Name: method for labeling transcripts in individual escherichia coli cells for single-molecule fluorescence in situ hybridization experiments
Uploaded: 2017-12-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch eine Israel Science Foundation Stipendium 514415 (j.s.) und eine BSF-NSF (MCB) Stipendium 2016707 (j.s.) unterstützt. Unterstützung von einem Siegfried und Irma Ullman Lehrstuhl (, j.s.) auch anerkannt wird.

1. Probe Design
Hinweis: Dieses Protokoll verwendet handelsübliche Oligonukleotid Sonden bereits mit dem Stichwort Fluorophore. Die Sonden bestehen aus einer Reihe von spezifischen Sequenzen komplementär zu einem Ziel mRNA, jede Sonde, fluoreszierendes Molekül konjugiert wird. Alternativ ist es möglich, Sonden, fluoreszierenden Marker beimessen, wie an anderer Stelle beschrieben,5,16.
<ol>
	<li>Design SmFISH Sonden mit Hilfe der ...

<ol>
	<li>Tsimring, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+in+biology.">Noise in biology.</a> Reports Prog. Phys. 77 (2), 26601 (2014).</li><li>Arbel-Goren, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript+degradation+and+noise+of+small+RNA-controlled+genes+in+a+switch+activated+network+in+Escherichia+coli.">Transcript degradation and noise of small RNA-controlled genes in a switch activated network in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Res. 44 (14), 6707-6720 (2016).</li><li>Arbel-Goren, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+post-transcriptional+regulation+on+phenotypic+noise+in+Escherichia+coli.">Effects of post-transcriptional regulation on phenotypic noise in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Res. 41 (9), 4825-4834 (2013).</li><li>van Gijtenbeek, L. A., Robinson, A., van Oijen, A. M., Poolman, B., Kok, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Spatial+Organization+of+mRNA,+Plasmids,+and+Ribosomes+in+a+Bacterial+Host+Overexpressing+Membrane+Proteins.">On the Spatial Organization of mRNA, Plasmids, and Ribosomes in a Bacterial Host Overexpressing Membrane Proteins.</a> PLOS Genet. 12 (12), e1006523 (2016).</li><li>Raj, A., vanden Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes.">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nat. Methods. 5 (10), 877-879 (2008).</li><li>Raj, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+individual+endogenous+RNA+transcripts+in+situ+using+multiple+singly+labeled+probes.">Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes.</a> Methods Enzymol. 472 (10), (2010).</li><li>Skinner, S. O., La Sep&#250;lveda, ., Xu, H., Golding, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mRNA+copy+number+in+individual+Escherichia+coli+cells+using+single-molecule+fluorescent+in+situ+hybridization.">Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using single-molecule fluorescent in situ hybridization.</a> Nat. Protoc. 8 (6), 1100-1113 (2013).</li><li>Barakat, T. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+kinetics+of+gene+activity+in+individual+bacteria.">Real-time kinetics of gene activity in individual bacteria.</a> Cell. 123 (6), 1025-1036 (2005).</li><li>Golding, I., Cox, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+8+Spatiotemporal+Dynamics+in+Bacterial+Cells:+Real-Time+Studies+with+Single-Event+Resolution.">Chapter 8 Spatiotemporal Dynamics in Bacterial Cells: Real-Time Studies with Single-Event Resolution.</a> Methods Cell Biol. 89 (8), (2008).</li><li>So, L. H., Ghosh, A., Zong, C., Sepulveda, L. A., Segev, R., Golding, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+properties+of+transcriptional+time+series+in+Escherichia+coli.">General properties of transcriptional time series in Escherichia coli.</a> Nat. Genet. 43 (6), 554-560 (2011).</li><li>Spahn, C., Endesfelder, U., Heilemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+imaging+of+Escherichia+coli+nucleoids+reveals+highly+structured+and+asymmetric+segregation+during+fast+growth.">Super-resolution imaging of Escherichia coli nucleoids reveals highly structured and asymmetric segregation during fast growth.</a> J. Struct. Biol. 185 (3), 243-249 (2014).</li><li>Sliusarenko, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbetracker+software.">Microbetracker software.</a> Mol Microbiol. 80 (3), 612-627 (2012).</li><li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame,+single-gene+knockout+mutants:+the+Keio+collection.">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Mol. Syst. Biol. 2, 8 (2006).</li><li>Arbel-Goren, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript+degradation+and+noise+of+small+RNA-controlled+genes+in+a+switch+activated+network+in+Escherichia+coli.">Transcript degradation and noise of small RNA-controlled genes in a switch activated network in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Res. 44 (14), 6707-6720 (2016).</li><li>Brandt, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-state+stabilization-change+mechanism+for+proton-pumping+complex+I.">A two-state stabilization-change mechanism for proton-pumping complex I.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1807 (10), 1364-1369 (2011).</li></ol>

