Name: adherence of bacteria to plant surfaces measured in the laboratory
Uploaded: 2018-06-19T12:30:00
Duration: 7 min 7 s
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L'autore ringrazia Susan Whitfield per la preparazione delle figure e Camille Martin e Hillary Samagaio per assistenza con alcuni esperimenti.

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	<li>Heaton, J. C., Jones, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+contamination+of+fruit+and+vegetables+and+the+behaviour+of+enteropathogens+in+the+phyllosphere:+a+review.">Microbial contamination of fruit and vegetables and the behaviour of enteropathogens in the phyllosphere: a review.</a> J. Appl. Microbiol. 104, 613-626 (2008).</li><li>Beuchat, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecological+factors+influencing+survival+and+growth+of+human+pathogens+on+raw+fruit+and+vegetables.">Ecological factors influencing survival and growth of human pathogens on raw fruit and vegetables.</a> Microbes Infect. 4, 413-423 (2002).</li><li>Berger, C. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysaccharides+cellulose,+poly-beta-1,6-n-acetyl-D-glucosamine,+and+colanic+acid+are+required+for+optimal+binding+of+Escherichia+coli+O157:H7+strains+to+alfalfa+sprouts+and+K-12+strains+to+plastic+but+not+for+binding+to+epithelial+cells.">Polysaccharides cellulose, poly-beta-1,6-n-acetyl-D-glucosamine, and colanic acid are required for optimal binding of Escherichia coli O157:H7 strains to alfalfa sprouts and K-12 strains to plastic but not for binding to epithelial cells.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 2384-2390 (2008).</li><li>Matthysse, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cellulose+overproduction+on+binding+and+biofilm+formation+on+roots+by+Agrobacterium+tumefaciens.">The effect of cellulose overproduction on binding and biofilm formation on roots by Agrobacterium tumefaciens.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 18, 1002-1010 (2005).</li><li>Matthysse, A. G., Kijne, J. W., Spaink, H. P., Kondorosi, A., Hooykaas, P. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attachment+of+Rhizobiaceae+to+plant+cells.">Attachment of Rhizobiaceae to plant cells.</a> The Rhizobiaceae. , 235-249 (1998).</li><li>Matthysse, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditioned+medium+promotes+the+attachment+of+Agrobacterium+tumefaciens.strain+NT1+to+carrot+cells.">Conditioned medium promotes the attachment of Agrobacterium tumefaciens.strain NT1 to carrot cells.</a> Protoplasma. 183, 131-136 (1994).</li><li>Matthysse, A. G., McMahan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+the+Agrobacterium+tumefaciens.+attR+mutation+on+attachment+and+root+colonization+differs+between+legumes+and+other+dicots.">The effect of the Agrobacterium tumefaciens. attR mutation on attachment and root colonization differs between legumes and other dicots.</a> Appl. Environ. Microbiol. 67, 1070-1075 (2001).</li><li>Jeter, C., Matthysse, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+binding+of+diarrheagenic+strains+of+E.+coli.to+plant+surfaces+and+the+role+of+curli+in+the+interaction+of+the+bacteria+with+alfalfa+sprouts.">Characterization of the binding of diarrheagenic strains of E. coli.to plant surfaces and the role of curli in the interaction of the bacteria with alfalfa sprouts.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 18, 1235-1242 (2005).</li><li>Matthysse, A. G., McMahan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Root+colonization+by+Agrobacterium+tumefaciens+is+reduced+in+cel,+attB,+attD,+and+attR+mutants.">Root colonization by Agrobacterium tumefaciens is reduced in cel, attB, attD, and attR mutants.</a> Appl. Environ. Microbiol. 64, 2341-2345 (1998).</li><li>Morton, E. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+the+detection+and+enumeration+of+Escherichia+coli+O157:H7+on+alfalfa+seeds.">Factors influencing the detection and enumeration of Escherichia coli O157:H7 on alfalfa seeds.</a> Int. J. Food Microbiol. 71, 93-99 (2001).</li></ol>

L'autore dichiara che non ha nessun concorrenti interessi finanziari.

