Name: differential effects of lipid-lowering drugs in modulating morphology of cholesterol particles
Uploaded: 2017-11-10T15:00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Differential Effects of Lipid-lowering Drugs in Modulating Morphology of Cholesterol Particles at JoVE.com

Detta arbete finansierades av en Plaxgen forskning bidrag till SM (PLX-1008). Vi tackar Palo Alto medicinsk forskning stiftelsen Research Institute för att samla serumprover från åderförkalkning försökspersoner under IRB godkännande.

1. beredning av fluorescerande-märkt kolesterol och lipidsänkande läkemedel Obs: lysrör-märkt kolesterol aggregat och statiner utarbetades som beskrivs i vår tidigare artikel 21. information av reagenser, imaging flödescytometer, kemi analysatorer och data analys programvara som används i denna studie finns Tabell för material.
<ol><li>Solubilize lysrör-märkt frystorkade kolesterol (1 mg, Ex / Em = 495 nm/507 nm) pulver i 1 mL 100% alkohol.</li>
	<li>Centrifugera provet för 3 min vid 2 040 x g och använda supernatanterna som innehåller lösliga fluorescens-märkt kolesterol aggregat i plack array analys.</li>
	<li>För beredning av läkemedel, individuellt solubilize pulver (2 mg) av simvastatin, lovastatin, atorvastatin, ezetimib och omega-3 fettsyror i 100% alkohol 1 ml.</li>
	<li>Efter centrifugering för 3 min vid 2 040 x g, använda supernatanterna som innehåller läkemedel i analysens.</li>
	<li>Likaså solubilize individuellt pulver (2 mg) av fluvastatin, rosuvastatin, niacin, och fibrat i 1 mL avjoniserat vatten för att göra en stamlösning av 2 mg/mL.</li>
	<li>Efter centrifugering för 3 min vid 2 040 x g, använda supernatanterna som innehåller läkemedel i plack array analys.</li>
</ol> 2. Plack Array analys för kontrollera In Vitro kolesterol partiklar bildas <ol><li>Använd kemi analyzer-1 (se tabell för material) för att ställa in plack array analysen för kolesterol partiklar bildas. Utför analysen i en rund botten, plattan med låg protein bindande 96 brunnar har med reagens beredd i avsnitt 1. Upprätthålla den slutliga reaktion volymen i varje brunn på 200 µL och utföra alla analyser i tre exemplar.
	<ol><li>Första belastning 194,5 µL av fosfat buffrad saltlösning (PBS) till varje brunn.</li>
		<li>Till varje brunn, tillsätt 2,5 µL (5 µg) av varje lipidsänkande läkemedel lösning och skaka plattan för 30 s genom att placera den på kemi analyzer-1 reaktion tallrik att enhetligt blanda läkemedlet i lösning. Inget läkemedel läggs till de negativa kontrollproverna.</li>
		<li>Slutligen, tillsätt 2 µL (2 µg) lysrör-märkt kolesterol samlade lösning till varje brunn och skaka plattan för 30 s genom att placera den på kemi analyzer-1 reaktion tallrik.</li>
		<li>Inkubera plattan på en lab shaker för 2 h vid 37 ° C och 200 rpm.</li>
		<li>Efter inkubation, förvärva bilder av partiklar av imaging flödescytometri.</li>
	</ol></li></ol> 3. Fånga bilder av kolesterol partiklar använda Imaging Flow flödescytometri <ol><li>Öppna mallen data förvärv till lasta de rätta instrumentinställningarna. Klicka på &#34; fil &#34; Välj sedan &#34; öppna mall &#8230; &#34; och välj mallfilen.</li>
	<li>Klicka &#34; Flush, lås, lasten &#34; att förbereda instrumentet för provet lastning.</li>
	<li>När den &#34; Ladda prov &#34; dialog öppnas, klicka på &#34; OK &#34; att läsa 50 µL av proverna från var väl förberedd i avsnitt 2 i de imaging flödescytometer.</li>
	<li>Klicka &#34; kör | Setup &#34; att Visa partiklarna i området imaging i realtid.</li>
	<li>När partiklarna i området imaging är i bra fokus, klicka &#34; kör | Förvärva &#34; att förvärva bilder av varje objekt samtidigt på en hög genomströmning sätt för mörka fält (side scatter/SSC), ljusa fält (BF), grön fluorescens och gul fluorescens.</li>
	<li>Upprepa steg 3,2-3,5 att förvärva 5,000-10,000 partiklar från varje prov.</li>
	<li>Analysera alla RAW-filer med programmet bild analys för att fastställa objektet fluorescensintensiteten och morfologiska variationer.
	<ol><li>Klicka på &#34; verktyg &#34; överst i bild analys programvaran sedan &#34; Batch datafiler &#34; från droppa-ned menyn, som kommer att öppna den &#34; partier &#34; fönster.</li>
		<li>i den &#34; partier &#34; fönster, klicka på den &#34; lägga till Batch &#34; knapp, som kommer att öppna den &#34; definiera en Batch &#34; fönster.</li>
		<li>i den &#34; definiera en Batch &#34; fönster, klicka på den &#34; Lägg till filer &#34; knappen och välj raw-bildfilerna, klicka på den &#34; mall &#34; knappen och välj filen lämpliga data analys mall och sedan &#34; OK &#34; och &#34; lämna partier &#34; att påbörja behandling och analys av raw-bildfilerna.</li>
	</ol></li></ol> 4. Plack Array analys baserat utvärdering av lipidsänkande läkemedel effekt på renat kolesterol partiklar <ol><li>som beskrivs i steg 2.1, utföra kolesterol partiklar bildas analysen använder renat VLDL, LDL och HDL lipoproteiner och partiklar. Utföra plack array analysen i en plattan med 96 brunnar.
	<ol><li>Först, ladda alla brunnar med PBS; använda en 200 µL slutlig volym för varje brunn.</li>
	</ol></li> <li>För negativkontroll, lägga till 4 µg VLDL, LDL, eller HDL proteiner och partiklar individuellt i varje brunn utan droger och skaka plattan för 30 s.
