL Kolesterol til peroxisome proliferator-aktivert reseptorer veien10. Dessuten, omega-3 fettsyrer er rapportert å ha anti-aterosklerotisk effekt på grunn av sin evne til å redusere Plasmanivåer av LDL11.
Lipidsenkende narkotika, i tillegg til deres primære effekt på å senke LDL Kolesterol, har en rekke gunstige pleiotropic effekter inkludert øke HDL-nivået, forbedre endothelial funksjoner, reduserer betennelse og hemme blodplater samlinger12,13,14. Men den underliggende mekanismen av disse stoffene i øker HDL kolesterol partikler og endre deres strukturfunksjonene er ikke fullt ut forstått. Siden disse legemidlene er vidt foreskrevet for å behandle aterosklerose-relaterte karsykdommer (karsykdommer), er det viktig å undersøke nærmere deres mulig rolle i å bestemme morfologiske funksjoner og distribusjon av lipid partikler. Humant plasma-lipidome består av ca. 600 forskjellige lipider og 22 molekylær ulike cholesterols som finnes i ulike størrelser, figurer, tettheter og komposisjoner15,16,17 . Analytiske metoder som ultra-sentrifugering, NMR og gradient gel geleelektroforese brukes til å karakterisere LDL og HDL partikler og deres subfractions18,19. Anvendelsen av disse metodene er imidlertid begrenset til studier for å bestemme effekten av stoffene i modulerende morfologi og montering av lipid partikler. Flow cytometer basert plakk matrisen er en funksjonell biokjemiske analysen utviklet for deteksjon og visualisering av serum avledet lipid og amyloid plakk partikler20. Fordelene med i vitro imaging metoden beskrevet i denne studien aktiverer identifisering av lipid-modulerende narkotika effekter i å endre morfologi og distribusjon av kolesterol partikler i bufferen og serum.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>TopFluor fluorescent cholesterol</td>
			<td>Avanti Polar lipids</td>
			<td></td>
			<td>store 100 &#181;l aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>simvastatin (pro-drug)</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td></td>
			<td>store 100 &#181;l aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lovastatin (pro-drug)</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td></td>
			<td>store 100 &#181;l aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rosuvastatin</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td></td>
			<td>store 100 &#181;l aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>atorvastatin</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td></td>
			<td>store 100 &#181;l aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluvastatin</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td></td>
			<td>store 100 &#181;l aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ezetimibe (pro-drug)</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td></td>
			<td>store 100 &#181;l aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Niacin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td></td>
			<td>store 100 &#181;l aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fibrate</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td></td>
			<td>store 100 &#181;l aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>omega-3 fatty acid</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td></td>
			<td>store 100 &#181;l aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>purified VLDL proteins/particles</td>
			<td>Lee Bio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>purified LDL proteins/particles</td>
			<td>Lee Bio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>purified HDL proteins/particles</td>
			<td>Lee Bio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human age-matched serum</td>
			<td>Dx Biosamples</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human atherosclerosis serum</td>
			<td>Bioserve</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human normal serum</td>
			<td>Stanford Blood center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDL measurement reagent pack</td>
			<td>Roche Diangostics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDL measurement reagent pack</td>
			<td>Roche Diangostics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total cholesterol measurment</td>
			<td>Roche Diangostics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microtitre plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triglycerides measrument</td>
			<td>Roche Diangostics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amnis Imaging Flow cytometer</td>
			<td>Amnis Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDEAS image analysing software</td>
			<td>Amnis Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemistry Analyzer-1, ChemWel 2902</td>
			<td>Awarness Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemistry Analyzer-2, Intergra 400</td>
			<td>Roche Diangostics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differential effects of lipid-lowering drugs in modulating morphology of cholesterol particles