È importante essere consapevoli di tutte le superfici a cui i batteri possono aderire durante l'esperimento. Così i batteri che sono in grado di legarsi al vetro possono essere sottovalutati se i conteggi delle cellule vitali sono fatte utilizzando provette e pipette. Se le piante sono cresciute in agar o terreno e alcuni dell'agar o terreno rimane sulle piante i batteri possono associare il materiale aderente anziché alle piante. D'altra parte, lavare la superficie della pianta, specialmente nel caso di radici, può rimuovere rivestimenti di superficie naturali come mucose e quindi alterare i risultati delle prove di aderenza.
È importante essere certi che i batteri aggiunti alla miscela di incubazione rimangono vivi durante l'esperimento. Così i conteggi delle cellule vitali dei batteri liberi così come allegati ordinariamente dovrebbero essere fatta. Alcuni trattamenti o mutazioni batteriche possono ridurre il tasso di crescita batterica o effettivamente causare la morte di una frazione della popolazione batterica. Batteri vivi e morti non siano distinguibili nel microscopio a meno che non vengono utilizzati coloranti speciali. C'è un kit di macchia utile per live/dead batteri che dipende l'esclusione di coloranti dai batteri viventi. Tuttavia, se una popolazione mista di specie batteriche è presente quindi i conteggi delle cellule vitali delle specie di interesse rischia di essere il metodo più semplice per determinare se l'incubazione ha provocato la morte batterica.
Composizione media influenzerà la crescita e la sopravvivenza batterica. Radice dell'essudato e materiali rilasciato dalla ferita e tagliare siti fornirà il substrato per supportare la modesta crescita batterica. Fosfato, azoto e ferro tendono ad essere limitante in queste condizioni. Cationi bivalenti come calcio e magnesio possono influenzare l'adesione. In alcuni casi fonte di carbonio possa influenzare adesione. pH è anche importante. In generale il pH della rizosfera è tra 5.5 e 6.5.
È necessario prestare attenzione nell'utilizzo di batteri contrassegnati con resistenza agli antibiotico. Gli antibiotici più spesso utilizzati sono la rifampicina e acido nalidixico. Resistenza a questi antibiotici è in genere dovuta a mutazioni in geni cromosomici (RNA polimerasi e girasi, rispettivamente) e pertanto non possono essere facilmente trasferiti ad un altro ceppo durante l'incubazione. Questo tipo di resistenza anche non provocare la degradazione o la modifica dell'antibiotico. Marcatura di batteri con un plasmide-sopportate gene marcatore non è raccomandato a meno che il plasmide non può essere trasferito a qualsiasi altri batteri. La resistenza agli antibiotici non deve essere dovuto modifica degradazione o chimica dell'antibiotico come antibiotici batteri sensibili sarà quindi in grado di crescere su piastre antibiotici se essi si trovano vicino i batteri resistenti.
I metodi descritti in questa carta sono utili per campioni di piccole dimensioni e/o esperimenti dove i campioni devono essere contenuti (per esempio, esperimenti che coinvolgono agenti patogeni umani). Per campioni di grandi dimensioni (superiori a 100 g di materiale o di più di 50 piante) altri metodi o drastica modificazione di questi metodi sarebbero necessari10,19,32,19,33, 34 , 35 , 36. la presenza di un gran numero di microrganismi diversi le specie oggetto di studio può anche porre problemi significativi. Possibili soluzioni includono l'uso di batteri contrassegnato con una proteina fluorescente o la resistenza agli Antibiotico, come descritto nei passaggi 6.1.2 e 7.3. Tuttavia, quando i batteri di interesse sono rari individui in una grande popolazione di altri microrganismi questi indicatori non siano sufficienti per consentire una valutazione univoca dei numeri dei batteri in fase di studio.
Tutti i metodi descritti qui sono metodi di laboratorio di base. Modifiche minori sarebbero necessari per gli studi di serra. Altre importanti modifiche sono suscettibili di essere necessario per gli studi sul campo dove protozoi, insetti e altri animali predazione e clima variazione complicare la fornitura di condizioni definite per gli esperimenti. In futuro questi metodi possono essere estesa per includere le interazioni di due o più microrganismi sulla superficie della pianta.