	<ol><li>För att undersöka den lipidsänkande läkemedel effekten, lägga till 4 µg VLDL, LDL, eller HDL proteiner och partiklar individuellt till varje brunn och skaka plattan för 30 s.</li>
		<li>För brunnar med 4 µg VLDL, LDL och HDL, tillsätt 2,5 µL (5 µg) ezetimib, lovastatin, simvastatin eller niacin lösning och skaka plattan för 30 s genom att placera den i kemi analyzer-1.</li>
		<li>Slutligen, tillsätt 2 µL (2 µg) fluorescens-märkt kolesterol samlade lösning i alla brunnar och skaka plattan för 30 s genom att placera den på kemi analyzer-1 reaktion tallrik.</li>
	</ol></li> <li>Inkubera plattan för 2 h i en lab shaker vid 37 ° C och 200 rpm.</li>
	<li>Förvärva proverna använda imaging flödescytometri efter steg 3.1-3.5.</li>
	<li>Analysera raw-bildfiler med bild analys programvara som beskrivs i steg 3,7.</li>
	<li>i mallen analys, använda följande Usenets systemet för identifiering av kolesterol partiklar subpopulations.
	<ol><li>På en tomt på gröna kanalen mättad pixelantal (x-axeln) och mörka fält kanal mättade pixelantal (y-axeln), avvisa objekt med en eller flera mättade pixlar i antingen kanal.</li>
		<li>Rita objekt/partiklar utan mättade pixlar med gröna kanalen intensitet (x-axeln) och SSC intensitet (y-axeln): objekt delas in i tre regioner (VLDL, LDL, HDL) baserat på deras gröna kanalen och SSC stödnivåer. 
		Obs: Dessa portar har skapats utifrån data som genereras från kontroll-experiment som genomförs med hjälp av renat VLDL, LDL och HDL partiklar/proteiner utan drogen.</li>
	</ol></li> <li>För att avgöra effekten lipidsänkande läkemedel för varje prov, beräkna de totala lipoprotein partiklar koncentrationerna, samt procentandelen av varje delpopulation (VLDL, LDL, HDL) som beskrivs i steg 6.5.
	<ol><li>Beräkna partikeln koncentrationer (partiklar/mL) med hjälp av följande ekvation: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56596/56596eq1.jpg" /> Obs: The VLDL, LDL och HDL gating regioner i fluorescens dot-tomten upptäcka ~ 80% av deras respektive subpopulations, och de återstående ~ 20% av partiklarna överlappar med andra Usenets regioner.</li>
	</ol></li></ol> 5. Mätning av Lipid koncentrationer i serumprover <ol><li>för att fastställa koncentrationer av LDL, HDL, kolesterol och triglycerider av kemi analyzer-2, Använd serum produktproverna åldersmatchade normala och dyslipidemi försökspersoner.</li>
	<li>Definiera onormal koncentration av LDL, HDL, kolesterol och triglycerider baserat på deras koncentration identifierade bortom de övre och nedre referensvärdena i serumprov.</li>
	<li>Följer normala referens värde rekomDED av reagens tillverkaren: kolesterol (4-200 mg/dL), HDL (3.0-65 mg/dL), LDL (4-100 mg/dL) och triglycerider (9-200 mg/dL).</li>
	<li>Identifiera serumprov som har ett avvikande värde som antingen under nedre referensvärdet eller ovanför referensen högre värde för kolesterol och triglycerider, och använda dem för screening i närvaro och frånvaro av lipidsänkande läkemedel.</li>
</ol> 6. Analysera effekten av drogerna på kolesterol partiklar bildas i serumprov <ol><li>användning kemi analyzer-1 ställa in plack array analysen för kolesterol partiklar bildas i serumprov. Utför analysen i en rund botten, låg protein bindande plattan med 96 brunnar. Använda en slutliga reaktionsvolym 200 µL per brunn och utföra alla analyser i tre exemplar.</li>
	<li>Förbereda plattan genom att ladda reagenser i en stegvis sätt.
	<ol><li>Förbereda kontrollbrunnarna.</li>
		<li>Belastning 193 µL av PBS till varje brunn.</li>
		<li>Lägga till 2,5% (v/v) patientens serum (endast ett serumprov per brunn) och skaka plattan för 30 s genom att placera den på kemi analyzer reaktionen tallrik.</li>
		<li>Add 2 µL (2 µg) fluorescens-märkt kolesterol aggregera lösning i varje brunn och skaka plattan för 30 s genom att placera den på en tallrik med kemi i analyzer-1 reaktion.</li>
	</ol></li> <li>Förbereda brunnarna med droger.
	<ol><li>Belastning 191 µL av PBS till varje brunn.</li>
		<li>Lägga till 2,5% (v/v) patientens serum (endast ett serumprov per brunn) och skaka plattan för 30 s genom att placera den på en tallrik med kemi i analyzer-1 reaktion.</li>
		<li>Add 2 µL ezetimib, lovastatin, simvastatin eller niacin lösning (4 µg) alla brunnar förutom de negativa kontrollbrunnarna. Tillsätt bara en drog per brunn och skaka plattan för 30 s genom att placera den på en tallrik med kemi i analyzer-1 reaktion.</li>
		<li>Add 2 µL av fluorescens-märkt kolesterol aggregera lösning (2 µg) i varje brunn och skaka plattan för 30 s genom att placera den på kemi analyzer-1 reaktion tallrik.</li>
	</ol></li> <li>Ladda droger endast efter alla brunnar (kontroll och drog-behandlade) har lästs in med deras respektive serumprov, och lägga till fluorescens-märkt kolesterol i slutet av det här steget.</li>
	<li>Inkubera plattan för 2 h i en lab shaker vid 37 ° C och 200 rpm.</li>
	<li>Förvärva proverna av imaging flödescytometer följande inställningar som beskrivs i steg 3.1-3.6.</li>
	<li>Använda bilden analysera programvara för batch-bearbetning alla bildfiler med samma mall som beskrivs i steg 3,7.