Wir haben in unserem Labor die Abschrift Anzahl verschiedener Gene in E. Coli Zellen mittels der SmFISH Methode2gemessen. Kurz gesagt, dieses Verfahren besteht aus den folgenden Schritten: Zelle Fixierung, Permeabilisierung der Membranen für Sonde eindringen ermöglichen Sonde Hybridisierung und Bildgebung mit einem standard Fluoreszenzmikroskop zu probieren. Dieses Verfahren beruht auf früher veröffentlichte, mit einigen Modifikationen6,<sup class="x...

SCND ist ein grundlegender und unvermeidbare Aspekt der Genexpression und gibt Anlass zu Zellezelle Heterogenität1, sowohl auf der Ebene der Transkripte und Proteine,2,3. Quantifizierung der Variabilität zwischen den Zellen unter genau definierten Bedingungen bietet ein einzigartiges Fenster in die grundlegenden Prozesse, die Genexpression und seine Verordnung zugrunde liegen. Eine wichtige Quelle von Zell-Zell-Heterogenität in Bakterien erfolgt auf transkriptioneller Ebene. Transkript Zahlen variieren nicht nur durch SCND der Transkription, aber auch posttranskriptionale Prozesse wie Verordnung durch kleine RNAs und RNAases2. Eine Möglichkeit der direkten Zugriff auf diese Heterogenität quantitativ ist durch das Eindringmittel markieren einzelner Protokolle eines bestimmten Gens in SmFISH. Diese Methodik ermöglicht die Erkennung und subzelluläre Lokalisierung von bestimmten RNA-Moleküle in fix, einzelne bakterielle Zellen4. mRNAs sind mit einer Reihe von Eindringmittel beschriftet ~ 20 Basis-lange Oligonukleotide hybridisiert, die entworfen sind, um selektiv binden, Abschriften von Interesse5,6. Erkennung über Hintergrundfluoreszenz gewährleistet mehrere Kennzeichnung und einzelner mRNA-Moleküle erscheinen als Beugung begrenzte Flecken unter einem Fluoreszenz-Mikroskop7 (Siehe Abbildung 1). Es gibt weitere Ansätze für die Kennzeichnung von mRNA-Moleküle, in denen die ergänzenden Oligomer-Sonden konjugierte Haptens (z.B., Biotin oder Digoxigenin) tragen, die mit sekundären Eindringmittel beschriftet Reporter Techniken8erkannt werden.
Es gibt andere Methoden, die quantitative Informationen über Transkripte, neben SmFISH. Einige, wie die Northern blot oder quantitative PCR, Sonde die Masse und damit weder die Anzahl der Kopien der mRNA noch ihre Position in den einzelnen Zellen messen können. Diese Methoden eignen sich daher nicht zur Quantifizierung von Zelle zu Zelle Variabilität. Eine aktuelle Image-basierte Technik, die erlaubt die Quantifizierung der Kopienzahl des RNAs in den Zellen sowie deren intrazelluläre Ort namens gemultiplext Fehler-robuste Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (MERFISHS) wurde entwickelt. MERFISHS basiert auf der Zuordnung der einen eindeutigen Barcode, bestehend aus einer definierten Kombination aus einer festen Anzahl von Eindringmittel-markierten Oligonukleotid Sonden. Diese Barcodes werden in sequentiellen runden SmFISH Messungen ausgelesen, mit Immunofluoreszenz Runde nach jedem der Hybridisierung, dadurch Erhöhung des Durchsatzes um zwei Größenordnungen9,10. Diese Technik erfordert eine automatisierte Fluid handling System und die richtige Gestaltung der eingestellten Sonde.
Die Kombination von mehreren Fluoreszenz Kennzeichnung der einzelnen Transkripte, zusammen mit neuartigen Höchstauflösung Techniken wie stochastische optische Rekonstruktion Mikroskopie (Sturm)11, ermöglicht eine zehnfache Erhöhung der Auflösung in der subzelluläre Lokalisation der Transkripte. Im Sturm kann eine geeignete Kombination von fluoreszierenden Sonden und bildgebenden Puffer für mehrere Zyklen der Fluoreszenzemission pro Sondenmolekül (blinkend). Sturm kann auch verwendet werden, Bild E. Coli Transkriptoms und Genom-weite räumliche Organisation der RNA, indem Sie gleichzeitig alle Transkripte von Interesse12beschriften zu beobachten.
Die einzelligen Methoden überprüft oben basieren auf imaging-Transkripte in festen Zellen. Daher bieten sie keine Informationen bezüglich der kinetischen Eigenschaften der Transkripte in den Zellen. Transkripte in lebenden Zellen13folgen, können die mRNAs durch die Fusion des Gens von Interesse auf ein Array von Bindungsstellen beschriftet werden. Letztere werden dann durch eine RNA-bindende Protein, wie den Bakteriophagen MS2 Hüllprotein, die zu einem fluoreszierenden Protein wie das grün fluoreszierende Protein (GFP)10,14,15verschmolzen ist erkannt.
Hier beschreiben wir eine Methode zur Kennzeichnung einzelner mRNAs mit einer Reihe von Eindringmittel-markierten DNA-Sonden für SmFISH Experimente, insbesondere in E. Coli. Darüber hinaus zeigen wir, dass die gleiche Kennzeichnung Schema für Sturm Messungen mit geringfügigen Modifikationen verwendet werden kann.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Dextran sulfate sodium salt</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >D8906</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pure Ethanol, 99.5%, ACS reagent, absolute</td>
			<td >Mallinckrodt Baker - Avantor</td>
			<td >8025.25</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Diethylpyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >D5758</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RNase-free 20X SSC</td>
			<td >Life Technologies/Ambion</td>
			<td >AM9763</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RNase-free 10X PBS</td>
			<td >Life Technologies/Ambion</td>
			<td >AM9625</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) BioUltra, for molecular biology</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >93283</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >nuclease-free water</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >10977035</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Formaldehyde solution for molecular biology, 36.5-38% in water</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >F8775</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Deionized formamide, nuclease free</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific/Ambion</td>
			<td >AM9342</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >E. coli tRNA (ribonucleic acid, transfer type xx from escherichia)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >R1753-500UN</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >UltraPure BSA (50mg/ml)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific/Ambion</td>
			<td >AM2616</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vanadyl-ribonucleoside complex,VRC, 200 mM</td>
			<td >New England Biolab</td>