La misura di associazione batterica per piantare le superfici è diventato importante in tre situazioni disparate. La prima situazione è l'esame della trasmissione di agenti patogeni umani su pianta superfici1,2,3. L'obiettivo è di impedire l'associazione batterica o di rimuovere o uccidere i batteri associati e quindi a ridurre la trasmissione della malattia da materiale vegetale. La seconda situazione è l'esame dell'associazione degli agenti patogeni della pianta per pianta superfici4. Ancora una volta l'obiettivo è di impedire l'associazione o di rimuovere o uccidere i batteri associati e quindi per ridurre la malattia. La terza situazione è l'esame dell'associazione di batteri simbiotici o pianta-growth-promoting5,6. L'obiettivo è quello di promuovere batterica vincolante e quindi di aumento di salute delle piante e delle colture produce.
Le tecniche per la misurazione associazione batterica per piantare le superfici descritte in questo articolo sono poco costoso e relativamente facile da realizzare. Gli unici requisiti sono un microscopio e materiali trovati generalmente in un laboratorio di batteriologia. Per alcune tecniche un sonicatore vasca è utile. Le tecniche descritte sono progettate per l'associazione di esperimenti condotti utilizzando campioni di relativamente piccole dimensioni. Misure di associazione sono effettuate in laboratorio, anche se potrebbe essere possibile modificare alcune di queste tecniche per l'utilizzo in serra o in campo.
Queste tecniche sono state usate per misurare l'associazione batterica a radici, germogli, foglie di taglio, taglio frutta e pomodorini intatti nel laboratorio7,8,9,10,11, 12,13,14,15. Essi sono stati utilizzati anche per misurare la colonizzazione della radice delle piante che crescono nel terreno o sabbia nel laboratorio16. Le tecniche sono state utilizzate con molte specie batteriche come Agrobacterium tumefaciens, Sinorhizobium meliloti, Escherichia coli, Salmonella enterica, Pseudomonas fluorescens. Un'utile descrizione dei metodi per valutare l'interazione di a. tumefaciens con superfici può essere trovata in Morton e Fuqua (2012)17. In tutti i casi le dimensioni del campione coinvolte erano piccole, generalmente meno di 25-50 piante. Le tecniche descritte sono adatte per l'utilizzo con agenti patogeni umani che hanno bisogno di essere tenuto confinato durante gli esperimenti.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:731px;" width="731">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:143px;">light microscope</td>
			<td style="width:164px;">any</td>
			<td style="width:125px;">N/A</td>
			<td style="width:299px;">phase contrast or Nomarski optics are helpful, for studies using fluorescent markers a fluorescence microscope is required.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:143px;">seeds</td>
			<td style="width:164px;">any&#160;</td>
			<td style="width:125px;">N/A</td>
			<td style="width:299px;">make a note of the seed lot number and the cultivar</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:143px;">bleach</td>
			<td style="width:164px;">any</td>
			<td style="width:125px;">N/A</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:143px;">bath sonicator</td>
			<td style="width:164px;">any scientific supply company</td>
			<td style="width:125px;">N/A</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:143px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:125px;">T9284</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:143px;">nutrient agar&#160;</td>
			<td style="width:164px;">Difco&#160;</td>
			<td style="width:125px;">001-01-8</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:143px;">soytone</td>
			<td style="width:164px;">Difco&#160;</td>
			<td style="width:125px;">24360</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:143px;">Sand</td>
			<td style="width:164px;">sea sand Fisher Scientific</td>
			<td style="width:125px;">S25</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:143px;">sand</td>
			<td style="width:164px;">&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:125px;">S9887</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:143px;">conetainers</td>
			<td style="width:164px;">Stuewe &#38; Sons, Inc.</td>
			<td style="width:125px;">Ray-Leach cone-tainers</td>
			<td style="width:299px;">many different sizes are available to suit the type of plant you wish to grow</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:143px;">parafilm</td>
			<td style="width:164px;">any scientific supply company</td>
			<td style="width:125px;">N/A</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:143px;">MS salts</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:125px;">M5524</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:143px;">parrafin</td>