	<ol><li>Utföra dataanalys genom att rita gates på tomten som beskrivs i steg 4.5 och 4.6.</li>
	</ol></li> <li>För att avgöra den lipidsänkande läkemedel effekt/svaren (låg, måttlig och hög) för varje prov, beräkna den totala lipoprotein partikel koncentrationen, samt procentandelen av det totala partiklar bestående av VLDL, LDL och HDL subpopulationer.</li>
	<li>Rita VLDL, LDL och HDL befolkningarna på ett histogram för objektet &#39; s ljusa fältet bild, bredd subtraheras från längd (längd - bredd) och porten till antingen klotformiga eller linjär regioner: objekt med (längd - bredd) &#8804; 2 µm faller den klotformig regionen för beräkning av procentsatsen klotformig och linjära formade partiklar.</li>
	<li>Jämföra andelen klotformig och linjära formade LDL och HDL kolesterol partiklar identifieras för varje serumprov som inkuberas med och utan varje läkemedel. Bland tre exemplar värden som erhållits för varje serumprov, acceptera procentandelen klotformig och linjära formade LDL och HDL partiklar som faller inom SD ±2 intervall för bestämning av drogen effekten.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Pahan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-lowering+drugs.">Lipid-lowering drugs.</a> Cell Mol Life Sci. 63, 1165-1178 (2006).</li><li>Laforest, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+low+high-density+lipoprotein+cholesterol+and+hypertriglyceridaemia+in+patients+treated+with+hypolipidaemic+drugs.">Prevalence of low high-density lipoprotein cholesterol and hypertriglyceridaemia in patients treated with hypolipidaemic drugs.</a> Arch Cardiovasc Dis. 102, 43-50 (2009).</li><li>Roberts, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preventing+and+arresting+coronary+atherosclerosis.">Preventing and arresting coronary atherosclerosis.</a> Am Heart J. 130, 580-600 (1995).</li><li>Goldstein, J. L., Brown, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+century+of+cholesterol+and+coronaries:+from+plaques+to+genes+to+statins.">A century of cholesterol and coronaries: from plaques to genes to statins.</a> Cell. 16, 161-172 (2015).</li><li>Drexel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statins,+fibrates,+nicotinic+acid,+cholesterol+absorption+inhibitors,+anion-exchange+resins,+omega-3+fatty+acids:+which+drugs+for+which+patients?.">Statins, fibrates, nicotinic acid, cholesterol absorption inhibitors, anion-exchange resins, omega-3 fatty acids: which drugs for which patients?.</a> Fundam Clin Pharmacol. 23, 687-692 (2009).</li><li>Camelia, S., Anca, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statins:+Mechanism+of+action+and+effects.">Statins: Mechanism of action and effects.</a> J.Cell.Mol.Med. 5, 378-387 (2001).</li><li>Schaefer, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparisons+of+effects+of+statins+(atorvastatin,+fluvastatin,+lovastatin,+pravastatin,+and+simvastatin)+on+fasting+and+postprandial+lipoproteins+in+patients+with+coronary+heart+disease+versus+control+subjects.">Comparisons of effects of statins (atorvastatin, fluvastatin, lovastatin, pravastatin, and simvastatin) on fasting and postprandial lipoproteins in patients with coronary heart disease versus control subjects.</a> Am J Cardiol. 93, 31-39 (2004).</li><li>Meyers, C. D., Kamanna, V. S., Kashyap, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niacin+therapy+in+atherosclerosis.">Niacin therapy in atherosclerosis.</a> Curr Opin in Lipid. 15, 659-665 (2004).</li><li>Phan, B. A., Dayspringm, T. D., Toth, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ezetimibe+therapy:+mechanism+of+action+and+clinical+update.">Ezetimibe therapy: mechanism of action and clinical update.</a> Vasc Health Risk Mana. 8, 415-427 (2012).</li><li>Leitersdorf, E., Fruchart, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+action+of+fibrates+on+lipid+and+lipoprotein+metabolism.">Mechanism of action of fibrates on lipid and lipoprotein metabolism.</a> Circulation. 98, 2088-2093 (1998).</li><li>Backes, J., Anzalone, D., Hilleman, D., Catini, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+relevance+of+omega-3+fatty+acids+in+the+management+of+hypertriglyceridemia.">The clinical relevance of omega-3 fatty acids in the management of hypertriglyceridemia.</a> Lipids Health Dis. 15, 118 (2016).</li><li>Davidson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Significance+of+Statin+Pleiotropic+Effects+Hypotheses+Versus+Evidence.">Clinical Significance of Statin Pleiotropic Effects Hypotheses Versus Evidence.</a> Circulation. 111, 2280-2281 (2005).</li><li>Chinetti-Gbaguidi, G., Fruchart, J. C., Staels, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pleiotropic+effects+of+fibrates.">Pleiotropic effects of fibrates.</a> Curr Atheroscler Rep. 7, 396-401 (2005).</li><li>McTaggart, F., Jones, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Statins+on+High-Density+Lipoproteins:+A+Potential+Contribution+to+Cardiovascular+Benefit+Effects+of+Statins+on+High-Density+Lipoproteins:+A+Potential+Contribution+to+Cardiovascular+Benefit.">Effects of Statins on High-Density Lipoproteins: A Potential Contribution to Cardiovascular Benefit Effects of Statins on High-Density Lipoproteins: A Potential Contribution to Cardiovascular Benefit.