			<td >S1402S</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td >P4707</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cysteamine and oxygen</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >30070</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glucose Oxidase from Aspergillus niger, Type VII, 50KU</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >G2133</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Catalase</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >C40</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >D-glucose</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >G8270</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >D-fucose</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >F8150</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vybrant DiO Cell-Labeling Solution</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >V2286</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Agarose,low melting reagent</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A9414</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adhesive silicone isolator 24-2mm Dia. X 1.8 mm depth JTR24R-A2-2.0</td>
			<td >Grace Bio-Labs</td>
			<td >JTR24R-A2-2.0 666208</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >poly-D-lysine-coated glass bottom Glass Bottom Culture Dishes</td>
			<td >MatTek Corporation</td>
			<td >P35GC-1.5-14-C</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Super life nitrile powder free examination gloves</td>
			<td >Supermax</td>
			<td >TC-N-9889</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Brand sterilization incubator tape</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >BR61750</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microcentrifuge tubes (1.8 ml)</td>
			<td >Axygen - Corning Life Sciences</td>
			<td >MCT-175C</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Falcon round-bottom polypropylene tubes (14 ml)</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >352059</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Conical-bottom centrifuge polypropylene tubes (50 ml)</td>
			<td >Corning</td>
			<td >430828</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Serological pipettes (Corning 5 ml)</td>
			<td >Corning Life Sciences</td>
			<td >4051</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Serological pipettes (Corning 10 ml)</td>
			<td >Corning Life Sciences</td>
			<td >4488</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Serological pipettes (Corning 25 ml)</td>
			<td >Corning Life Sciences</td>
			<td >4251</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Spectrophotometer cuvettes</td>
			<td >Sarstedt</td>
			<td >67.742</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RNase-free pipette tips 0.2 - 20 &#956;l</td>
			<td >FroggaBio</td>
			<td >FT20</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RNase-free pipette tips 10 - 200 &#956;l</td>
			<td >Axigene/corning</td>
			<td >TF-200</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RNase-free pipette tips 100 - 1000 &#956;l</td>
			<td >FroggaBio</td>
			<td >FT1000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RNase-free pipette tips 100 - 1000 &#956;l</td>
			<td>Sorenson</td>
			<td >14200</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Syringe disposile 10 mL needle G-21</td>
			<td>Becton Dickinson, Biosciences</td>
			<td >BD-309643</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Minisart 0.2 um Syringe Filter</td>
			<td >Sartorius</td>
			<td >16534 K</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nikon instruments microscope type A immersion oil A, 8cc</td>
			<td >Nikon</td>
			<td >MXA20233</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope slides 76 x26, 3&#34;x1&#34;x1mm</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >421-004ET</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >#0 coverslip slide 24x60</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific/Menzel</td>
			<td >BNBB024060A0</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Orbital shaker</td>
			<td >M.R.C</td>
			<td >TOU-50</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hot block</td>
			<td >M.R.C</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vortex</td>
			<td >Fried Electric Company</td>
			<td >G-560-E</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microcentrifuge</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >5427R</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >5810R</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Portable Pipet-Aid XP2, Pipette Controller</td>
			<td >Drummond Scientific Company</td>
			<td >4-000-501-I</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >OD600 Spectrophotometer for Bacterial Growth Rates DiluPhotometer</td>
			<td >Midsci</td>
			<td >OD600-10</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >iXon X3 EMCCD camera</td>
			<td >Andor</td>
			<td >DU-897E-CS0-#BV</td>
			<td > </td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eclipse Ti microscope</td>
			<td >Nikon</td>
			<td >MEA53100</td>
			<td > </td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CFI plan apochromat DM 100X oil objective lambda PH-3 N.A 1.45 WD 0.13</td>
			<td >Nikon</td>
			<td >MRD31905</td>
			<td > </td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filter set (TRITC/CY3): EX - ET545/30X; EM - ET620/60M; BS - T570LP</td>
			<td >Nikon</td>
			<td >49005</td>
			<td > </td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filter set (CY5): EX - ET640/30X; EM - ET690/50M; BS - T660P</td>
			<td >Nikon</td>
			<td >49009</td>
			<td > </td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nis-elements AR auto reaserch software</td>
			<td >Nikon</td>
			<td >MQS31000</td>
			<td > </td>
		</tr>
		<tr >
			<td >STORM microscope</td>
			<td >Vutara</td>
			<td >SR-200</td>
			<td > </td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NA 1.2 water immersion objective </td>
			<td >Olympus</td>
			<td > </td>
			<td > </td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SRX image acquisition and analysis software</td>
			<td >Vutara</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Evolve 512 EMCCD camera</td>
			<td >Photometrics</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stellaris&#174; FISH Probes, Custom Assay with CAL Fluor&#174; Red 590 Dye</td>
			<td >Biosearch Technologies Inc</td>
			<td >SMF-1083-5</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Probe Sequence for galK mRNA:</td>
			<td > </td>
			<td > </td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >gtgttttttctttcagactc</td>
			<td > </td>
			<td > </td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >tagccaaatgcgttggcaaa</td>
			<td > </td>
			<td > </td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ctgaatggtgtgagtggcag</td>
			<td > </td>
			<td > </td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >caccaatcaaattcacgcgg</td>
			<td > </td>
			<td > </td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >acgaaaccgtcgttgtagtc</td>
			<td > </td>
			<td > </td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >tgataatcaatcgcgcaggg</td>
			<td > </td>
			<td > </td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >gtggtgcacaactgatcacg</td>
			<td > </td>
			<td > </td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
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method for labeling transcripts in individual escherichia coli cells for single-molecule fluorescence in situ hybridization experiments