			<td style="width:164px;">any</td>
			<td style="width:125px;">N/A</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:143px;">centrigfuge</td>
			<td style="width:164px;">any scientific company</td>
			<td style="width:125px;">N/A</td>
			<td style="width:299px;">to pellet most bacteri only a small centrifuge with a max force of 10,000 XG is needed</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:143px;">vortex mixer</td>
			<td style="width:164px;">any scientific company</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:143px;">micrometer</td>
			<td style="width:164px;">ACCU-SCOPE Accessories</td>
			<td style="width:125px;">A3145</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:143px;">Sedgwick-rafter counting cell</td>
			<td style="width:164px;">Hauser Scientific</td>
			<td style="width:125px;">HS3800</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:143px;">probe-clip press-seal incubatin chamber</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:125px;">Z359483</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:143px;">rifampicin</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:125px;">R3501</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:143px;">naladixic acid</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:125px;">n8878</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:143px;">Live/dead stain</td>
			<td style="width:164px;">In Vitrogen Molecular Bioprobes</td>
			<td style="width:125px;">L7007</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adherence of bacteria to plant surfaces measured in the laboratory

Questo manoscritto descrive un metodo per misurare l'associazione batterica alle superfici axeniche pianta al microscopio ottico e attraverso l'utilizzo di conteggi delle cellule vitali. Materiali vegetali utilizzati includono radici, germogli, foglie e tagliare la frutta. I metodi descritti sono poco costoso, facile e adatto per campioni di piccole dimensioni. Il legame è misurato in laboratorio e una varietà di media di incubazione e condizioni può essere utilizzata. L'effetto degli inibitori può essere determinato. Possono essere valutati anche situazioni che promuovono e inibiscono il grippaggio. In alcuni casi è possibile distinguere se varie condizioni alterano associazione principalmente dovuto i loro effetti sulla pianta o sui batteri.

A. tumefaciens colonizza superfici radicolari. Al fine di determinare se la produzione batterica di cellulosa svolge un ruolo nella colonizzazione della radice, gli effetti delle mutazioni batteriche che impediscono la sintesi di cellulosa sono stati esaminati16. Le tecniche descritte nei passaggi 1.3 e 7.1 sono state usate. Semi di pomodoro erano superficie sterilizzato e germinati in acqua sterile. Quando le radici erano lunghi circa 2 cm erano immersi in una sospensione di 105 batteri / mL e piantati nel terreno pastorizzato in contenitori. Le piante sono state coltivate per 14 giorni a 25 ° C su un ciclo di 12 h luce/12 h scuro. Dopo l'indicato volte le piante sono stati rimossi dai contenitori. Le radici sono state lavate e sonicate in un sonicatore vasca per rimuovere i batteri associati. Numeri batterici sono stati determinati utilizzando i conteggi delle cellule vitali. La figura 2 Mostra l'effetto di due mutazioni differenti di cellulosa-meno la capacità dei batteri di colonizzare le radici di pomodoro. Anche se le deviazioni standard di alcune misurazioni erano alti come 0,9 log10 (un problema comune con questo tipo di misura) la riduzione nell'associazione dei mutanti cellulosa-meno è chiaramente evidente e possiamo concludere che la produzione batterica di cellulosa aiuta i batteri nella colonizzazione delle radici di pomodoro.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56599/56599fig2.jpg"> Figura 2 : Root colonizzazione da wild-type e mutanti di cellulosa-meno di a. tumefaciens. Numero totale di log10 dei batteri per cm lunghezza della radice ha recuperato dalle radici di pomodoro inoculati con wild-type a. tumefaciens strain C58 e mutanti di cellulosa-meno C58:1 e C58:A60. I numeri indicati sono il mezzo da un minimo di quattro esperimenti separati. Le barre indicano le deviazioni standard dei mezzi. Le radici sono state inoculate immergendoli in una sospensione di 105 batteri / mL per un minuto. Le piante sono state coltivate in contenitori e i batteri senza bloccare aderenti sono stati rimossi lavando le radici in buffer in un flaconcino di vetro di lavaggio. Strettamente aderenti batteri sono stati rimossi usando un sonicatore vasca e la sospensione risultante placcato per determinare cellule vitali conta16. Questa figura è stata modificata da Matthysse e McMahan. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56599/56599fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Il ruolo di esopolisaccaridi nell'associazione di e. coli e altri batteri di germogli di erba medica è stato esaminato. Alcuni focolai di malattia diarroica dovuto Escherichia coli O157: H7 sono stati rintracciati a germogli contaminati. Associazione dei batteri wild type e mutanti in grado di fare vari esopolisaccaridi è stata misurata utilizzando i metodi descritti ai punti 1.1, 5.1 e 7.2. Germogli di erba medica sono stati superficie sterilizzato e germinato per un giorno in acqua sterile a 25 ° C al buio. Quattro germogli con annesso tegumenti sono stati collocati in piatti di plastica sterili contenente 5 mL di acqua. I batteri cresciuti in brodo di Luria sono stati aggiunti a una concentrazione finale di circa 5 x 103 millilitri. I germogli inoculati sono stati incubati a 25 ° C al buio per 3 giorni. I germogli sono stati lavati due volte in 5 mL di acqua sterile in un flaconcino di vigorosa inversione e omogeneizzati in buffer utilizzando un omogeneizzatore di vetro Teflon a motore di lavaggio. Precedenti esperimenti utilizzando batteri contrassegnato con un plasmide che trasporta il gene GFP ha mostrato nessun batteri interiorizzato anche batteri dalla superficie facilmente sono stati osservati. I risultati sono mostrati nella tabella 1. Sono stati esaminati due ceppi di e. coli O157: H7. In entrambe le razze la produzione di acid(PGA) Poli-β-1,6-glucuronico è apparso per rendere il più grande contributo all'associazione di patogeni di Escherichia coli per piantare le superfici. Acido colico ha anche svolto un ruolo significativo nell'associazione. Mentre la riduzione nell'associazione in cellulosa-minus mutanti era significativa non era grande come quella per gli altri due polisaccaridi.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">Effetti delle mutazioni nei geni di produzione di esopolisaccaridi sull'associazione di E. coli O157: H7 per germogli e aperti tegumenti</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Ceppo batterico</td>
			<td rowspan="2">Mutazione o genotipo (fenotipo pertinente)</td>
			<td colspan="2">10 numero di batteri associati al germoglio o tegumento log</td>
		</tr>
<tr>
<td>Germogli di erba medicab
</td>
			<td>Aperti tegumenti</td>
		</tr>
<tr>
<td>86-24</td>
			<td>Nessuno (wild type)</td>
			<td>4,7 ± 0.6</td>
			<td>5,6 ± 0,2</td>
		</tr>
<tr>
<td>8624N</td>
			<td>
yhjN (cellulosa-minus)</td>
			<td>2,9 ± 0,7c
</td>
			<td>3,5 ± 0.6c
</td>
		</tr>
<tr>
<td>8624C</td>
			<td>
wcaD (meno acido colico)</td>
			<td>1,8 ± 0,7c
</td>
			<td>2.4 ± 0.5c
</td>
		</tr>
<tr>
<td>8624P</td>
			<td>
pgaC (PGA-minus)</td>
			<td>< 1.0c
</td>
			<td>1,0 ± 1.0c
</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4A</td>
			<td>Nessuno (wild type)</td>
			<td>5,6 ± 0,2</td>
			<td>6,1 ± 0,3</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4AN</td>
			<td>
yhjN (cellulosa-minus)</td>
			<td>4,8 ± 0,8d
</td>
			<td>4,1 ± 0,8d
</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4AC</td>
			<td>
wcaD (meno acido colico)</td>
			<td>3,9 ± 0.5c
</td>
			<td>4,8 ± 0,8d
</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4AP</td>
			<td>
pgaC (PGA-minus)</td>
			<td>< 1.0c
</td>
			<td>1,2 ± 0,7c
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">media ± deviazione standard di un minimo di tre misure del numero (registro10) di batteri associati dopo 3 giorni.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Germogli di b sono stati lavati prima misurazione.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">c significativamente differenti dal wild type: P < 0.01.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">d significativamente differenti dal wild type: P < 0.05.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Questa tabella è stata modificata da Matthysse, Deora, Mishra e Torres10.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: effetti delle mutazioni nei geni di produzione di esopolisaccaridi sul legame di Escherichia coli O157: H7 per germogli. Al fine di determinare il ruolo delle varie esopolisaccaridi e lipopolisaccaride nell'associazione di patogeni Escherichia coli O157: H7 ceppi di germogli di erba medica, l'associazione di un insieme di mutanti per i germogli e aperti tegumenti è stato esaminato usando i metodi descritto nel passaggio 6. I risultati hanno mostrato che poli-ß-1, 6 -N-acetil-D-glucosamina (PGA) sembra essere essenziale per l'associazione di germogli e che l'acido sia cellulosa e colanic sono necessari per legame massimo di e. coli O157. Questa tabella è stata modificata da Matthysse, Deora, Mishra e Torres10.