Behandling av dyslipidemi pasienter med lipidsenkende legemidler fører til en betydelig reduksjon i low-density lipoproteiner (LDL) nivå og et lavt til moderat nivå av økningen i high-density lipoprotein (HDL) kolesterol i plasma. Men er en mulig rolle av disse stoffene i å endre morfologi og distribusjon av kolesterol partikler dårlig forstått. Her beskriver vi i vitro evalueringen av lipidsenkende narkotika effekter i modulerende morfologiske funksjoner i kolesterol partikler med metoden plakk matrise i kombinasjon med imaging flowcytometri. Bildet analyser av kolesterol partikler indikerte at lovastatin, simvastatin, ezetimibe og atorvastatin indusere dannelsen av både globular og lineær strand-formet partikler, mens niacin, fibrater, fluvastatin og rosuvastatin induserer den dannelsen av bare globular-formet partikler. Neste, renset svært lav tetthet lipoprotein (VLDL) og LDL partikler inkubert med disse stoffene viste endringer i morfologi og bilde teksturen av kolesterol partikler subpopulasjoner. Videre avsløre screening av 50 serumprøver tilstedeværelsen av et høyere nivå av lineær formet HDL kolesterol partikler i fag med dyslipidemi (gjennomsnitt 18.3%) sammenlignet med alder-matchet normal (gjennomsnitt 11,1%) prøvene. Vi har også observert betydelige variasjoner i lipidsenkende narkotika effekter på å redusere lineær formet LDL og HDL kolesterol partikler formasjon i serumprøver. Disse funnene tyder på at lipidsenkende legemidler, i tillegg til sin celle-mediert hypolipidemic effekter, modulere direkte morfologi av kolesterol partikler av en ikke-enzymatisk virkningsmekanisme. Resultatene av disse resultatene har potensial til å informere diagnose av åreforkalkning og forutsi optimal lipidsenkende terapi.

Watch this Scientific Journal Video about Differential Effects of Lipid-lowering Drugs in Modulating Morphology of Cholesterol Particles at JoVE.com

Differential Effects of Lipid-lowering Drugs in Modulating Morphology of Cholesterol Particles

Differensial virkningene av lipidsenkende legemidler i modulerende morfologi av kolesterol partikler

Målet med denne studien var å vurdere i vitro lipidsenkende narkotika effekter i modulerende morfologi av kolesterol partikler. Sammenligning av lipidsenkende legemidler avslørte variasjoner virkning i modulerende den morfologiske funksjoner i kolesterol partikler.

Treatment of dyslipidemia patients with lipid-lowering drugs leads to a significant reduction in low-density lipoproteins (LDL) level and a low to ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Medicine

Fundamentals

Chemistry of Life

SCIENTISTS IN ACTION

Cholesterol Efflux Assay

Kolesterol effluks Assay

Cholesterol content of cells must be maintained within the very tight limits, too much or too little cholesterol in a cell results in disruption of ...

A Methodological Approach to Non-invasive Assessments of Vascular Function and Morphology

En metodisk tilnærming til ikke-invasive vurderinger av vaskulær funksjon og morfologi

The endothelium is the innermost lining of the vasculature and is involved in the maintenance of vascular homeostasis.  Damage to the endothelium may ...

A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs

En humant glioblastom organotypisk skivekulturmodell for studier av tumorcellemigrasjon og pasientspesifikke effekter av antiinvasjonsmidler

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor ...

Assessing Specificity of Anticancer Drugs In Vitro

Assessing Specificity of Anticancer Drugs In Vitro

Vurdere Spesifisitet av kreftmedisiner<em&gt; In Vitro</em

A procedure for assessing specificity of anticancer drugs in vitro using cultures containing both tumor and non-tumor cells is demonstrated. The key ...

Use of Rabbit Eyes in Pharmacokinetic Studies of Intraocular Drugs

Bruk av kaninøyne i farmakokinetiske studier av intraokulært narkotika

The intraocular route of drug administration enables the delivery of high concentrations of therapeutic drugs, while minimizing their systemic absorption. ...

Echocardiographic and Histological Examination of Cardiac Morphology in the Mouse

Echocardiographic og histologiske undersøkelse av Cardiac morfologi musen

An increasing number of genetically modified mouse models has become available in recent years. Moreover, the number of pharmacological studies performed ...

Semi-automated Analysis of Mouse Skeletal Muscle Morphology and Fiber-type Composition

Halvautomatisk analyse av musen Skjelettmuskel morfologi og Fiber-type sammensetning

For years, distinctions between skeletal muscle fiber types were best visualized by myosin-ATPase staining. More recently, immunohistochemical staining of ...

High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay

Høy gjennomstrømming Nitrobenzoxadiazole-merket kolesterol middelklasseinnbyggere analysen

Atherosclerosis leads to cardiovascular disease (CVD). It is still unclear whether cholesterol-HDL (cHDL) concentration plays a causal role in ...

A Minimally Invasive Method for Intratracheal Instillation of Drugs in Neonatal Rodents to Treat Lung Disease

En minimal invasiv metode for intratrakeal instillasjon av legemidler hos neonatale gnagere for å behandle lungesykdom

Treatment of neonatal rodent with drugs instilled directly into the trachea could serve as a valuable tool to study the impact of a locally administered ...

Self-Administration of Drugs in Mouse Models of Feeding and Obesity

Selvadministrasjon av narkotika i musemodeller av fôring og fedme

Preclinical studies in mice often rely on invasive protocols, such as injections or oral gavage, to deliver drugs. These stressful routes of ...