</a> CardiovascDrugs Ther. 22, 321-338 (2008).</li><li>Quehenberger, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Plasma+Lipidome.">The Human Plasma Lipidome.</a> N Engl J Med. 365, 1812-1823 (2011).</li><li>Lund-Katz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+responsible+for+the+compositional+heterogeneity+of+nascent+high+density+lipoprotein.">Mechanisms responsible for the compositional heterogeneity of nascent high density lipoprotein.</a> J. Biol Chem. 288, 23150-23160 (2013).</li><li>Krauss, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoprotein+subfractions+and+cardiovascular+disease+risk.">Lipoprotein subfractions and cardiovascular disease risk.</a> Curr Opin Lipidol. 21, 305-311 (2010).</li><li>Krauss, R. M., Burke, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multiple+subclasses+of+plasma+low+density+lipoproteins+in+normal+humans.">Identification of multiple subclasses of plasma low density lipoproteins in normal humans.</a> J Lipid Res. 23, 97-104 (1982).</li><li>Rosenson, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL+measures,+particle+heterogeneity,+proposed+nomenclature,+and+relation+to+atherosclerotic+cardiovascular+Events.">HDL measures, particle heterogeneity, proposed nomenclature, and relation to atherosclerotic cardiovascular Events.</a> Clinic Chemi. 57, 392-410 (2011).</li><li>Madasamy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plaque+array+method+and+proteomics-based+identification+of+biomarkers+from+Alzheimer's+disease+serum.">Plaque array method and proteomics-based identification of biomarkers from Alzheimer's disease serum.</a> Clin Chim Acta. 441, 79-85 (2015).</li><li>Madasamy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonenzymatic+Mechanism+of+Statins+in+Modulating+Cholesterol+Particles+Formation.">Nonenzymatic Mechanism of Statins in Modulating Cholesterol Particles Formation.</a> Am J Cardiol. 118, 1187-1191 (2016).</li><li>Peter, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+relevance+of+the+biochemical,+metabolic,+and+genetic+factors+that+influence+low-density+lipoprotein+heterogeneity.">Clinical relevance of the biochemical, metabolic, and genetic factors that influence low-density lipoprotein heterogeneity.</a> Am J Cardiol. 90, 30-47 (2002).</li><li>Weissglas-Volkov, D., Pajukanta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+causes+of+high+and+low+serum+HDL-cholesterol.">Genetic causes of high and low serum HDL-cholesterol.</a> J Lipid Res. 51, 2032-2057 (2010).</li><li>Abela, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+statins+on+cholesterol+crystallization+and+atherosclerotic+plaque+stabilization.">Effect of statins on cholesterol crystallization and atherosclerotic plaque stabilization.</a> Am J Cardiol. 107, 1710-1717 (2011).</li><li>Nidorf, S. M., Eikelboom, J. W., Thompson, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cholesterol+crystal-induced+inflammation+for+the+secondary+prevention+of+cardiovascular+disease.">Targeting cholesterol crystal-induced inflammation for the secondary prevention of cardiovascular disease.</a> Cardiovasc Pharmacol Ther. 19, 45-52 (2014).</li><li>Thacker, S. G., Zarzour, A., Chen, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+density+lipoprotein+reduces+inflammation+from+cholesterol+crystals+by+inhibiting+inflammasome+activation.">High density lipoprotein reduces inflammation from cholesterol crystals by inhibiting inflammasome activation.</a> Immunol. 149, 306-319 (2016).</li><li>Kim, S. H., Lee, E. S., Lee, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+coherent+anti-stokes+Raman+Spectroscopy+images+intact+atheromatous+lesions+and+concomitantly+identifies+distinct+chemical+profiles+of+atherosclerotic+lipids.">Multiplex coherent anti-stokes Raman Spectroscopy images intact atheromatous lesions and concomitantly identifies distinct chemical profiles of atherosclerotic lipids.</a> Circ Res. 106, 1332-1341 (2010).</li><li>Lim, R. S., Suhalim, J. L., Miyazaki-Anzai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+cholesterol+crystals+in+plaques+of+atherosclerotic+mice+using+hyperspectral+CARS+imaging.">Identification of cholesterol crystals in plaques of atherosclerotic mice using hyperspectral CARS imaging.</a> J Lipid Res. 52, 2177-2186 (2011).</li><li>Rothblat, G. H., Phillips, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+lipoprotein+heterogeneity+and+function+in+reverse+cholesterol+transport.">High-density lipoprotein heterogeneity and function in reverse cholesterol transport.</a> Curr Opin Lipidol. 21, 229-238 (2011).</li><li>Kontush, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL+particle+number+and+size+as+predictors+of+cardiovascular+disease.">HDL particle number and size as predictors of cardiovascular disease.</a> Front in Pharmacol. , (2015).</li><li>Karathanasis, S. K., Freeman, L. A., Gordon, S. M., Remaley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+changing+face+of+HDL+and+the+best+way+to+measure+it.">The changing face of HDL and the best way to measure it.</a> Clin. Chem. 63, 196-210 (2017).</li></ol>