Al fine di determinare se la produzione di PGA è sufficiente per causare associazione batterica piantare le superfici, un plasmide (pMM11) che trasportano l'operone clonato codifica i geni richiesti per PGA produzione è stato introdotto in due diversi tipi di batteri che non normalmente essere in grado di legarsi al pomodoro radici10. A. tumefaciens A1045 è un mutante del ceppo selvaggio tipo C58 che non riesce a rendere ciclico-β-1,2 glucano e inoltre non riesce ad associare a piantare superfici29. Sinorhizobium meliloti 1021 che forma noduli radice su erba medica non riesce ad associare ai non-legumi tra cui pomodoro12. Le tecniche descritte nei passaggi 1.1, 5.1, 6.3 e 7.1 sono state utilizzate per determinare se la capacità di fare PGA generalmente aumentato associazione batterica a superfici radicolari. Semi di pomodoro erano superficie sterilizzato e germinati in acqua sterile. Le radici sono state tagliate in segmenti di 1 cm di lunghezza e disposto in acqua sterile e i batteri sono stati inoculati. Come queste due specie di batteri crescono a ritmi diversi, associazione è stata misurata in momenti diversi per consentire all'incirca uguali quantità di crescita batterica. La presenza del plasmide pMM11 causato un simile aumento significativo del numero di batteri associati di entrambi di specie (tabella 2)10. Un aumento significativo nell'associazione è stato anche visto al microscopio ottico, ma l'associazione è stata molto diversa per le due specie (Figura 3). A. tumefaciens A1045 associato come singoli batteri per la superficie della radice. S. meliloti rilegato in cluster di grandi dimensioni in cui solo alcuni dei batteri fossero collegati direttamente alla radice e la maggior parte dei batteri sono stata fissata ad altri batteri. Questo esempio mostra che semplicemente analizzando il numero di batteri associati senza includere le osservazioni al microscopio può dare un'impressione ingannevole dei risultati di un esperimento. Sebbene entrambi i metodi (conta delle cellule vitali e osservazioni al microscopio) mostrano che pMM11 aumentato associazione batterica alle radici di pomodoro, il tipo di associazione causato dalla produzione di PGA era differente per le due specie batteriche10.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="3">L'effetto del plasmide pMM11 sui Binding dei batteri alle radici di pomodoro</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ceppo batterico</td>
			<td>Plasmide</td>
			<td>Numero di batteri associata a lunghezza della radice mm</td>
		</tr>
<tr>
<td>A. tumefaciens A1045un
</td>
			<td>nessuno</td>
			<td>0,25 x 103 ± 0.25 x 103
</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pBBR1mcs (vettore)</td>
			<td>0,25 x 103 ± 0.25 x 103
</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pMM11 (sintesi di PGA)</td>
			<td>10 x 103 ± 0.25 x 103
</td>
		</tr>
<tr>
<td>S. meliloti 1021b
</td>
			<td>nessuno</td>
			<td>nessuno rilevato</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pBBR1mcs (vettore)</td>
			<td>nessuno rilevato</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pMM11 (sintesi di PGA)</td>
			<td>50 x 103 ± 5 x 103
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">un'associazione batterica è stata misurata dopo 2 ore</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">b Associazione batterica era misura dopo 18 ore</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">Questa tabella è stata modificata da Matthysse, Deora, Mishra e Torres10.