Eine Methode wird zur Kennzeichnung einzelner Boten-RNA (mRNA) Transkripte in festen Bakterien für den Einsatz in Einzelmolekül-Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (SmFISH) Experimente in E. Colibeschrieben. SmFISH ermöglicht die Messung von Zelle zu Zelle Variabilität mRNA Kopie Zahl der Gene von Interesse, sowie die subzelluläre Lage der Transkripte. Die wichtigsten Schritte sind Fixierung der Bakterienzelle Kultur, Permeabilisierung von Zellmembranen und Hybridisierung der Ziel-Abschriften mit Sätzen von im Handel erhältlichen kurzen Eindringmittel beschriftet Oligonukleotid Sonden. SmFISH können die Bildgebung der Abschriften von mehreren Genen in der gleichen Zelle mit Beschränkungen durch die spektrale Überlappung zwischen verschiedenen fluoreszierenden Marker. Nach Abschluss des Protokolls unten dargestellt können Zellen leicht unter Verwendung eines Mikroskops, gekoppelt mit einer Kamera geeignet für niedrigen Fluoreszenz abgebildet werden. Diese Bilder, zusammen mit der Zelle Konturen aus Segmentierung der Phase Kontrast Frames oder dem Zellmembran beflecken, erlauben die Berechnung der mRNA Kopie Nummer Verteilung einer Stichprobe von Zellen unter Verwendung von Open-Source oder individuell geschriebenen Software. Die hier beschriebene Kennzeichnung Methode kann auch auf Bild-Protokolle mit stochastischen optische Rekonstruktion Mikroskopie (Sturm) angewendet werden.