Dr. Madasamy fick bevilja stöd från Plaxgen, Inc och har konkurrerande ekonomiska intressen. Andra författarna har inga konkurrerande ekonomiska intressen att avslöja.

I allmänhet, bestäms distribution och funktionella egenskaper av VLDL, LDL och HDL kolesterol partiklar i blodcirkulationen främst av metabola, genetisk, epidemiologisk, mobilnät och plasma faktorer22,23. I den aktuella studien, att undersöka effekterna av lipidmodifierande droger i bufferten avslöjade att starkt lipofila läkemedel såsom ezetimib, lovastatin, simvastatin och atorvastatin inducerade en högre nivå komplexitet på morfologin av kolesterol partiklar jämfört med den lägre nivå effekten som observerats med mycket hydrofila rosuvastatin och fluvastatin droger. Dessa resultat är bra överens med vår tidigare studie som beskriver en icke-enzymatiska mekanism baserat effekt av statiner i modulerande LDL och HDL kolesterol partiklar bildas i buffert och serum prover21. Således visade resultaten från föreliggande studie en icke-enzymatiska verkningsmekanismen för ezetimib, niacin, fibrat, och omega-3 fettsyra droger som kan spela en direkt roll i modulerande kolesterol partiklar bildas. Det är möjligt att interaktioner mellan läkemedel och kolesterol aggregat leder till montering av stor storlek kolesterol partiklar som är 2-60 µm2, uppvisar klotformig och linjära strand morfologier.
Förutom föreslå de resultat som erhålls med hjälp av renat lipoprotein partiklar interaktioner mellan kolesterol aggregat och plasma faktorer inklusive VLDL, LDL och HDL proteiner som kan förändra kompositioner och morfologiska egenskaper av kolesterol partiklar. Drogen behandlingsresultaten med renat lipoprotein partiklar anges en högre nivå drogen effekt på bildandet av VLDL-partiklar jämfört med deras effekten som observerats på LDL kolesterol partiklar bildas. Lovastatin, simvastatin och ezetimib droger användes som pro-droger och deras doser i analyserna kan vara högre än de fysiologiska koncentrationerna.
Intressant, formade screening av serumprover visade variationer av drogen effekt på att förändra profilerna av VLDL, LDL och HDL kolesterol partiklar bildas, särskilt deras effekt på formationerna av linjära LDL och HDL partiklar. Dessa läkemedel inducerad minskning på linjära formade LDL och HDL kolesterol partiklar bildas i både dyslipidemi och åldersmatchade normala serumprov. De drog effekter som observerats på att minska linjära formade partiklar bildandet var högre i simvastatin, ezetimib, lovastatin och niacin. Identifiering av kolesterol partiklar med klotformig och linjära strand morfologier i de normala och dyslipidemi serumprov antyder att partiklar med liknande morfologier kan bilda i vivo förhållanden. Tidigare studier har identifierat förekomst av skivan och nål-liknande kolesterolkristaller i de aterosklerotiska plack av mänskliga och ApoE- /- och Receptorn- / - möss-modeller24,25,26 ,27,28.
HDL partiklar cirkulerar i blodet finns som en heterogen blandning och nivån av små och stora HDL partiklar tillsammans med funktionell aktivitet är viktiga faktorer för att utöva sin cardio-skyddande effekt via omvänd kolesterol transport väg29,30. Nyligen genomförda studier har belyst vikten av att identifiera HDL kolesterol partikel och för att belysa deras roll i flera biologiska funktioner såsom kolesterol efflux, anti-inflammatoriska, anti-trombotisk och antioxidativ31 . Dessutom har ett antal studier rapporterade effekten av lipidsänkande terapi för att öka en låg till måttlig nivå av HDL i plasma1,5,21. Således ger resultaten från denna studie nya insikter på morfologiska egenskaper av kolesterol partiklar. Särskilt, upptäckt av en högre nivå av linjära formade HDL kolesterol partiklar i serumprover av dyslipidemi ämnen föreslår att de kan vara den pålitliga biomarkören för både diagnos och utvärdera effekterna av lipidmodifierande droger patienter. Ytterligare krävs undersökning dock med stora kliniska prover för att bättre förstå kolesterol partiklar med olika morfologier och deras koppling till CVD.
I plack array analys för att undersöka drogen effekten på montering av kolesterol partiklar, vi använt 2 µg av fluorescens märkt kolesterol aggregat och 5 µgof varje drog eftersom: (1) droger kompetitivt binda till både fluorescens märkt kolesterol och endogena lipider närvarande i serumprover; (2) från varje prov förvärvade vi 5.000 till 10.000 kolesterol partiklar som är monterade i stora storlekar och former allt från ~ 2-60 µ2; (3) vi observerade ett brett varianter av narkotika svar bland serumprover inkuberas med droger (doser 300 ng 5 µg) och ~ 1-5% av dem inkuberas med höga doser visade inga påvisbara förändringar i profilen för kolesterol partiklar bildas. och (4) samspelet mellan kolesterol aggregat och lipidsänkande läkemedel medieras av en icke-enzymatisk process. Koncentrationerna av de reagens som används i analysen kan därför vara högre än deras fysiologiska nivåer.
Sammanfattningsvis har vi framgångsrikt visat fördelarna med en in vitro- imaging metod som beskrivs i denna studie för att fastställa effekten av ett brett spektrum av lipidsänkande läkemedel på modulerande morfologi och sammansättning av kolesterol partiklar. Metoden att visualisera och kvantifiera morfologi av lipid partiklar genom att anställa en konstellation av bild analys algoritmer kan hjälpa båda diagnos av åderförkalkning och att utvärdera resultaten av lipidsänkande behandling till patienter.