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2: l'effetto di un plasmide portatori di geni per la sintesi di PGA sul legame di A. tumefaciens A1045 e S. meliloti 1021 a segmenti di radice di pomodoro. Al fine di esaminare la possibilità di poli-ß-1, 6 -N-acetil-D-glucosamina (PGA) per promuovere l'associazione di batteri per piantare radici, l'effetto di un plasmide che attribuisce la capacità di fare PGA (pMM11) l'associazione di due ceppi di batteri pianta-collegato a radici di pomodoro è stato esaminato. Nessun ceppo di batteri ha mostrato significativa associazione alle radici di pomodoro in assenza del plasmide o in presenza del plasmide senza i geni che codificano la sintesi di PGA (pBBR1mcs). L'aggiunta del plasmide portatori di geni di sintesi PGA aumentato associazione di entrambi i tipi di batteri. Perché a. tumefaciens cresce più velocemente di quanto S. meliloti associazione è stata misurata dopo 2 h di incubazione per a. tumefaciens e dopo 18 h per S. meliloti. Le tecniche utilizzate sono quelle descritte nel passaggio 7. Questa tabella è stata modificata da Matthysse, Deora, Mishra e Torres10.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56599/56599fig3.jpg"> Figura 3 : L'effetto del pMM11 di plasmidi che trasportano i geni di biosintesi di PGA sul legame di a. tumefaciens A1045 e S. meliloti 1021 di peli radicali pomodoro. Associazione di pomodoro di peli radicali della A) a. tumefaciens A1045, B) a. tumefaciens A1045 pMM11, C) S. meliloti 1021 e D) S. meliloti 1021 pMM11. Anche se l'aumento nell'associazione delle due specie batteriche è approssimativamente simile i dettagli dell'associazione come visto al microscopio ottico sono molto diversi. Le tecniche utilizzate sono quelle descritte nel passaggio 6. Questa figura è stata modificata da Matthysse, Deora, Mishra e Torres10. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56599/56599fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
A volte è possibile utilizzare l'associazione per le superfici non-biologici per aiutare a distinguere il contributo dei batteri e della pianta in un'interazione specifica. Il polysaccharide(UPP) unipolare di a. tumefaciens ha dimostrato di essere in grado di mediare associazione batterica ad una varietà di entrambe le superfici biologiche e non biologiche30. Calcio è stato osservato per inibire il legame di a. tumefaciens piantare superfici mediate dal UPP28. Al fine di determinare se l'inibizione di ioni del calcio di associazione batterica per piantare le superfici è dovuta ad un effetto sui batteri o sulla superficie della pianta, l'associazione dei batteri a fili di nylon è stata esaminata. Le tecniche vengono descritti nel passaggio 8.2 sono stati usati. Semi di pomodoro erano superficie sterilizzato e germinati in acqua come descritto nel passaggio 1. I batteri sono stati coltivati in terreno minimo con saccarosio e aggiunto al pomodoro radici o fili di nylon ad una concentrazione finale di circa 105/ml come descritto al punto 5.1. L'effetto di aggiunta CaCl2 sull'associazione batterica alle radici di pomodoro e fili di nylon è stato esaminato al microscopio. La figura 4 Mostra una simile inibizione di associazione di calcio utilizzando sia superficiale, suggerendo che l'effetto di calcio è principalmente sui batteri10.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56599/56599fig4.jpg"> Figura 4 : L'effetto di calcio sul legame di a. tumefaciens al pomodoro di peli radicali e fili di nylon. A. tumefaciens è stato incubato con radici di pomodoro (A e B) o fili di nylon (C e D) per 24 h in un 01:10 diluizione di MS sali e un 01:20 diluizione di terreno minimo di AB, 0,4% di saccarosio (A e C) o in un 01:10 diluizione di MS sali e 01:20 diluizione del terreno minimo AB , 0,4% saccarosio contenente 60 mM CaCl2 (B e D)31. L'aggiunta di CaCl2 ha inibito il grippaggio batterica sia radici e fili di nylon, suggerendo che l'inibizione era principalmente a causa di un effetto sui batteri piuttosto che sulla superficie della pianta. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56599/56599fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory

Un metodo semplice per la misurazione e la caratterizzazione di adesione batterica alle piante, in particolare radici e germogli, è descritto in questo articolo.

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