Wir durchgeführt, SmFISH Messungen der GalK und SodB Transkripte in E. Coli Zellen. Die Transkripte wurden mit einer Reihe von spezifischen Sequenzen ergänzen die Zielsequenz, jede Sonde wird konjugiert, fluoreszierendes Molekül hybridisiert (siehe Tabelle der Materialien). Fluoreszenz und Phase Kontrast Bilder von Wildtyp-MG1655 E. Coli -Stamm (WT) oder eine JW0740 (Keio Sammlung)19 GalK gelöscht Belastung (ΔGalK) ausgesetzt waren, ...

Watch this Scientific Journal Video about Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments at JoVE.com

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

Methode zur Kennzeichnung Transkripte in einzelnen Escherichia coli Zellen für Einzelmolekül-Fluoreszenz In Situ Hybridisierung Experimente

Dieses Manuskript beschreibt ein Verfahren zur Kennzeichnung einzelner Boten-RNA (mRNA) Abschriften mit Fluoreszent-markierten DNA-Sonden für den Einsatz in Einzelmolekül-Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (SmFISH) Experimente in E. Coli. SmFISH ist eine Visualisierungsmethode, die erlaubt die simultane Detektion, Lokalisierung und Quantifizierung der einzelnen mRNA-Moleküle in festen Einzelzellen.

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ ...

Research

JoVE Journal

Biology

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

Doppel Whole Mount in situ Hybridisierung von Anfang Hühnerembryonen

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Forschung

Biologie

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

Fluoreszenz In situ Hybridisierung (FISH)-Protokoll in menschlichen Spermien

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules

Automated System für Single Molecule Fluorescence Messungen der Oberflächen-immobilisierten Biomoleküle

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, ...

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

In-situ-Hybridisierung für die genaue Lokalisierung der Transkripte in Pflanzen

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

Nachweis viraler RNA durch Fluoreszenz<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualisierung und Analyse von mRNA Moleküle mittels Fluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

MicroRNA<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung für Formalin fixiert Nierengewebe

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Erkennung von Live-<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: H7-Zellen durch PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Profiling Individuelle humanen embryonalen Stammzellen durch quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Einfache Methode zur Fluoreszenz DNA<em&gt; In-situ-</em&gt; Die Hybridisierung an Squashed Chromosomen

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...