Ett flertal kliniska studier har visat positiva effekter av lipidsänkande läkemedel minska plasmanivåerna av low-density lipoprotein (LDL) kolesterol och en låg till måttlig nivå ökning av high-density lipoprotein (HDL) kolesterol, som förhindrar både primära och sekundära incidenser av åderförkalkning-relaterade kardiovaskulära händelser1,2,3,4,5. Statiner, en grupp av HMG-CoA reduktas enzym-hämmare, blockera endogen kolesterolsyntes i levern som i sin tur leda till lägre cirkulerande nivåer av LDL-kolesterol i blodet6,7. Likaså medieras den lipidsänkande effekt av niacin av dess direkta och noncompetitive hämning av hepatocyte diglyceridolja acyltransferase-2, en nyckel leverenzym som är inblandade i triglycerid syntes8. Jämförelsevis, minskar ezetimib plasmanivå av LDL genom att begränsa absorptionen av exogent kolesterol genom bindning till Niemann-Pick C1-Like 1 (NPC1L1) protein ligger i epitelceller i tunntarmen9. Fenofibrat, en annan lipidsänkande läkemedel, minskar avsevärt plasmakoncentrationerna av triglycerider och även måttligt minskar LDL-kolesterol genom de peroxisome proliferator-aktiverade receptorer väg10. Omega-3 fettsyra uppges dessutom ha anti-aterosklerotisk effekt på grund av dess förmåga att sänka plasmanivåerna av LDL11.
De lipidsänkande läkemedel, utöver sin primära effekt på att sänka LDL-kolesterol, har ett antal fördelaktiga pleiotropiska effekter inklusive att öka HDL, förbättra endothelial funktioner, minska inflammation och hämma trombocyter aggregeringar12,13,14. Den underliggande mekanismen av dessa läkemedel öka HDL kolesterol partiklar och ändra deras strukturella egenskaper är dock inte helt klarlagda. Eftersom dessa läkemedel är allmänt föreskrivna för att behandla åderförkalkning kardiovaskulära sjukdomar (hjärtklaffarna), är det viktigt att ytterligare undersöka deras möjliga roller för att bestämma morfologiska egenskaper och distribution av lipid partiklarna. Den mänskliga plasma lipidome består av cirka 600 olika lipider och 22 olika molekylära typer av kolesterol som finns i olika storlekar, former, tätheter och kompositioner15,16,17 . Analytiska metoder såsom ultra-centrifugering, NMR och gradient gelelektrofores används för att karakterisera LDL och HDL partiklar och deras och18,19. Tillämpning av dessa metoder är dock begränsat till studier syftar till att fastställa effekten av läkemedel i modulerande morfologi och montering av lipid partiklarna. Flöde cytometer baserat plack matrisen är en funktionell biokemiska test utvecklat för upptäckt och visualisering av serum härrör lipid och amyloid plack partiklar20. Fördelarna med in vitro- imaging metod som beskrivs i denna studie aktivera identifiering av lipid-modulerande läkemedelseffekter att förändra morfologi och partiklarnas kolesterol i buffert-och serumprover.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>TopFluor fluorescent cholesterol</td>
			<td>Avanti Polar lipids</td>
			<td></td>
			<td>store 100 &#181;l aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>simvastatin (pro-drug)</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td></td>
			<td>store 100 &#181;l aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lovastatin (pro-drug)</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td></td>
			<td>store 100 &#181;l aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rosuvastatin</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td></td>
			<td>store 100 &#181;l aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>atorvastatin</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td></td>
			<td>store 100 &#181;l aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluvastatin</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td></td>
			<td>store 100 &#181;l aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ezetimibe (pro-drug)</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td></td>
			<td>store 100 &#181;l aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Niacin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td></td>
			<td>store 100 &#181;l aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fibrate</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td></td>
			<td>store 100 &#181;l aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>omega-3 fatty acid</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td></td>
			<td>store 100 &#181;l aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>purified VLDL proteins/particles</td>
			<td>Lee Bio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>purified LDL proteins/particles</td>
			<td>Lee Bio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>purified HDL proteins/particles</td>
			<td>Lee Bio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human age-matched serum</td>
			<td>Dx Biosamples</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human atherosclerosis serum</td>
			<td>Bioserve</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human normal serum</td>
			<td>Stanford Blood center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDL measurement reagent pack</td>
			<td>Roche Diangostics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDL measurement reagent pack</td>
			<td>Roche Diangostics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total cholesterol measurment</td>
			<td>Roche Diangostics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microtitre plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triglycerides measrument</td>
			<td>Roche Diangostics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amnis Imaging Flow cytometer</td>
			<td>Amnis Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDEAS image analysing software</td>
			<td>Amnis Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemistry Analyzer-1, ChemWel 2902</td>
			<td>Awarness Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemistry Analyzer-2, Intergra 400</td>
			<td>Roche Diangostics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differential effects of lipid-lowering drugs in modulating morphology of cholesterol particles

Behandling av dyslipidemi patienter med lipidsänkande läkemedel leder till en betydande minskning av low-density lipoprotein (LDL) nivå och en låg till måttlig nivå av ökning av high-density lipoprotein (HDL) kolesterol i plasma. Dock är en möjlig roll av dessa läkemedel att förändra morfologi och kolesterol partiklarnas bristfällig. Här beskriver vi i vitro utvärdering av lipidsänkande läkemedelseffekter i modulerande morfologiska egenskaper av kolesterol partiklar med metoden plack array i kombination med imaging flödescytometri. Bild analyser av kolesterol partiklarna indikerade att lovastatin, simvastatin, ezetimib och atorvastatin inducerar bildandet av både klotformig och linjära strand-formade partiklar, medan niacin, fibrater, fluvastatin och rosuvastatin framkalla den bildandet av endast klotformig-formade partiklar. Nästa, renat mycket low-density lipoprotein (VLDL) och LDL-partiklar som inkuberas med dessa läkemedel visade förändringar i morfologi och bild textur av kolesterol partiklar subpopulations. Dessutom visade screening av 50 serumprover förekomst av en högre nivå av linjära formade HDL kolesterol partiklar hos försökspersoner med dyslipidemi (genomsnitt 18,3%) jämfört med åldersmatchade normala (i genomsnitt 11,1%) proverna. Vi observerade också betydande variationer i lipidsänkande läkemedelseffekter på att minska linjära formade LDL och HDL kolesterol partiklar bildas i serumprov. Dessa fynd tyder på att lipidsänkande läkemedel, utöver sin cell-medierad hypolidemiska effekter, direkt kan modulera morfologi av kolesterol partiklar av en icke-enzymatiska verkningsmekanism. Resultaten av dessa resultat har potential att informera diagnos av åderförkalkning och förutsäga optimal lipidsänkande terapi.

Watch this Scientific Journal Video about Differential Effects of Lipid-lowering Drugs in Modulating Morphology of Cholesterol Particles at JoVE.com

Differential Effects of Lipid-lowering Drugs in Modulating Morphology of Cholesterol Particles

Differentiella effekter av lipidsänkande läkemedel i modulerande morfologi av kolesterol partiklar

Syftet med denna studie var att utvärdera i vitro lipidsänkande läkemedelseffekter i modulerande morfologi av kolesterol partiklar. Jämförelsen av lipidsänkande läkemedel visade variationer i deras effekt i modulerande de morfologiska egenskaperna av kolesterol partiklar.

Treatment of dyslipidemia patients with lipid-lowering drugs leads to a significant reduction in low-density lipoproteins (LDL) level and a low to ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Medicine

Fundamentals

Chemistry of Life

SCIENTISTS IN ACTION

Cholesterol Efflux Assay

Kolesterol Utflöde Analys

Cholesterol content of cells must be maintained within the very tight limits, too much or too little cholesterol in a cell results in disruption of ...

A Methodological Approach to Non-invasive Assessments of Vascular Function and Morphology

En metod för att icke-invasiva Bedömningar av kärlfunktionen och morfologi

The endothelium is the innermost lining of the vasculature and is involved in the maintenance of vascular homeostasis.  Damage to the endothelium may ...

A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs

En humant glioblastom organotypisk skivkulturmodell för studie av tumörcell migrering och patientspecifika effekter av antiinvasiva läkemedel

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor ...

Assessing Specificity of Anticancer Drugs In Vitro

Assessing Specificity of Anticancer Drugs In Vitro

Bedöma Specificitet av cytostatika<em&gt; In Vitro</em

A procedure for assessing specificity of anticancer drugs in vitro using cultures containing both tumor and non-tumor cells is demonstrated. The key ...

Use of Rabbit Eyes in Pharmacokinetic Studies of Intraocular Drugs

Användning av kaninögon i farmakokinetiska studier av intraokulära läkemedel

The intraocular route of drug administration enables the delivery of high concentrations of therapeutic drugs, while minimizing their systemic absorption. ...

Echocardiographic and Histological Examination of Cardiac Morphology in the Mouse

Ekokardiografiska och Histologisk undersökning av hjärtats morfologi i musen

An increasing number of genetically modified mouse models has become available in recent years. Moreover, the number of pharmacological studies performed ...

Semi-automated Analysis of Mouse Skeletal Muscle Morphology and Fiber-type Composition

Halvautomatisk analys av mus skelettmuskulaturen morfologi och Fiber-typ sammansättning

For years, distinctions between skeletal muscle fiber types were best visualized by myosin-ATPase staining. More recently, immunohistochemical staining of ...

High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay

High-throughput Nitrobenzoxadiazole-märkt kolesterol Efflux Assay

Atherosclerosis leads to cardiovascular disease (CVD). It is still unclear whether cholesterol-HDL (cHDL) concentration plays a causal role in ...

A Minimally Invasive Method for Intratracheal Instillation of Drugs in Neonatal Rodents to Treat Lung Disease

En minimalt invasiv metod för intratrakeal instillation av läkemedel hos neonatala gnagare för behandling av lungsjukdom

Treatment of neonatal rodent with drugs instilled directly into the trachea could serve as a valuable tool to study the impact of a locally administered ...

Self-Administration of Drugs in Mouse Models of Feeding and Obesity

Självadministration av droger i musmodeller av utfodring och fetma

Preclinical studies in mice often rely on invasive protocols, such as injections or oral gavage, to deliver drugs. These stressful routes of ...